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I virus sono particelle biologiche infettive responsabili di molte malattie, raffreddore e influenza, epatite e HIV.
I virus sono particelle biologiche costituite da un genoma di DNA o RNA, avvolte all'interno di un rivestimento proteico noto come capside, a volte con un involucro lipidico aggiuntivo. I virus non hanno alcuna capacità metabolica o riproduttiva da soli e devono invadere le cellule viventi e dirottare il loro macchinario cellulare per fare più copie di se stessi.
Sia le cellule procariotiche, come i batteri, sia le cellule eucariotiche, come quelle dell'uomo, possono essere infettate da specifiche classi di virus. In particolare, i batteriofagi sono virus che infettano i batteri. Ad esempio, i colifagi sono quei fagi che infettano E. coli, un comune batterio intestinale, alcuni ceppi dei quali possono causare intossicazione alimentare e che è un'indicazione di contaminazione fecale dell'approvvigionamento idrico.
Sebbene i fagi stessi non siano generalmente noti per essere patogeni nell'uomo, ci sono prove che sono indicatori surrogati affidabili per gli enterovirus che causano malattie che sono anche trasmessi per via fecale ma difficili da analizzare. La disponibilità di metodi relativamente rapidi ed economici per enumerare i batteriofagi li rende uno strumento interessante per la valutazione della contaminazione fecale nei campioni ambientali.
Questo video introdurrà i principi alla base dell'enumerazione dei fagi; dimostrare un protocollo per quantificare i fagi, noto come saggio della placca; e infine, esplorare diverse applicazioni delle scienze ambientali per il rilevamento e il conteggio di fagi e altri virus.
I batteriofagi, come tutti i virus, devono parassitare le cellule viventi, in questo caso i batteri, per potersi riprodurre.
I fagi lo fanno atterrando e attaccandosi alla superficie della cellula batterica e iniettando il loro materiale genetico nella cellula. Una volta all'interno della cellula, il genoma virale viene replicato e vengono prodotti i componenti proteici del capside virale, entrambi utilizzando il macchinario biochimico della cellula ospite. Una volta assemblate, le particelle di fago vengono rilasciate dai batteri, spesso lizzando l'ospite ed esplodendo, uccidendo la cellula ospite nel processo.
Un metodo ampiamente utilizzato per determinare la concentrazione di fagi in un campione sfrutta questa attività litica. In questa tecnica, il fago del campione viene mescolato con batteri e agar molle. Questa miscela viene versata su piastre di Petri con agar normale come substrato e lo strato superiore forma una sovrapposizione.
I batteri sono ad una concentrazione così alta da formare un prato continuo. I batteri dovrebbero essere ottenuti da colture che si trovano nella fase logaritmica di crescita, per garantire che ogni batterio che i fagi infettano sia vivo e consenta al fago di produrre progenie.
Quando una particella di fago infetta e lisa un batterio, la progenie del fago si diffonderà alle cellule batteriche vicine e continuerà l'infezione. L'agar morbido limita la diffusione delle particelle fagiche. Alla fine, si formerà un'area di radura, nota come placca.
Se il fago viene diluito a una concentrazione sufficientemente bassa, si possono osservare placche individuali discrete sul prato batterico. Questi possono essere contati e utilizzati per calcolare il numero di unità formanti placche, o PFU, di fago per ml del campione originale.
Ora che hai capito come i fagi infettano i batteri e come questa attività può essere utilizzata per misurare la concentrazione dei fagi, esaminiamo un protocollo per l'utilizzo di un test della placca per enumerare i fagi nei campioni di acqua ambientale.
Un giorno prima di eseguire il test, inoculare una colonia di E. coli ceppo ATCC 15597 in 100 mL di brodo di soia tripticasi in un pallone di Erlenmeyer da 250 mL. Incubarlo con agitazione a 35 ? C durante la notte.
3 ore prima del saggio, inoculare 1 mL di coltura di E. coli durante la notte in 100 mL freschi di brodo. Metti questa nuova coltura in un bagno d'acqua agitante a una temperatura compresa tra 35 e 37 °C. Ciò garantisce che i batteri si trovino nella fase logaritmica di crescita all'inizio del test.
