Gascromatografia con rivelatore a ionizzazione di fiamma
1. Inizializzazione del CG
- Accendere il gas e l'aria di trasporto dell'elio e regolare i manometri sullo strumento.
- Accendere il forno a colonna ad alta temperatura (in genere 250 °C o superiore) per cuocere nella colonna. Non superare la temperatura massima della colonna. Questo rimuoverà eventuali contaminanti. Lasciare cuocere per almeno 30 minuti prima di eseguire un campione.
2. Creazione di un file di metodi
- Nel software che controlla lo strumento, inserire tutti i valori desiderati per un file di metodi. Innanzitutto, imposta le impostazioni del autocampionatore. Impostare il numero di risciacqui pre-esecuzione, risciacqui post-esecuzione e risciacqui con campione. Questi risciacqui puliscono la colonna tra diversi campioni.
- La quantità iniettata è in genere di 1 μL. Di solito viene impostato un rapporto di divisione perché l'iniezione di tutto un campione potrebbe sovraccaricare la colonna. Se il rapporto di divisione è 100:1, ciò significa che per ogni 1 parte che viene iniettata nello strumento 100 parti vanno sprecate.
- Immettere i parametri della fase mobile. La portata è controllata dalla pressione impostata. Portate più elevate portano a separazioni più rapide, ma c'è meno tempo per l'analita di interagire con la colonna.
- Immettere la programmazione della temperatura. Per una corsa isotermica, inserire la temperatura della separazione e quindi un tempo per la separazione. Per un'eluizione del gradiente, immettere la temperatura iniziale e il tempo di attesa, la temperatura finale e il tempo di attesa e la velocità di rampa in °C/min. Viene inoltre impostato un tempo di equilibrio che consente alla colonna di raffreddare la temperatura originale tra una corsa e l'altra.
- Immettere i parametri del rilevatore. Verranno inserite una temperatura e una frequenza di campionamento del rilevatore. Il rivelatore deve avere sempre una temperatura superiore alla temperatura della colonna in modo che nessun analita si condensi sul rivelatore.
- Salvare il file dei metodi. Potrebbe anche essere necessario scaricare i parametri in modo che vengano letti dal GC.
3. Raccolta dei dati delle CG
- Accendere l'idrogeno gassoso e assicurarsi che il manometro sia impostato correttamente. Accendi la fiamma del FID.
- Sul rack dell'autocampionatore, riempire il flaconcino di lavaggio con solvente di lavaggio, come acetonitrile o metanolo. Assicurarsi che il flaconcino di scarico sia vuoto.
- Preparare il campione. Se c'è qualche possibilità di particolato nel campione, filtrare il campione. Poiché a volte si possono vedere residui di plastica con GC, utilizzare solo siringhe di vetro e flaconcini di vetro per preparare il campione.
- Riempire il flaconcino almeno a metà strada con il campione in modo che la siringa autocampionatore sia assicurata per raccogliere il campione. I flaconcini dell'autocampionatore sono in genere di 2 ml, ma se il volume del campione è limitato, sono disponibili inserti del flaconcino per ridurre il volume del campione necessario.
- Caricare il flaconcino o i flaconcini campione nel rack dell'autocampionatore. Tieni traccia della posizione in cui si trova ogni campione.
- Prima dell'esecuzione, azzerare la linea di base del registratore grafico sul software del computer.
- I file possono essere raccolti come singola esecuzione o utilizzando una tabella batch per più esecuzioni. Assicurarsi di specificare il numero di flaconcino corretto per il campione. Premi il pulsante "start" e crea un file.
- I dati vengono in genere analizzati con un programma software. I parametri che possono essere misurati includono il tempo di ritenzione, l'altezza del picco, l'area del picco e il numero di piastre teoriche.
4. Risultati: Analisi GC di campioni di caffè
- In questo esempio, l'analisi GC-FID è stata eseguita per la caffeina e l'acido palmitico, due composti presenti nel caffè. La caffeina è meno polare dell'acido palmitico, che ha una lunga coda di alcano a catena. Pertanto, la caffeina viene trattenuta meno ed eluisce prima sulla colonna non polare del 95% di dimetilpolisilossano e del 5% di fenil-arilene (Figura 1).
- Dal cromatogramma è possibile calcolare le aree di picco. Le aree di picco sono proporzionali alla massa di carbonio che passa attraverso il rivelatore e possono essere utilizzate per effettuare una curva di calibrazione della risposta dello strumento rispetto alla concentrazione. Per la Figura 1,l'area di picco è 27.315 per la caffeina e 18.852 per l'acido palmitico.
