Identificazione dei roditori II

La capacità di identificare i singoli animali da ricerca è un aspetto essenziale della tenuta dei registri scientifici e della raccolta dei dati. La distinzione tra gli animali garantisce che il soggetto corretto venga utilizzato per la procedura sperimentale prevista.

Esistono diversi metodi permanenti e temporanei che gli scienziati utilizzano per identificare i singoli animali da laboratorio. In questo video, discuteremo i metodi che coinvolgono il tatuaggio della coda di roditori adulti, delle dita dei neonati e delle dita dei piedi degli adulti. Successivamente, toccheremo la tecnica di posizionamento del microchip comunemente eseguita nei ratti adulti, seguita dal metodo di identificazione temporanea universale che utilizza coloranti non tossici.

Prima di approfondire i protocolli per questi metodi, esaminiamo le considerazioni, i vantaggi e le carenze di ciascuna di queste tecniche. Il tatuaggio della coda è utile in molti protocolli di ricerca, come gli esperimenti che coinvolgono la risonanza magnetica o quelli in cui gli animali sono geneticamente predisposti alle condizioni della pelle, tra cui la dermatite ulcerosa. Un altro vantaggio dei tatuaggi di coda è che sono facilmente visualizzati senza dover trattenere manualmente l’animale.

Alcuni protocolli sperimentali richiedono la genotipizzazione dei neonati già dal primo giorno, il che rende essenziale che questi cuccioli siano identificati in modo permanente. L’uso del tatuaggio delle dita dei dita dei dito consente di identificare tali animali fino a quando non sono abbastanza grandi per l’etichettatura auricolare o la punzonatura dell’orecchio. È una buona idea applicare un tatuaggio simile alla madre adulta per impedirle di reagire in modo eccessivo e di governare eccessivamente il nuovo tatuaggio del suo cucciolo. Sebbene ci siano diversi vantaggi nell’utilizzo di questo metodo, lo svantaggio è che la procedura richiede abilità, pratica, una mano ferma e attrezzature specializzate.

Il prossimo metodo di identificazione permanente in esame è il microchip. Sebbene l’impianto di microchip sia un processo relativamente semplice, ci sono diversi fattori che ne limitano l’utilità. In primo luogo, questi chip hanno approssimativamente le dimensioni di un grande chicco di riso e richiedono un ago calibro 10-12 per l’impianto, che è troppo grande per un topo, limitando così il metodo ai ratti adulti. In secondo luogo, i microchip sono costosi e quindi non sono ideali per identificare un gran numero di animali. Infine, i microchip non possono essere utilizzati negli esperimenti che coinvolgono la risonanza magnetica. Tuttavia, se esiste un gruppo di animali preziosi come animali riproduttori con genetiche uniche che devono essere identificate in modo permanente, è possibile utilizzare microchip.

L’ultimo metodo che discuteremo è l’identificazione temporanea utilizzando marcatori non tossici. I marcatori non tossici sono fatti per colorare la pelliccia degli animali da ricerca. Questo metodo è ideale per studi a breve termine che richiedono che gli animali siano identificati solo per poche ore o giorni, anche se i coloranti possono rimanere visibili per diverse settimane. Alcuni ricercatori usano questi marcatori in combinazione con altri metodi di identificazione per individuare facilmente animali specifici in un gruppo.

Ora che abbiamo discusso lo sfondo, impariamo le procedure, iniziando con il tatuaggio della coda. Qui, dimostreremo la procedura sui topi adulti, ma lo stesso può essere applicato per lo svezzamento e i ratti adulti.

Per ridurre al minimo qualsiasi apprensione o angoscia per gli animali, il tatuaggio della coda deve essere eseguito nella sala procedure piuttosto che nell’area di stabulazione degli animali. Prima di applicare il tatuaggio, trattenere il mouse usando un freno a tazza, con la coda tirata tesa dall’apertura. La flangia della tazza viene tenuta in posizione tramite una piattaforma di vetro specializzata. Quindi, pulire la coda con una piccola quantità di detergente per tessuti diluiti su un tampone con punta di cotone. Questo passaggio è importante per rimuovere qualsiasi accumulo di incrostazioni e detriti che potrebbero interferire con il tatuaggio. Quindi, applicare l’olio di tessuto sulla pelle della coda con un altro tampone. Ciò riduce al minimo i danni ai tessuti ammorbidendo la pelle e fornendo lubrificazione per l’ago del tatuaggio. Inoltre, l’olio scioglie lo sporco non rimosso dal processo di pulizia e previene la colorazione dell’inchiostro sulla pelle non tatuata. Ora sei pronto per applicare il tatuaggio.

