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Coltura e conta di batteri da campioni di suolo

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Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.14: Bacterial Growth Curve Analysis and its Environmental Applications

183,663 Views

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10:57 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba – Università dell’Arizona
Autori dimostrativi: Bradley Schmitz e Luisa Ikner

I terreni superficiali sono una miscela eterogenea di particelle inorganiche e organiche che si combinano insieme per formare aggregati secondari. All’interno e tra gli aggregati ci sono vuoti o pori che contengono visivamente sia aria che acqua. Queste condizioni creano un ecosistema ideale per i batteri, quindi tutti i terreni contengono vaste popolazioni di batteri, di solito oltre 1 milione per grammo di suolo.

I batteri sono il più semplice dei microrganismi, noti come procarioti. All’interno di questo gruppo procariotico, ci sono i microbi filamentosi noti come actinomiceti. Gli actinomiceti sono in realtà batteri, ma sono spesso considerati un gruppo unico all’interno della classificazione dei batteri a causa della loro struttura filamentosa, che consiste in più cellule infilate insieme per formare ife. Questo esperimento utilizza i mezzi del glicerolo che selezionano le colonie di actinomiceti, durante la diluizione e la placcatura. Tipicamente, gli actinomiceti sono circa il 10% della popolazione batterica totale. Batteri e actinomiceti si trovano in ogni ambiente sulla Terra, ma l’abbondanza e la diversità di questi microbi nel suolo non ha eguali. Questi microbi sono anche essenziali per la vita umana e influenzano ciò che le persone mangiano, bevono, respirano o toccano. Inoltre, ci sono specie batteriche che possono infettare le persone e causare malattie, e ci sono batteri che possono produrre prodotti naturali in grado di guarire le persone. Gli actinomiceti sono particolarmente importanti per la produzione di antibiotici, come la streptomicina. I batteri sono fondamentali per il ciclo dei nutrienti, la crescita delle piante e la degradazione dei contaminanti organici.

I batteri sono molto diversi in termini di numero di specie che si possono trovare nel suolo, in parte perché sono fisiologicamente e metabolicamente diversi. I batteri possono essere eterotrofici, il che significa che utilizzano composti organici, come il glucosio, per il cibo e l’energia, o autotrofici, il che significa che utilizzano composti inorganici, come lo zolfo elementare, per il cibo e l’energia. Possono anche essere aerobici, utilizzando ossigeno per la respirazione, o anaerobici, utilizzando forme combinate di ossigeno, come nitrato o solfato, per respirare. Alcuni batteri possono utilizzare ossigeno o forme combinate di ossigeno e sono noti come anaerobi facoltativi.

Principles

Un modo per enumerare il numero di batteri presenti in un campione di terreno è utilizzare la metodologia di diluizione e placcatura. Questa metodologia utilizza l’agar come mezzo per la crescita batterica, un processo definito “tecnologia coltivabile”. A causa del gran numero di batteri presenti all’interno dei terreni, un piccolo campione di terreno viene diluito in serie in acqua, prima di essere placcato su agar all’interno di una piastra di Petri. Tipicamente, una piccola quantità di terreno contenuta entro 0,1 a 1 mL della sospensione del suolo diluito viene “distribuita” sulla superficie della piastra di agar. Le piastre contengono agar, che è fuso quando è caldo, ma solido quando è freddo. Oltre all’agar, i nutrienti, come il lievito peptone o un prodotto disponibile in commercio come R₂A, vengono aggiunti al mezzo per consentire la crescita di batteri eterotrofi.

La diluizione e la placcatura sono una tecnologia economica e relativamente semplice per l’enumerazione dei batteri del suolo. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti alla tecnica. Alcuni errori e ipotesi comuni associati ai saggi di diluizione e placcatura sono i seguenti: si presume che ogni singolo batterio del suolo dia origine a una colonia, ma in realtà una colonia può derivare da un grumo di cellule, con conseguente sottovalutazione del vero conteggio coltivabile. Durante la diluizione seriale del terreno, le particelle di terreno possono depositarsi (cadere sul fondo), quindi la vera aliquota del suolo non viene trasmessa nella diluizione successiva. Molti microbi del suolo sono vitali ma non coltivabili. I batteri a crescita lenta potrebbero non provocare colonie visibili entro un lasso di tempo ragionevole (1-2 settimane).

