Coltura e conta di batteri da campioni di suolo

Determinare un conteggio accurato dei batteri ambientali è fondamentale per valutare la salute di un ecosistema del suolo. Ciò può essere ottenuto coltivando colonie batteriche con diluizioni appropriate.

I batteri del suolo sono una parte importante di un ecosistema del suolo sano, svolgendo un ruolo nella decomposizione, nella fissazione dell'azoto e nel ciclo dei nutrienti. I suoli superficiali sono un substrato di particelle organiche e inorganiche che formano una matrice complessa che circonda pori che si riempiono di aria o acqua. Queste condizioni creano un ecosistema ideale per i batteri, con terreni superficiali che in genere contengono fino a un milione di batteri per grammo.

A causa di questa elevata concentrazione di batteri, è necessaria una diluizione prima di placcare sui terreni di crescita. Le diluizioni seriali possono ridurre la concentrazione del campione di terreno originale a livelli sufficientemente bassi da consentire la coltivazione di singole colonie su piastre di terreno, consentendo il calcolo della conta iniziale dei batteri nel campione di terreno.

Questo video illustra come preparare diluizioni seriali di campioni di terreno, come placcare questi campioni batterici e come calcolare la conta batterica del suolo dalle piastre di diluizione.

I batteri sono organismi procarioti semplici, ma molto diversi in termini di specie ed ecosistema. Gli actinomiceti sono un sottoinsieme di batteri che sono spesso considerati un gruppo unico a causa della loro struttura filamentosa, dove crescono infilati insieme per formare ife.

Tipicamente, gli actinomiceti rappresentano il 10% della popolazione batterica totale nel suolo. I batteri e gli attinomiceti sono abbondanti in quasi tutti gli ambienti della Terra, ma si trovano in una diversità e abbondanza senza pari nel suolo.

I batteri del suolo vengono enumerati e potenzialmente coltivati e identificati mediante placcatura di diluizione. Qui, un campione di terreno viene diluito in serie in acqua e quindi disperso su piastre di crescita in agar. Le colonie risultanti vengono quindi contate. Questo valore, insieme al fattore di diluizione, viene utilizzato per chiarire la concentrazione iniziale di batteri nel suolo.

La placcatura per diluizione è un metodo comune, economico e semplice per l'enumerazione dei batteri, ma soffre di diversi inconvenienti. Il terreno non dovrebbe essere lasciato depositare durante le diluizioni, il che potrebbe portare a una crescita distorta. Alcuni batteri del suolo non si coltivano sulle piastre o crescono troppo lentamente per essere osservati. Inoltre, questo metodo presuppone che le colonie siano formate da un singolo batterio, ma possono derivare da grumi di più cellule.

Alcune specie batteriche crescono meglio su diversi mezzi di crescita. Un substrato comune per la coltura di un'ampia gamma di batteri è una piastra di lievito agar-peptone. Gli actinomiceti crescono preferenzialmente su piastre a base di glicerolo-caseina, che si adattano meglio alla crescita di questi batteri filamentosi.

Ora che hai capito il concetto alla base dell'enumerazione batterica, vediamo come viene eseguito questo processo in laboratorio.

Per iniziare la procedura, pesare 10 g di campione di terreno e aggiungere 95 ml di acqua deionizzata. Scuotere bene la sospensione ed etichettarla come "A". Prima che il terreno si depositi, rimuovere 1 mL di sospensione con una pipetta sterile e trasferirlo in 9 mL di acqua deionizzata. Vorticare accuratamente ed etichettare come "B".

Ripetere questa fase di diluizione 3 volte, ogni volta con 1 mL della sospensione precedente e 9 mL di acqua deionizzata. Etichettali in sequenza come tubi C, D ed E. Ciò si traduce in diluizioni seriali da 10-1 a 10-5 grammi di terreno per mL.

Per far crescere le colonie batteriche, prelevare 3 piastre di agar peptone-lievito pre-preparate ed etichettarle come C, D ed E. Agitare i campioni corrispondenti e pipettare 0,1 mL su ciascuna piastra. Poiché le CFU sono riportate per mL, l'utilizzo di 0,1 mL aumenta ulteriormente la diluizione di un fattore dieci.

Quindi, immergi uno spandiconcime di vetro nell'etanolo. Metti lo spargitore in una fiamma per alcuni secondi per accendere e bruciare l'etanolo. Questo sterilizzerà lo spandiconcime.

Tenere lo spandiconcime sopra la prima piastra fino a quando la fiamma non si spegne. Aprire rapidamente il piatto, tenendo il coperchio a portata di mano. Toccare lo spandiconcime con l'agar lontano dall'inoculo per raffreddarlo, quindi stendere la goccia di inoculo sulla superficie fino a quando le tracce di liquido libero scompaiono. Riposizionare il coperchio della piastra.