Mentre la macchina è spenta, immergere la punta dell’ago del tatuaggio, che è un ago a lancetta o ipodermico, nel pigmento. Quindi, attivare la pistola usando il pedale, posizionare lo strumento tatuaggio sulla coda e portare la punta dell’ago sul sito del tatuaggio. Avvicinarsi alla pelle con l’ago con un angolo di 90 ° e penetrare abbastanza profondamente nel derma in modo tale che il pigmento si depositi permanentemente. Un cambiamento nel suono dell’ago attivato può aiutare a discernere la profondità. Crea brevi tratti pari in una direzione, formando numeri e lettere. Cerca di usare curve e angoli minimi quando applichi il tatuaggio.

Per aggiungere ulteriore pigmento, immergere la punta dell’ago nel serbatoio del colorante per ogni uno-due caratteri per i topi e ogni carattere per i ratti. Tamponare il tatuaggio completato con un tovagliolo di carta per rimuovere il pigmento in eccesso. La presenza di sangue sul tatuaggio o sul tovagliolo di carta indica che il tatuaggio è stato fatto troppo in profondità ed è quindi improbabile che sia permanente. Rinforzare i caratteri sottili con pigmento aggiuntivo posizionando l’ago parallelamente, non sulla parte superiore, del pigmento già depositato. Pulire accuratamente l’attrezzatura per tatuaggi dopo ogni utilizzo e un ago nuovo o sterilizzato e una nuova scorta di inchiostro devono essere utilizzati tra le gabbie per prevenire la trasmissione della malattia.

Successivamente, impareremo come applicare i tatuaggi ai neonati e agli adulti. Qui, dimostreremo la procedura nei topi, ma gli stessi passaggi sono applicabili ai ratti.

I neonati sono tatuati sulle dita dei piedi poiché i coccige non sono ossificati e la lunghezza della coda è troppo piccola. Inoltre, man mano che la coda cresce, la pelle si allunga e i numeri potrebbero diventare distorti, deboli e illeggibili. Inizia posizionando una macchia di pasta verde per tatuaggi su una superficie non porosa come un foglio di alluminio. Quindi, coppetta il cucciolo pre-svezzato in mano usando una garza. Posiziona il piede tra il pollice e la curva del dito indice per esporre le dita dei piedi scelte per il tatuaggio. Tenere il piede vicino alle dita dei piedi in modo che la dita selezionata abbia una superficie solida dietro di essa per evitare che si pieghi.

Ora, immergi la punta di una lancetta da 4,5 mm nella pasta del tatuaggio. Quindi, colpisci la punta desiderata secondo il codice predeterminato. Per garantire una corretta permeazione, colpire lo stesso punto tre volte. Penetrare nella pelle abbastanza in modo che la pasta lasci un segno, ma evitare di colpire così profondamente che la punta sanguina. Asciugare delicatamente il nuovo tatuaggio con la garza per rimuovere l’eventuale pasta per tatuaggi in eccesso e riportare l’animale nella sua gabbia. Usa una nuova lancetta per la prossima cucciolata. Un giorno dopo la procedura, verificare che il tatuaggio sia visibile.

Quando i cuccioli che allattano sono tatuati, è consigliabile tatuare anche la diga. Questo potrebbe impedirle di recitare in modo eccessivo e di curare eccessivamente i tatuaggi del suo cucciolo. Per applicare un tatuaggio della dita a un adulto, di nuovo, prima posiziona una piccola macchia di pasta verde per tatuaggi su un foglio di alluminio. Quindi, trattenere l’animale usando un cono di plastica o un freno in plexiglass che consente l’accesso ai piedi posteriori. Estendi il piede dal dispositivo di ritenuta e posiziona il piede tra il pollice e la curva del dito indice per esporre le dita dei piedi scelte per il tatuaggio.

Ora, immergi la punta di una lancetta da 5 mm nella pasta del tatuaggio. E, come prima, applica il tatuaggio colpendo e perforando la pelle del dito desiderato almeno tre volte per garantire una corretta penetrazione. Quindi, asciugare delicatamente il tatuaggio per rimuovere la pasta in eccesso e riportare l’animale nella sua gabbia. Come con i neonati, verificare il tatuaggio un giorno dopo la procedura. Se il segno è visibile il giorno dopo il tatuaggio, dovrebbe rimanere visibile per tutta la vita dell’animale. Se è debole o non visibile, rifare il tatuaggio come descritto in precedenza.