Inoltre, i batteri anaerobici non crescono in condizioni aerobiche e i batteri che crescono sono selezionati dai nutrienti aggiunti al mezzo. Così R₂A seleziona per i batteri eterotrofi, mentre lo zolfo elementare seleziona per gli ossidanti autotrofici dello zolfo. Nel complesso, si stima che solo lo 0,1-1% di tutti i batteri del suolo possa essere coltivato. Pertanto, la diluizione e la placcatura dei batteri del suolo rappresentano solo i batteri coltivabili e sottovalutano la vera popolazione vitale del suolo di uno o due ordini di grandezza. Un esempio di colonie batteriche eterotrofiche risultanti dalla diluizione e dalla placcatura del suolo è mostrato nella Figura 1. Si noti che circa 1 milione di cellule batteriche sono necessarie affinché una colonia sia visibile ad occhio nudo.

Questo esperimento dimostra la metodologia di diluizione e diffusione della placcatura utilizzata per enumerare il numero di batteri all’interno di un campione di terreno. In particolare, vengono utilizzati due mezzi: uno progettato per tutti i batteri e l’altro che seleziona per gli actinomiceti. Una volta che le colonie batteriche sono cresciute sulle piastre di agar, isolare le colture pure di colonie selezionate utilizzando una tecnica a piastra striata. Tali culture pure possono quindi essere ulteriormente analizzate e caratterizzate per tratti e funzioni specifici.

Figura 1. Colonie eterotrofiche su una piastra di agar R₂A. Un certo numero di colonie discrete con morfologia diversa sorgono dopo la diluizione e la placcatura dal suolo. Autorizzazione all’uso concessa da Academic Press.

Procedure

1. Preparazione delle diluizioni del suolo

Per iniziare la procedura, pesare 10 g di campione di terreno e aggiungere a 95 ml di acqua deionizzata. Agitare bene la sospensione ed etichettare come “A”.
Prima che il terreno si depositi, rimuovere 1 mL della sospensione con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco d’acqua deionizzata da 9 mL. Vortice completo, ed etichetta come “B”.
Ripetere questa fase di diluizione tre volte, ogni volta con 1 mL della sospensione precedente e uno spazio vuoto d’acqua deionizzato da 9 mL. Etichettali in sequenza come tubi C, D ed E. Ciò si traduce in diluizioni seriali da 10^-1 a 10^-5 grammi di terreno per mL

2. Realizzazione di piastre diffuse per la coltura batterica

Per far crescere le colonie batteriche, prendere tre piastre di agar peptone-lievito pre-preparate ed etichettarle come C, D ed E. Campioni di vortice C, D ed E e pipetta 0,1 ml su ciascun piatto. Questo aumenta ulteriormente il valore di diluizione, di un fattore dieci (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
Quindi, immergere uno spandi bicchiere nell’etanolo. Mettere lo spargitore in una fiamma per alcuni secondi per accendere e bruciare l’etanolo. Questo sterilizzerà lo spargitore.
Tenere lo spargitore sopra la prima piastra fino a quando la fiamma non si spegne. Aprire rapidamente la piastra, tenendo il coperchio vicino. Toccare lo spargitore all’agar lontano dall’inoculo (Inoculum = cellule utilizzate per iniziare una coltura) per raffreddare, quindi diffondere la goccia di inoculo intorno alla superficie dell’agar fino a quando le tracce di liquido libero scompaiono. Sostituire il coperchio della piastra.
Riafirgire lo spargitore e ripetere il processo con la piastra successiva, lavorando rapidamente in modo da non contaminare l’agar con organismi presenti nell’aria
Incubare le piastre batteriche a temperatura ambiente per 1 settimana. Assicurarsi che le piastre siano invertite durante l’incubazione per evitare che gocce di umidità dovute alla condensa cadano sulla superficie dell’agar.