- Una misura dell'efficienza della colonna è N, il numero di piastre teoriche. N può essere calcolato dal cromatogramma per ogni picco. Per la Figura 1,N è 283.000 per la caffeina e 261.000 per l'acido palmitico.
- La Figura 2 mostra l'effetto della temperatura sulle separazioni isotermiche. Due separazioni sono sovrapposte dello stesso campione di caffeina e acido palmitico. Il primo è a 180 °C e il secondo a 200 °C. I tempi di ritenzione sono molto più piccoli per la maggiore temperatura.
Figura 1. Analisi GC-FID di campioni di caffeina e acido palmitico. Lo standard di caffeina 5 mM eluisce per primo, seguito dal campione di acido palmitico da 1 mM. La rampa di temperatura era di 0,1 minuti a 150 °C seguita da una rampa a 10 °C/min a 220 °C dove la temperatura veniva mantenuta per 5 minuti.
Figura 2. Analisi GC-FID delle corse isotermiche di un campione di caffè tostato scuro. Un confronto tra GC-FID funziona a 180 °C e 200 °C per un campione di caffè tostato scuro. I picchi si eluiscono molto più velocemente con la temperatura di 200 °C.
Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia
La gascromatografia (GC) viene utilizzata per separare e rilevare composti di pic…
1. Inizializzazione del CG
- Accendere il gas e l'aria di trasporto dell'elio e regolare i manometri sullo strumento.
- Accendere il forno a colonna ad alta temperatura (in genere 250 °C o superiore) per cuocere nella colonna. Non superare la temperatura massima della colonna. Questo rimuoverà eventuali contaminanti. Lasciare cuocere per almeno 30 minuti prima di eseguire un campione.
2. Creazione di un file di metodi
- Nel software che controlla lo strumento, inserire tutti i valori desiderati per un file di metodi. Innanzitutto, imposta le impostazioni del autocampionatore. Impostare il numero di risciacqui pre-esecuzione, risciacqui post-esecuzione e risciacqui con campione. Questi risciacqui puliscono la colonna tra diversi campioni.
- La quantità iniettata è in genere di 1 μL. Di solito viene impostato un rapporto di divisione perché l'iniezione di tutto un campione potrebbe sovraccaricare la colonna. Se il rapporto di divisione è 100:1, ciò significa che per ogni 1 parte che viene iniettata nello strumento 100 parti vanno sprecate.
- Immettere i parametri della fase mobile. La portata è controllata dalla pressione impostata. Portate più elevate portano a separazioni più rapide, ma c'è meno tempo per l'analita di interagire con la colonna.
- Immettere la programmazione della temperatura. Per una corsa isotermica, inserire la temperatura della separazione e quindi un tempo per la separazione. Per un'eluizione del gradiente, immettere la temperatura iniziale e il tempo di attesa, la temperatura finale e il tempo di attesa e la velocità di rampa in °C/min. Viene inoltre impostato un tempo di equilibrio che consente alla colonna di raffreddare la temperatura originale tra una corsa e l'altra.
- Immettere i parametri del rilevatore. Verranno inserite una temperatura e una frequenza di campionamento del rilevatore. Il rivelatore deve avere sempre una temperatura superiore alla temperatura della colonna in modo che nessun analita si condensi sul rivelatore.
- Salvare il file dei metodi. Potrebbe anche essere necessario scaricare i parametri in modo che vengano letti dal GC.
3. Raccolta dei dati delle CG
- Accendere l'idrogeno gassoso e assicurarsi che il manometro sia impostato correttamente. Accendi la fiamma del FID.
- Sul rack dell'autocampionatore, riempire il flaconcino di lavaggio con solvente di lavaggio, come acetonitrile o metanolo. Assicurarsi che il flaconcino di scarico sia vuoto.
- Preparare il campione. Se c'è qualche possibilità di particolato nel campione, filtrare il campione. Poiché a volte si possono vedere residui di plastica con GC, utilizzare solo siringhe di vetro e flaconcini di vetro per preparare il campione.
- Riempire il flaconcino almeno a metà strada con il campione in modo che la siringa autocampionatore sia assicurata per raccogliere il campione. I flaconcini dell'autocampionatore sono in genere di 2 ml, ma se il volume del campione è limitato, sono disponibili inserti del flaconcino per ridurre il volume del campione necessario.
- Caricare il flaconcino o i flaconcini campione nel rack dell'autocampionatore. Tieni traccia della posizione in cui si trova ogni campione.