Riaccendere lo spandiconcime e ripetere il processo con la piastra successiva, lavorando rapidamente in modo da non contaminare la piastra con organismi presenti nell'aria. Capovolgere le piastre per evitare che le gocce di umidità cadano sull'agar e incubare le piastre a temperatura ambiente per una settimana.

Per coltivare gli actinomiceti, prendere tre piastre di glicerolo-caseina pre-preparate ed etichettarle come B, C e D. Utilizzando le tecniche mostrate in precedenza, stendere la piastra di 0,1 ml dalle sospensioni B, C e D. Le diluizioni più basse vengono utilizzate perché gli actinomiceti sono tipicamente presenti come 1/10 della popolazione batterica.

Infine, capovolgere queste piastre e conservarle a temperatura ambiente per due settimane.

Dopo l'incubazione, esaminare attentamente tutte le piastre batteriche e notare le differenze nelle dimensioni e nella forma della colonia. Quando vengono coltivati sull'agar, i batteri producono colonie viscide che vanno dall'incolore all'arancione brillante, al giallo o al rosa. Al contrario, le colonie di actinomiceti sono gessose, sode, coriacee e si rompono sotto pressione, dove altre colonie batteriche si spalmano. Ciò consente di distinguere le colonie al tatto con un'ansa sterile.

Contare e registrare il numero di colonie batteriche, compresi eventuali actinomiceti. Contare solo le piastre con 30-200 colonie per piastra.

Per coltivare colture di singoli batteri specifici, selezionare colonie discrete da una qualsiasi delle piastre, scegliendo colonie ben separate dalle colonie vicine. Sterilizzare un anello di diffusione, quindi aprire la piastra e toccare l'anello in un punto vuoto per raffreddarlo. Quindi, raccogli una piccola quantità della colonia di interesse sul ciclo.

Prendendo un piatto di peptone fresco e lievito, fare una striscia lunga qualche centimetro su un lato. Sterilizzare e raffreddare nuovamente, quindi fare una striscia che attraversi la striscia iniziale solo al primo passaggio. Ripeti questo processo altre due volte nello stesso modo. Questa "diluizione" delle striature fa sì che le cellule dell'ansa vengano separate l'una dall'altra. Posizionare la piastra in un'area buia per incubare a temperatura ambiente per due settimane.

Dalla conta delle colonie batteriche e di actinomiceti, è possibile determinare le unità formanti colonie per grammo di suolo. Il numero di colonie per grammo di terreno è uguale al numero di colonie contate sulla piastra, moltiplicato per il reciproco della diluizione piastrata. Ad esempio, se si contano 46 colonie su una piastra di diluizione di 10-5 con un inoculante da 0,1 mL, allora le CFU per grammo di terreno sono pari a 10-6 per 46, o 46 milioni di CFU per grammo di terreno.

L'esecuzione di conta batterica e colture è un primo passo fondamentale in molte indagini o protocolli scientifici.

Un terreno sano contiene tra 106 e 108 batteri per grammo. L'enumerazione batterica del suolo può essere utilizzata per determinare la salute dei suoli di interesse e conteggi inferiori a 106 e 108 batteri per grammo indicano un terreno malsano o povero. Ciò può essere causato da una mancanza di nutrienti o materia organica, stress abiotico dovuto a un pH estremo del suolo o contaminazione del suolo.

Molti tipi di antibiotici utilizzati in medicina oggi sono stati identificati per la prima volta da batteri o funghi che vivono nel suolo. L'isolamento di ceppi puri dalle colture del suolo può aiutare potenzialmente gli scienziati a identificare nuovi composti antibiotici. In questo caso, i batteri di prova o i composti isolati di interesse possono essere aggiunti a piastre coltivate con prati batterici e i loro effetti sulla crescita del prato possono essere registrati. Macchie chiare nei prati batterici in cui la crescita è stata inibita dai batteri o dal composto in esame possono indicare l'attività antibiotica.

Le leguminose, tra cui piselli e fagioli, si basano su relazioni simbiotiche con i batteri che fissano l'azoto. Questi batteri vivono liberamente nel terreno o all'interno dei noduli dell'apparato radicale e producono composti azotati che vengono utilizzati dalla pianta. Nei terreni poveri, l'integrazione delle colture leguminose con batteri azotofissatori coltivati dal suolo può aumentare la crescita e la salute delle piante. Ciò può portare a piante più grandi e più resistenti, che a loro volta danno una maggiore resa del raccolto.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'enumerazione batterica. Ora dovresti capire come eseguire le diluizioni dei campioni di terreno, come impiattare per il conteggio e l'isolamento delle colonie e come calcolare il numero di batteri nei campioni di terreno. Grazie per l'attenzione!