Il prossimo metodo di identificazione che discuteremo prevede l’impianto di microchip nei roditori. Il chip comunemente usato per etichettare gli animali da laboratorio è un chip di identificazione a radiofrequenza o RFID. Di solito, il chip è precaricato in aghi, che possono quindi essere inseriti nell’applier. Per l’inserimento di trucioli, utilizzare un tubo di plexiglass per trattenere l’animale assicurandosi di poter ancora afferrare la pelle sopra le spalle. Per prima cosa, tenda la pelle per creare una tasca. Quindi posizionare l’ago attraverso la pelle, smussare verso l’alto, parallelamente alla colonna vertebrale e diretto verso la coda. Espellere il microchip per via sottocutanea e prelevare l’ago. Pizzicare la pelle chiusa nel sito di iniezione per evitare che il chip segui l’ago fuori dalla pelle. Continuare ad applicare pressione per fornire emostasi per qualsiasi sanguinamento della pelle. Rimuovere l’animale dal dispositivo di ritenuta e scansionare il chip utilizzando il lettore fornito dal produttore per confermare il codice di identificazione.

Infine, impariamo come applicare coloranti temporanei ai roditori per l’identificazione. Iniziamo con i topi. In primo luogo, trattenere l’animale in modo tale che l’area tra le scapole sia accessibile. Questa parte del corpo è al sicuro dall’auto-toelettatura. Posiziona una macchia o una striscia del colorante sulla pelliccia in quest’area e rimette l’animale nella sua gabbia.

Per i ratti, trattenere manualmente l’animale afferrando la coda e tenendola tesa. Ciò garantisce che l’area per l’applicazione del colorante sia facilmente accessibile, che potrebbe essere testa, spalle o groppa. Posiziona una macchia o una striscia del colorante sulla pelliccia. A volte è possibile applicare coloranti non tossici senza trattenere l’animale. Controlla periodicamente i segni su questi animali, soprattutto se li usi come unico identificatore per più di qualche giorno.

Ora che abbiamo esaminato le procedure di questi diversi metodi di identificazione, vediamo come gli scienziati li stanno usando in diversi studi di ricerca oggi.

L’uso di roditori negli esperimenti comportamentali è piuttosto comune. Qui, i ricercatori hanno usato il tatuaggio della coda per contrassegnare gli animali in modo permanente e poi li hanno osservati per diversi giorni in un ambiente di gabbia domestica costruito artificialmente. I dati raccolti hanno rivelato differenze nei comportamenti, come la distanza spostata, tra il controllo e gli animali da esperimento, per un periodo post-operatorio di 10 giorni.

In un altro esperimento comportamentale, i ricercatori hanno eseguito il tatuaggio delle dita dei dita dei dita dei pollici nei neonati e li hanno collocati in una scatola di registrazione con microfoni speciali per registrare vocalizzazioni ultrasoniche. Lo scopo di questo esperimento era quello di esaminare le differenze nel tasso di chiamata, cioè il numero di vocalizzazioni al minuto, nei topi wild type e Shank2 carenti – un modello di autismo – oltre il periodo neonatale di 12 giorni e la cappa adulta.

Infine, come discusso in precedenza, l’uso di coloranti non tossici è un modo efficace per contrassegnare gli animali per esperimenti a breve termine. Qui, gli scienziati erano interessati all’espressione transitoria di una proteina plasmatica. Così hanno contrassegnato gli animali con marcatori temporanei, iniettato il DNA del plasmide per via endovenosa e raccolto il campione di sangue due giorni dopo per determinare l’espressione proteica usando la tecnica western blot.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE al tatuaggio, al posizionamento di microchip e ai metodi di identificazione temporanea per topi e ratti di laboratorio. L’identificazione degli animali è una componente primaria della tenuta dei registri nella ricerca. Pertanto, quando si sceglie il metodo di identificazione appropriato, è necessario deliberare molti fattori. Ciò include il livello di disagio per l’animale, la facilità della tecnica, le esigenze sperimentali e, infine, il costo associato al metodo. Come sempre, grazie per aver guardato!