- Prima dell'esecuzione, azzerare la linea di base del registratore grafico sul software del computer.
- I file possono essere raccolti come singola esecuzione o utilizzando una tabella batch per più esecuzioni. Assicurarsi di specificare il numero di flaconcino corretto per il campione. Premi il pulsante "start" e crea un file.
- I dati vengono in genere analizzati con un programma software. I parametri che possono essere misurati includono il tempo di ritenzione, l'altezza del picco, l'area del picco e il numero di piastre teoriche.
4. Risultati: Analisi GC di campioni di caffè
- In questo esempio, l'analisi GC-FID è stata eseguita per la caffeina e l'acido palmitico, due composti presenti nel caffè. La caffeina è meno polare dell'acido palmitico, che ha una lunga coda di alcano a catena. Pertanto, la caffeina viene trattenuta meno ed eluisce prima sulla colonna non polare del 95% di dimetilpolisilossano e del 5% di fenil-arilene (Figura 1).
- Dal cromatogramma è possibile calcolare le aree di picco. Le aree di picco sono proporzionali alla massa di carbonio che passa attraverso il rivelatore e possono essere utilizzate per effettuare una curva di calibrazione della risposta dello strumento rispetto alla concentrazione. Per la Figura 1,l'area di picco è 27.315 per la caffeina e 18.852 per l'acido palmitico.
- Una misura dell'efficienza della colonna è N, il numero di piastre teoriche. N può essere calcolato dal cromatogramma per ogni picco. Per la Figura 1,N è 283.000 per la caffeina e 261.000 per l'acido palmitico.
- La Figura 2 mostra l'effetto della temperatura sulle separazioni isotermiche. Due separazioni sono sovrapposte dello stesso campione di caffeina e acido palmitico. Il primo è a 180 °C e il secondo a 200 °C. I tempi di ritenzione sono molto più piccoli per la maggiore temperatura.
Figura 1. Analisi GC-FID di campioni di caffeina e acido palmitico. Lo standard di caffeina 5 mM eluisce per primo, seguito dal campione di acido palmitico da 1 mM. La rampa di temperatura era di 0,1 minuti a 150 °C seguita da una rampa a 10 °C/min a 220 °C dove la temperatura veniva mantenuta per 5 minuti.
Figura 2. Analisi GC-FID delle corse isotermiche di un campione di caffè tostato scuro. Un confronto tra GC-FID funziona a 180 °C e 200 °C per un campione di caffè tostato scuro. I picchi si eluiscono molto più velocemente con la temperatura di 200 °C.
La gascromatografia, o GC, è una tecnica utilizzata per separare, rilevare e quantificare piccoli composti volatili in fase gassosa.
Nella GC, i campioni liquidi vengono vaporizzati, quindi trasportati da un gas inerte attraverso una colonna lunga e sottile. Gli analiti vengono separati in base alla loro affinità chimica con un rivestimento all'interno della colonna.
Poiché la GC richiede che gli analiti vengano vaporizzati in fase gassosa, lo strumento è ideale per sostanze chimiche volatili e non polari con una massa inferiore a 1.000 dalton. Per le molecole più grandi, acquose o polari difficili da vaporizzare, la cromatografia liquida è un'alternativa utile. Questo video introdurrà le basi della gascromatografia e illustrerà i passaggi necessari per analizzare le specie chimiche in un campione di miscela non acquosa utilizzando un gascromatografo.
Lo strumento GC si compone di cinque componenti essenziali. Innanzitutto, viene utilizzata una porta di iniezione per introdurre il campione nello strumento. Successivamente, una camera di riscaldamento vaporizza il campione e lo mescola con un gas inerte. Il gas inerte, come l'elio o l'azoto, trasporta il campione vaporizzato attraverso il sistema. Combinati, il gas di trasporto e il campione costituiscono la fase mobile. Successivamente, la fase mobile entra nella colonna riscaldata, separando gli analiti durante il loro passaggio. Infine, un rivelatore registra i gas quando escono dalla colonna, o eluiscono, e invia i dati a un computer per l'analisi. Il componente più critico dello strumento è la colonna. La colonna è un capillare con una matrice di fase stazionaria che riveste le pareti interne. In alternativa, le colonne possono essere imballate con perline rivestite a matrice. La fase stazionaria è solitamente polidimetilsilossano modificato, ideale per risolvere molecole non polari. Le sue proprietà di separazione sono affinate aggiungendo il 5-10% di gruppi fenile, cianopropilico o trifluoropropilico.