3. Fare piastre di diffusione per Actinomiceti

Per coltivare actinomiceti, prendere tre piastre di glicerolo-caseina pre-preparate ed etichettarle come B, C e D. Usando le tecniche mostrate in precedenza, distribuire la piastra 0,1 ml dalle sospensioni B, C e D. Le diluizioni inferiori sono utilizzate perché gli actinomiceti sono tipicamente presenti come 1/10 ° della popolazione batterica (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
Incubare le piastre di actinomicete (invertite) a temperatura ambiente per 2 settimane.

4. Conteggi batterici e actinomiceti

Dopo l’incubazione, esaminare attentamente tutte le piastre batteriche e notare le differenze nelle dimensioni e nella forma della colonia. Quando vengono coltivati su agar, i batteri producono colonie viscide che vanno dall’incolore all’arancione brillante, al giallo o al rosa. Al contrario, le colonie di actinomiceti sono gessose, sode, coriacee e si rompono sotto pressione, dove altre colonie batteriche si spalmano. Ciò consente alle colonie di essere distinte dal tocco con un anello sterile.
Contare e registrare il numero di colonie batteriche, compresi eventuali actinomiceti. Conta solo le piastre con 30-200 colonie per piatto.

5. Isolamento delle culture pure

Selezionare le singole colonie batteriche da una qualsiasi delle piastre. Più colonie possono essere selezionate se c’è particolare interesse per il suolo. Utilizzare una piastra ad alta diluizione, in quanto tende ad avere colonie pure che sono ben separate. Scegli solo colonie che sono ben separate dalle colonie vicine e sembrano morfologicamente distinte l’una dall’altra.
Sterilizzare il cappio immergendolo nell’alcool e infiammandolo. Apri rapidamente la capsula di Petri di interesse e tocca il cappio in un punto nudo nell’agar per raffreddarlo. Quindi, rimuovi una piccola quantità di una colonia di interesse sul loop.
Prendendo un piatto di lievito peptone fresco, fai una striscia lunga pochi centimetri su un lato. Sterilizzare e raffreddare di nuovo, quindi fare una striscia che attraversa la striscia iniziale solo al primo passaggio. Ripeti questo processo altre due volte nello stesso modo. Questa “diluizione” striata fa in modo che le cellule sul loop vengano separate l’una dall’altra. Posizionare la piastra in una zona buia per incubare a temperatura ambiente per due settimane.

Determinare un conteggio accurato dei batteri ambientali è fondamentale per valutare la salute di un ecosistema del suolo. Questo può essere ottenuto coltivando colonie batteriche con diluizioni appropriate.

I batteri del suolo sono una parte importante di un ecosistema del suolo sano, giocando ruoli nella decomposizione, nella fissazione dell’azoto e nel ciclo dei nutrienti. I terreni superficiali sono un substrato di particelle organiche e inorganiche che formano una matrice complessa che circonda i pori che si riempiono di aria o acqua. Queste condizioni creano un ecosistema ideale per i batteri, con terreni superficiali che contengono tipicamente fino a un milione di batteri per grammo.

A causa di questa alta concentrazione di batteri, la diluizione è necessaria prima di placcare sui mezzi di crescita. Le diluizioni seriali possono ridurre la concentrazione del campione di terreno originale a livelli abbastanza bassi da consentire la crescita di singole colonie su piastre di media, consentendo il calcolo dei conteggi iniziali di batteri nel campione di terreno.

Questo video illustrerà come preparare le diluizioni seriali dei campioni di terreno, come placcare questi campioni batterici e come calcolare i conteggi batterici del suolo dalle piastre di diluizione.

I batteri sono semplici organismi procariotici, ma molto diversi in termini di specie ed ecosistema. Gli actinomiceti sono un sottoinsieme di batteri che sono spesso considerati un gruppo unico a causa della loro struttura filamentosa, dove crescono infilati insieme per formare ife.

Tipicamente, gli actinomiceti rappresentano il 10% della popolazione batterica totale nel suolo. Batteri e actinomiceti sono abbondanti in quasi tutti gli ambienti della Terra, ma si trovano in una diversità e abbondanza senza pari nel suolo.