Per iniziare il test della placca, eseguire diluizioni seriali di 10 e 100 volte del campione d'acqua, utilizzando 9 mL di tampone Tris.
Usando un bagno di vapore, sciogliere tre provette da 5 ml di agar soft top allo 0,7%, tripticasi di soia o agar nutriente. Una volta sciolto, mettere a bagnomaria a 45-48 ? C per almeno 15 minuti affinché la temperatura dell'agar scenda a 45 °C.
Alla prima provetta di agar morbido, aggiungere 1 mL della coltura di E. coli in fase loglogaritmica precedentemente preparata e 1 mL del campione di acqua non diluita. Rimuovere il tubo dal bagnomaria e farlo oscillare delicatamente tra le mani per 2-3 secondi per mescolare la sospensione.
Versare l'agar morbido su una capsula di Petri precedentemente preparata con tripticasi di soia o agar nutriente. Ruotare rapidamente la piastra per stenderla, assicurandosi che copra l'intera superficie.
Ripetere l'inoculazione e la placcatura per le altre due provette, utilizzando 1 mL di ciascuno dei campioni diluiti.
Una volta che l'agar superiore si è solidificato, capovolgere le piastre e incubarle a 37 ? C per 48 h.
Dopo l'incubazione, contare il numero di piaghe su ogni piastra. Dal conteggio, calcolare la concentrazione di fagi nel campione originale
Ad esempio, se 9 placche sono state ottenute dalla piastra di diluizione 10 volte, allora ci sono 9 volte 10 diviso per 1 mL, o 90 PFU/mL di colifago nel campione d'acqua originale.
Ora che hai visto come vengono eseguiti i test della placca fagica, diamo un'occhiata a come i test della placca possono essere utilizzati per enumerare i fagi e altri tipi di virus da una varietà di fonti.
I metodi basati sul dosaggio della placca possono essere utilizzati per isolare i batteriofagi da diversi campioni ambientali come il suolo. In questo esempio, i ricercatori hanno prima raccolto fagi dal suolo mediante filtrazione. Il fago è stato poi utilizzato per infettare il comune batterio del suolo Arthrobacter in un test della placca. I fagi sono stati prelevati da singole placche e striati su nuove piastre di agar, e poi ricoperti con agar superiore contenente batteri. La concentrazione di fagi diminuisce lungo la lunghezza della striscia, in modo che si possano ottenere placche discrete, probabilmente formate da un singolo tipo di fago. Queste singole placche potrebbero quindi essere raccolte per analizzare ulteriormente i fagi all'interno.
Oltre ai batteriofagi, i saggi di placca possono essere eseguiti anche con altri virus, compresi quelli, come l'influenza, che infettano i mammiferi. Per fare ciò, le cellule di mammifero vengono prima coltivate come monostrati in piastre di coltura tissutale. I terreni contenenti i virus vengono quindi aggiunti alle cellule per consentire l'infezione, prima che le cellule vengano ricoperte con un mezzo immobilizzante come l'agarosio gelatinoso. Dopo un periodo di incubazione che può durare fino a due settimane, le cellule infette vengono fissate e colorate per consentire la visualizzazione e il conteggio delle placche.
Infine, oltre ai campioni raccolti dall'ambiente, i saggi della placca sono utili per rilevare ed enumerare i virus nei campioni di tessuto di individui infetti. Qui, i ricercatori hanno ottenuto e omogeneizzato tessuti polmonari da topi infettati da gamma-herpesvirus. Questo omogenato contenente virus è stato poi utilizzato per infettare la coltura cellulare di mammifero. Il numero di placche potrebbe quindi essere contato per fornire una stima del titolo virale nei tessuti polmonari infetti.
Hai appena visto il video di JoVE sulla rilevazione di batteriofagi in campioni ambientali. A questo punto è necessario comprendere la biologia di base dei fagi, come eseguire un test di placca per quantificare i fagi in un campione ambientale e come i test di placca possono essere utilizzati per studiare fagi e altri virus in campioni ambientali o clinici. Come sempre, grazie per la visione!