Gli analiti con bassa affinità chimica per la fase stazionaria si muovono rapidamente attraverso la colonna, mentre le molecole con alta affinità vengono rallentate durante l'adsorbimento sulle pareti della colonna. Il periodo di tempo che un composto trascorre all'interno della colonna è chiamato tempo di ritenzione, o Rt, e consente di identificare i composti. Il rivelatore si trova all'estremità della colonna e registra i gas mentre eluscono. Il rilevamento a ionizzazione di fiamma, o FID, è ampiamente utilizzato perché rileva gli ioni carbonio, consentendogli di rilevare praticamente qualsiasi composto organico. Nella FID, gli analiti bruciano in una fiamma idrogeno-aria quando escono dalla colonna, producendo ioni carbonio che inducono una corrente negli elettrodi vicini. La corrente è direttamente proporzionale alla massa del carbonio, quindi è possibile determinare la concentrazione del composto. Il risultato finale è un cromatogramma, che è un grafico del segnale FID rispetto al tempo, che mostra ogni componente eluito mentre esce dalla colonna. Idealmente, ogni picco avrà una forma simmetrica e gaussiana. Le caratteristiche asimmetriche, come il picco di coda e il fronte del picco, possono essere dovute a sovraccarico, problemi di iniezione o la presenza di gruppi funzionali che si attaccano alla colonna, come gli acidi carbossilici.
Ora che sono stati discussi i principi della gascromatografia, diamo un'occhiata a come effettuare e analizzare un'analisi gascromatografica in laboratorio.
Prima di eseguire un esperimento, accendi il serbatoio del gas elio. Aprire il software sul computer, quindi cuocere la colonna per rimuovere eventuali contaminanti. Impostare il forno ad una temperatura elevata, in genere 250 ? C o superiore, e cuocere la colonna per almeno 30 min.
Quindi, regolare le impostazioni dell'autocampionatore. Impostare il numero di risciacqui pre e post corsa per pulire la colonna tra i campioni.
Utilizzare un volume di campione di 1 ? L e impostare l'impostazione del rapporto di divisione per programmare lo strumento in modo che accetti solo una frazione dell'ingresso. Regolare la portata del gas di trasporto e utilizzare le impostazioni stabilite o per tentativi ed errori per trovare la pressione ideale.
Ora inserisci le impostazioni di temperatura per l'esperimento. Per un tratto isotermico, inserire la temperatura e il tempo per la separazione. In alternativa, per un gradiente di temperatura, inserire la temperatura iniziale e il tempo di mantenimento, la temperatura finale e il tempo di mantenimento e la velocità di rampa in ? C al minuto.
Imposta il tempo di raffreddamento della colonna tra una corsa in gradiente o isotermica.
Infine, impostare la frequenza di campionamento e la temperatura del rivelatore. Il rilevatore deve essere sempre più caldo della colonna per evitare la formazione di condensa. Dopo aver programmato tutte le impostazioni, salvare il file dei metodi.
Attivare il rilevatore aprendo la valvola del serbatoio dell'idrogeno e accendere la fiamma del FID. Lo strumento è ora pronto per l'analisi dei campioni.
Per far scorrere il campione sul GC, riempire prima una fiala con un solvente di lavaggio, come acetonitrile o metanolo. Preparare il campione, assicurandosi di utilizzare siringhe e fiale di vetro poiché i residui di plastica possono contaminare il GC.
Aggiungere ora il campione preparato in una fiala con una pipetta. Riempire almeno a metà, in modo che la siringa dell'autocampionatore sia completamente sommersa. Quindi, caricare le fiale di lavaggio e di campionamento nel rack dell'autocampionatore. Prima di eseguire il campione, azzerare la linea di base del cromatogramma sul software del computer. I dati possono essere raccolti come una singola esecuzione o utilizzando una tabella batch per più esecuzioni. Premere "start" per eseguire il campione.
In questo esempio, i livelli di caffeina e acido palmitico nel caffè sono stati analizzati utilizzando GC con FID. La caffeina è più piccola e meno polare, quindi è meno attratta dalla colonna ed eluisce per prima. L'acido palmitico, che ha una lunga coda a catena alcanaria, eluisce più tardi a causa di una maggiore affinità con la fase stazionaria.
Poiché le dimensioni dei picchi sono proporzionali alla massa del carbonio, la concentrazione di ciascun componente può essere determinata dalla rispettiva area del picco sul cromatografo e confrontata con gli standard di concentrazione noti.