I batteri del suolo sono enumerati e potenzialmente coltivati e identificati mediante placcatura di diluizione. Qui, un campione di terreno viene diluito in serie in acqua e quindi disperso su piastre di crescita di agar. Le colonie risultanti vengono quindi contate. Questo valore, insieme al fattore di diluizione, viene utilizzato per chiarire la concentrazione iniziale di batteri nel suolo.

La placcatura di diluizione è un metodo comune, economico e semplice per l’enumerazione batterica, ma soffre di diversi inconvenienti. Il terreno non dovrebbe essere lasciato depositare durante le diluizioni, che potrebbero portare a una crescita distorta. Alcuni batteri del suolo non si coltivano sui piatti o crescono troppo lentamente per essere osservati. Inoltre, questo metodo presuppone che le colonie siano formate da un singolo batterio, ma possono derivare da grumi di più cellule.

Alcune specie batteriche crescono meglio su diversi mezzi di crescita. Un substrato comune per la coltura di una vasta gamma di batteri è una piastra di lievito agar-peptone. Gli actinomiceti crescono preferenzialmente su piastre a base di glicerolo-caseina, che meglio si adattano alla crescita di questi batteri filamentosi.

Ora che hai capito il concetto alla base dell’enumerazione batterica, vediamo come questo processo viene eseguito in laboratorio.

Per iniziare la procedura, pesare 10 g di campione di terreno e aggiungere a 95 ml di acqua deionizzata. Agitare bene la sospensione ed etichettare come “A”. Prima che il terreno si depositi, rimuovere 1 mL della sospensione con una pipetta sterile e trasferirla in 9 mL di acqua deionizzata. Vortice completo, ed etichetta come “B”.

Ripetere questa fase di diluizione 3 volte, ogni volta con 1 mL della sospensione precedente e 9 mL di acqua deionizzata. Etichettali in sequenza come tubi C, D ed E. Ciò si traduce in diluizioni seriali da 10^-1 a 10^-5 grammi di terreno per ml.

Per far crescere le colonie batteriche, prendere 3 piastre di agar peptone-lievito pre-preparate ed etichettarle come C, D ed E. Vortex i campioni corrispondenti e pipetta 0,1 mL su ciascun piatto. Poiché le CFU sono riportate per ml, l’utilizzo di 0,1 mL aumenta ulteriormente la diluizione di un fattore dieci.

Quindi, immergere uno spandi bicchiere nell’etanolo. Mettere lo spargitore in una fiamma per alcuni secondi per accendere e bruciare l’etanolo. Questo sterilizzerà lo spargitore.

Tenere lo spargitore sopra la prima piastra fino a quando la fiamma non si spegne. Aprire rapidamente la piastra, tenendo il coperchio vicino. Toccare lo spargitore all’agar lontano dall’inoculo per raffreddare, quindi distribuire la goccia di inoculo sulla superficie fino a quando le tracce di liquido libero scompaiono. Sostituire il coperchio della piastra.

Riafirgire lo spargitore e ripetere il processo con la piastra successiva, lavorando rapidamente in modo da non contaminare la piastra con organismi presenti nell’aria. Invertire le piastre per evitare che le gocce di umidità cadano sull’agar e incubare le piastre a temperatura ambiente per una settimana.

Per coltivare actinomiceti, prendere tre piastre di glicerolo-caseina pre-preparate ed etichettarle come B, C e D. Usando le tecniche mostrate in precedenza, distribuire la piastra 0,1 ml dalle sospensioni B, C e D. Le diluizioni più basse sono utilizzate perché gli actinomiceti sono tipicamente presenti come 1/10 della popolazione batterica.

Infine, invertire queste piastre e conservare a temperatura ambiente per due settimane.

Dopo l’incubazione, esaminare attentamente tutte le piastre batteriche e notare le differenze nelle dimensioni e nella forma della colonia. Quando vengono coltivati su agar, i batteri producono colonie viscide che vanno dall’incolore all’arancione brillante, al giallo o al rosa. Al contrario, le colonie di actinomiceti sono gessose, sode, coriacee e si rompono sotto pressione, dove altre colonie batteriche si spalmano. Ciò consente alle colonie di essere distinte dal tocco con un anello sterile.

Contare e registrare il numero di colonie batteriche, compresi eventuali actinomiceti. Conta solo le piastre con 30-200 colonie per piatto.