È stato anche esplorato l'effetto della temperatura della colonna. A 200 ? C, i campioni si sono mossi attraverso la colonna due volte più velocemente rispetto al campione eseguito a 180 °C. Si noti che mentre le altezze dei picchi cambiano, l'area sotto la curva rimane costante.
La GC è una tecnica importante per l'analisi chimica ed è ampiamente utilizzata in applicazioni scientifiche, commerciali e industriali.
A causa della semplicità della GC, i chimici la usano abitualmente per monitorare le reazioni chimiche e la purezza del prodotto. Le reazioni possono essere campionate nel tempo per mostrare la formazione del prodotto e l'esaurimento dei reagenti. Il cromatografo rivela le concentrazioni del prodotto e anche la presenza di prodotti non intenzionali o collaterali.
La GC è comunemente utilizzata in tandem con la spettrometria di massa, chiamata GS-MS, per identificare in modo inequivocabile le sostanze chimiche nei campioni o nell'aria. La spettrometria di massa, o MS, separa le molecole in base al loro rapporto massa/carica e consente di determinare l'identità dei composti. La GC-MS è uno strumento potente, in quanto la GC separa prima le miscele complesse in singoli componenti e la MS fornisce informazioni precise sulla massa e sull'identità chimica.
Il GC viene utilizzato di routine nel monitoraggio dell'aria per rilevare composti organici volatili, o COV, che possono derivare da inquinamento ambientale, pesticidi ed esplosivi. Il GC può essere utilizzato per tracciare e identificare i COV sia all'interno per l'analisi dello spazio di testa che all'esterno, per la salute, la sicurezza e la protezione.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla gascromatografia con FID. A questo punto è necessario comprendere i principi di base della gascromatografia e della rilevazione FID.
Grazie per l'attenzione!
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Q1: What types of compounds are best analyzed using gas chromatography?
Gas chromatography is ideally suited for small volatile, nonpolar compounds less than 1,000 daltons in mass. GC requires analytes to vaporize into the gas phase, making it perfect for non-aqueous solutions. For larger, aqueous, or polar molecules that are difficult to vaporize, liquid chromatography is a more useful alternative.
Q2: How does the stationary phase in a GC column separate different compounds?
Analytes separate based on their chemical affinity with the stationary phase coating the column's inner walls. Compounds with low affinity move quickly through the column, while molecules with high affinity are slowed as they adsorb to the column walls. The time a compound spends in the column, called retention time, allows compounds to be identified and distinguished from one another.
Q3: What is flame-ionization detection and how does it quantify compounds?
Flame-ionization detection (FID) combusts analytes in a hydrogen-air flame as they exit the column, producing carbon ions that induce a current in nearby electrodes. The current is directly proportional to carbon mass, allowing compound concentration to be determined. FID is widely used because it detects virtually any organic compound and is unaffected by noncombustible gases and water.
Q4: What does a chromatogram show and what do peak shapes indicate?
A chromatogram is a plot of FID signal versus time, showing each eluted component as a peak. Ideally, each peak has a symmetrical, Gaussian shape. Asymmetrical features like peak tailing and peak fronting can indicate overloading, injection problems, or the presence of functional groups such as carboxylic acids that stick to the column.
Q5: How does temperature affect sample separation in gas chromatography?
Increasing column temperature accelerates sample movement through the column. At higher temperatures, samples move faster, reducing analysis time. However, peak heights may change while the area under the curve remains constant, preserving quantitative accuracy. Temperature can be held constant for isothermal runs or programmed as a gradient for more complex separations.
Q6: What are the key steps for preparing and running a GC sample?
Fill a vial with wash solvent like acetonitrile or methanol, then prepare your sample using glass syringes and vials to avoid plastic contamination. Add the sample to a vial with a pipette, filling at least halfway so the autosampler syringe is fully submerged. Load vials into the autosampler rack, zero the baseline on the computer, and press start to begin the analysis.
Q7: How is GC combined with other techniques for chemical identification?
GC is commonly used in tandem with mass spectrometry, called GC-MS, to unambiguously identify chemicals in samples. GC first separates complex mixtures into individual components, while mass spectrometry separates molecules based on their mass-to-charge ratio, providing precise mass information and chemical identity. This combination is a powerful tool for environmental monitoring and chemical analysis.
Capitoli in questo video
0:00
Overview
1:06
Principles of Gas Chromatography
3:54
Instrument Initialization
5:37
Running the GC
6:32
Representative Results: Quantification of Caffeine and Palmitic Acid in Coffee
7:28
Applications
8:59
Summary