Per coltivare colture di singoli batteri specifici, selezionare colonie discrete da una qualsiasi delle piastre, scegliendo colonie ben separate dalle colonie vicine. Sterilizzare un anello di diffusione, quindi aprire la piastra e toccare il ciclo in un punto vuoto per raffreddare. Quindi, scegli una piccola quantità della colonia di interesse sul loop.

Prendendo un piatto di lievito peptone fresco, fai una striscia lunga pochi centimetri su un lato. Sterilizzare e raffreddare di nuovo, quindi fare una striscia che attraversa la striscia iniziale solo al primo passaggio. Ripeti questo processo altre due volte nello stesso modo. Questa “diluizione” striata fa in modo che le cellule sul loop vengano separate l’una dall’altra. Posizionare la piastra in una zona buia per incubare a temperatura ambiente per due settimane.

Dai conteggi delle colonie batteriche e actinomicete, è possibile determinare le unità formanti colonie per grammo di terreno. Il numero di colonie per grammo di terreno è pari al numero di colonie contate sulla piastra, moltiplicato per il reciproco della diluizione placcata. Ad esempio, se 46 colonie vengono contate su una piastra di diluizione di 10^-5 con un inoculante da 0,1 ml, il CFU per grammo di terreno è pari a 10^-6 per 46, o 46 milioni di CFU per grammo di terreno.

L’esecuzione di conteggi e colture batteriche è un primo passo fondamentale in molte indagini o protocolli scientifici.

Il terreno sano contiene tra 10⁶ e 10⁸ batteri per grammo. L’enumerazione batterica del suolo può essere utilizzata per determinare la salute dei terreni di interesse e conteggi inferiori a 10⁶ e 10⁸ batteri per grammo indicano un terreno malsano o povero. Ciò può essere causato da una mancanza di nutrienti o materia organica, stress abiotico dovuto a pH estremo del suolo o contaminazione del suolo.

Molti tipi di antibiotici usati in medicina oggi sono stati identificati per la prima volta da batteri o funghi che vivono nel suolo. Isolare ceppi puri dalle colture del suolo può aiutare potenzialmente gli scienziati a identificare nuovi composti antibiotici. Qui, batteri di prova o composti isolati di interesse possono essere aggiunti a piatti coltivati con prati batterici e i loro effetti sulla crescita del prato registrati. Macchie chiare nei prati batterici in cui la crescita è stata inibita dai batteri o dal composto di prova possono indicare attività antibiotica.

Le leguminose tra cui piselli e fagioli si basano su relazioni simbiotiche con batteri che fissano l’azoto. Questi batteri vivono liberamente nel terreno o all’interno dei noduli nel sistema radicale e producono composti azotati che vengono utilizzati dalla pianta. Nei terreni poveri, l’integrazione di leguminose con batteri azoto-fissanti coltivati dai terreni può aumentare la crescita e la salute delle piante. Ciò può portare a piante più grandi e più resistenti, che a loro volta danno una maggiore resa delle colture.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE all’enumerazione batterica. Ora dovresti capire come eseguire le diluizioni dei campioni di terreno, come placcare per il conteggio delle colonie e l’isolamento delle colonie e come calcolare il numero di batteri nei campioni di suolo. Grazie per l’attenzione!

Results

Un campione di terreno di 10 g con un contenuto di umidità del 20% su base di peso secco viene analizzato per batteri coltivabili vitali tramite tecniche di diluizione e placcatura. Le diluizioni sono state effettuate come indicato nella Tabella 1. 1 mL di soluzione E viene versato su un mezzo appropriato e si traduce in 200 colonie batteriche.

Ma, per 10 g di terreno umido,

Pertanto

Passo		Diluizione
10 g di terreno (peso/volume)	95 mL di soluzione salina (soluzione A)	10^-1
1 mL di soluzione A (volume/volume)	9 mL di soluzione salina (soluzione B)	10^-2
1 mL di soluzione B (volume/volume)	9 mL di soluzione salina (soluzione C)	10^-3
1 mL di soluzione C (volume/volume)	9 mL di soluzione salina (soluzione D)	10^-4
1 mL di soluzione D (volume/volume)	9 mL di soluzione salina (soluzione E)	10^-5

Tabella 1: Diluizione e placcatura dei campioni.

Applications and Summary

Ci sono due applicazioni fondamentali di diluizione e placcatura dei batteri del suolo. La prima applicazione è l’enumerazione dei batteri coltivabili all’interno di un particolare terreno. La quantificazione del numero di batteri del suolo fornisce un’indicazione della salute del suolo. Ad esempio, se ci sono da 10⁶ a 10⁸ batteri coltivabili presenti per grammo di terreno, questo sarebbe considerato un numero sano. Un numero inferiore a 10⁶ per grammo indica una salute del suolo più povera, che può essere dovuta alla mancanza di sostanze nutritive come si trova nei terreni a bassa materia organica; stress abiotico imposto da valori estremi di pH del suolo (pH 8); o tossicità imposta da contaminanti antropogenici organici o inorganici.

La seconda applicazione principale è la visualizzazione e l’isolamento di colture pure di batteri. Le colture pure possono successivamente essere caratterizzate e valutate per caratteristiche specifiche che possono essere utili in applicazioni mediche o ambientali. Gli esempi includono: produzione di antibiotici; biodegradazione di sostanze organiche tossiche; o rizobia specifica utile per la fissazione dell’azoto da parte di leguminose, come piselli o fagioli.

Transcript

Determining an accurate count of environmental bacteria is critical to assessing the health of a soil ecosystem. This can be accomplished by culturing bacterial colonies with appropriate dilutions.

Soil bacteria are an important part of a healthy soil ecosystem, playing roles in decomposition, nitrogen fixing, and nutrient cycling. Surface soils are a substrate of organic and inorganic particles forming a complex matrix surrounding pores that fill with air or water. These conditions create an ideal ecosystem for bacteria, with surface soils typically containing upwards of a million bacteria per gram.

Because of this high concentration of bacteria, dilution is necessary before plating onto growth media. Serial dilutions can reduce the concentration of the original soil sample to levels low enough for single colonies to be grown on media plates, allowing for the calculation of the initial counts of bacteria in the soil sample.

This video will illustrate how to prepare serial dilutions of soil samples, how to plate these bacterial samples, and how to calculate soil bacterial counts from the dilution plates.

Bacteria are simple prokaryotic organisms, but highly diverse in terms of species and ecosystem. Actinomycetes are a subset of bacteria that are frequently considered a unique group due to their filamentous structure, where they grow strung together to form hyphae.

Typically, actinomycetes account for 10% of the total bacterial population in soil. Bacteria and actinomycetes are abundant in almost every environment on Earth, but are found in unparalleled diversity and abundance in soil.

Soil bacteria are enumerated, and potentially cultured and identified by dilution plating. Here, a soil sample is serially diluted in water, and then dispersed onto agar growth plates. The resulting colonies are then counted. This value, along with the dilution factor, is used to elucidate the initial concentration of bacteria in soil.

Dilution plating is a common, inexpensive, and simple method for bacterial enumeration, but it does suffer from several drawbacks. The soil should not be allowed to settle during dilutions, which could lead to biased growth. Some soil bacteria will not culture on the plates, or grow too slow to be observed. Additionally, this method assumes that colonies are formed from a single bacterium, but they may arise from clumps of multiple cells.

Certain bacterial species grow better on different growth media. A common substrate to culture a wide range of bacteria is an agar-peptone yeast plate. Actinomycetes preferentially grow on glycerol-casein based plates, which better suit the growth of these filamentous bacteria.

Now that you understand the concept behind bacterial enumeration, let’s see how this process is carried out in the laboratory.

To begin the procedure, weigh out 10 g of soil sample, and add to 95 mL of deionized water. Shake the suspension well, and label as “A”. Before the soil settles, remove 1 mL of the suspension with a sterile pipette and transfer it to 9 mL of deionized water. Vortex thoroughly, and label as “B”.

Repeat this dilution step 3 times, each time with 1 mL of the previous suspension and 9 mL of deionized water. Label these sequentially as tubes C, D, and E. This results in serial dilutions of 10-1 through 10-5 grams of soil per mL.

To grow bacterial colonies, take 3 pre-prepared peptone-yeast agar plates and label them as C, D, and E. Vortex the corresponding samples and pipette 0.1 mL onto each plate. Since CFUs are reported per mL, using 0.1 mL further increases the dilution by a factor of ten.

Next, dip a glass spreader into ethanol. Place the spreader in a flame for a few seconds to ignite and burn off the ethanol. This will sterilize the spreader.

Hold the spreader above the first plate until the flame is extinguished. Open the plate quickly, holding the lid close by. Touch the spreader to the agar away from the inoculum to cool, and then spread the drop of inoculum around the surface until traces of free liquid disappear. Replace the plate lid.

Re-flame the spreader and repeat the process with the next plate, working quickly so as not to contaminate the plate with airborne organisms. Invert the plates to prevent moisture drops falling onto the agar, and incubate the plates at room temperature for one week.

To grow actinomycetes, take three pre-prepared glycerol-casein plates and label them as B, C, and D. Using the techniques shown previously, spread plate 0.1 mL from the suspensions B, C, and D. The lower dilutions are used because actinomycetes are typically present as 1/10th of the bacterial population.

Finally, invert these plates and store at room temperature for two weeks.

After incubation, examine all of the bacteria plates carefully, and note differences in colony size and shape. When grown on agar, bacteria produce slimy colonies ranging from colorless to bright orange, yellow, or pink. In contrast, actinomycete colonies are chalky, firm, leathery, and will break under pressure, where other bacterial colonies will smear. This allows colonies to be distinguished by touch with a sterile loop.

Count and record the number of bacterial colonies, including any actinomycetes. Only count plates with 30-200 colonies per plate.

To grow cultures of specific individual bacteria, select discrete colonies from any of the plates, choosing colonies that are well separated from neighboring colonies. Sterilize a spreading loop, then open the plate and touch the loop to an empty spot to cool. Next, pick a small amount of the colony of interest onto the loop.

Taking a fresh peptone-yeast plate, make a streak a few centimeters long on one side. Sterilize and cool again, then make a streak that crosses the initial streak only on the first pass. Repeat this process twice more in the same manner. This streaking “dilution” results in cells on the loop being separated from one another. Place the plate in a dark area to incubate at room temperature for two weeks.

From the bacterial and actinomycete colony counts, the Colony Forming Units per gram of soil can be determined. The number of colonies per gram of soil is equal to the number of colonies counted on the plate, multiplied by the reciprocal of the dilution plated. For example, if 46 colonies are counted on a dilution plate of 10-5 with a 0.1 mL inoculant, then the CFU per gram of soil is equal to 10-6 by 46, or 46 million CFUs per gram of soil.

Performing bacterial counts and cultures is a key first step in many scientific investigations or protocols.

Healthy soil contains between 106 and 108 bacteria per gram. Bacterial enumeration of soil can be used to determine the health of soils of interest, and counts of less than 106 and 108 bacteria per gram indicate unhealthy or poor soil. This may be caused by a lack of nutrients or organic matter, abiotic stress due to extreme soil pH, or soil contamination.

Many types of antibiotics used in medicine today were first identified from soil dwelling bacteria or fungi. Isolating pure strains from soil cultures can help in potentially help scientists identify new antibiotic compounds. Here, test bacteria or isolated compounds of interest can be added to plates grown with bacterial lawns, and their effects on the lawn growth recorded. Clear patches in bacterial lawns where growth was inhibited by the test bacteria or compound may indicate antibiotic activity.

Leguminous plants including peas and beans rely upon symbiotic relationships with nitrogen-fixing bacteria. These bacteria live freely in the soil or within nodules in the root system, and produce nitrogen compounds that are utilized by the plant. In poor soils, supplementing leguminous crops with cultured nitrogen-fixing bacteria from soils may boost the growth and health of the plants. This can result in bigger, hardier plants, which in turn give greater crop yield.

You’ve just watched JoVE’s introduction to bacterial enumeration. You should now understand how to perform dilutions of soil samples, how to plate for colony counting and colony isolation, and how to calculate the numbers of bacteria in soil samples. Thanks for watching!