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Rilevamento di batteriofagi in campioni di matrici ambientali

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Detection of Bacteriophages in Environmental Samples

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.13: Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

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09:17 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba – Università dell’Arizona
Autore dimostrativo: Alex Wassimi

I virus sono un gruppo unico di entità biologiche che infettano sia gli organismi eucariotici che procariotici. Sono parassiti obbligati che non hanno capacità metabolica e, per replicarsi, si basano sul metabolismo dell’ospite per produrre parti virali che si auto-assemblano all’interno delle cellule ospiti.

I virus sono ultramicroscopici, troppo piccoli per essere visti con il microscopio ottico, visibili solo con la maggiore risoluzione del microscopio elettronico. Una particella virale è costituita da un genoma di acido nucleico, DNA o RNA, circondato da un rivestimento proteico, noto come capside, composto da subunità proteiche o capsomeri. In alcuni virus più complessi, il capside è circondato da un involucro lipidico aggiuntivo e alcuni hanno appendici superficiali o code simili a punte.

I virus che infettano il tratto intestinale di esseri umani e animali sono noti come virus enterici. Sono escreti nelle feci e possono essere isolati dalle acque reflue domestiche. I virus che infettano i batteri sono noti come batteriofagi e quelli che infettano i batteri coliformi sono chiamati colifagi (Figura 1). I fagi dei batteri coliformi si trovano ovunque si trovino i batteri coliformi.

Figura 1. Colifago T2.

Principles

I batteriofagi sono studiati nelle scienze ambientali perché sono una componente critica dei sistemi biologici. Sono l’entità biologica più abbondante sulla terra e sono importanti perché aiutano a controllare le popolazioni batteriche, i processi della rete alimentare, i cicli biogeochimici, oltre a migliorare la diversità procariotica attraverso il trasferimento genico orizzontale. Ci sono anche prove che i fagi sono indicatori surrogati affidabili per i virus enterici che causano malattie che sono anche trasmessi fecalmente ma difficili da misurare. La disponibilità di metodi relativamente rapidi ed economici per enumerare i batteriofagi li rende uno strumento interessante per la valutazione della contaminazione fecale nei campioni ambientali.

I colifagi in acqua vengono analizzati mediante l’aggiunta di un campione all’agar morbido o sovrapposto insieme a una coltura di E. coli nella fase di log della crescita. Il fago si attacca alla cellula batterica e lisi i batteri. I batteri producono un prato confluente di crescita ad eccezione delle aree in cui il fago è cresciuto e ha llisi dei batteri. Queste aree chiare risultanti sono conosciute come placche. Una sovrapposizione di agar morbido viene utilizzata per limitare la diffusione fisica dei virus in modo che, dopo la lisi da un batterio, possano diffondersi solo alle cellule batteriche vicine.

Per ottenere una formazione ottimale della placca è importante che i batteri ospiti si trovano nella fase di log della crescita. Ciò garantisce che tutti i fagi si attacchino a batteri vivi e producano progenie. Ciò richiede che una coltura di batteri ospiti sia preparata ogni giorno che viene eseguito un test. Di solito, una coltura viene incubata il giorno prima del test in modo che sia nella fase stazionaria. Il giorno del test, la coltura viene utilizzata per inoculare un brodo, che viene incubato per ottenere un numero sufficiente di batteri ospiti nella fase di log per il test (questo di solito richiede 2-3 ore di incubazione in un bagno d’acqua agitato a 35-37 ° C).

Procedure

Ottenere un campione di acque reflue o acqua contenente colifagi.
Diluire il campione 1:10 e 1:100 utilizzando il buffer Tris. Fallo trasferendo 1,0 ml di coltura a 9 ml di tampone Tris e quindi effettuando una seconda diluizione di 10 volte.
Sciogliere tre tubi di agar morbido (0,7% di agar nutriente o agar di soia triptasi per tubo da 3 ml) mettendoli in un bagno di vapore o in autoclave.
Mettere l’agar a bagnomaria a 45-48 °C per 15 minuti per consentire alla temperatura dell’agar di adattarsi a 45 °C.
Alla prima provetta, aggiungere 1 mL di una coltura di brodo in fase logaritmica di E. coli¹ e 1 mL di campione non diluito.
Rimuovere il tubo dal bagno d’acqua e oscillare delicatamente tra le mani per mescolare la sospensione per 2-3 s.
Pulire l’acqua dal tubo con un tovagliolo di carta e versare l’agar su una capsula di Petri precedentemente preparata contenente agar inferiore (agar nutriente regolare o agar di soia triptasi).
Ruotare rapidamente la piastra per stendere l’agar superiore. Assicurati che l’agar copra l’intera superficie.
Ripetere i passaggi 5-8 con gli altri due tubi di agar morbido, utilizzando 1 mL di batteri e 1 mL di diluizione del campione (Figura 2).
Dopo che l’agar si è solidificato, invertire le piastre di Petri e incubare a 37 °C per 48 ore. Eliminare l’umidità dal coperchio della capsula di Petri. Se una goccia di umidità cade su una placca, causerà la diffusione del virus sulla superficie dell’agar.
Dopo l’incubazione, contare il numero di placche su ogni diluizione (Figura 3) e calcolare la concentrazione di fagi nel campione originale. Registrare eventuali differenze importanti nelle dimensioni o nell’aspetto delle placche.

Figura 2. Procedura per la preparazione di un prato batterico utilizzando l’agar superiore per l’enumerazione dei colifagi.

Figura 3. Placche fagiche su un prato batterico.

¹E. coli ceppo ATCC 15597 di solito produce il maggior numero di placche da campioni di acque reflue. Deve essere coltivato durante la notte in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL contenente 100 mL di brodo di soia nutriente o triptasi e incubato in condizioni di agitazione a 35 °C. 3 ore prima del saggio fagico inoculare un mL di questa coltura in un matraccio fresco contenente 100 ml di brodo di soia nutriente o triptasi e posto in un bagno d’acqua tremante a 35-37 °C. Ciò garantirà che i batteri siano nella fase di log della crescita.

I virus sono particelle biologiche infettive che sono responsabili di molte malattie, raffreddore e influenza, per l’epatite e l’HIV.

I virus sono particelle biologiche costituite da un genoma di DNA o RNA, avvolto all’interno di un rivestimento proteico noto come capside, a volte con un involucro lipidico aggiuntivo. I virus non hanno alcuna capacità metabolica o riproduttiva da soli e devono invadere le cellule viventi e dirottare i loro macchinari cellulari per fare più copie di se stessi.

Sia le cellule procariotiche, come i batteri, che le cellule eucariotiche, come quelle degli esseri umani, possono essere infettate da specifiche classi di virus. In particolare, i batteriofagi sono virus che infettano i batteri. Ad esempio, i colifagi sono quei fagi che infettano E. coli, un comune batterio intestinale, alcuni ceppi dei quali possono causare intossicazione alimentare e che è un’indicazione di contaminazione fecale dell’approvvigionamento idrico.

Mentre i fagi stessi non sono generalmente noti per essere patogeni negli esseri umani, ci sono prove che sono indicatori surrogati affidabili per gli enterovirus che causano malattie che sono anche trasmessi fecalmente ma difficili da misurare. La disponibilità di metodi relativamente rapidi ed economici per enumerare i batteriofagi li rende uno strumento interessante per la valutazione della contaminazione fecale nei campioni ambientali.

Questo video introdurrà i principi alla base dell’enumerazione dei fagi; dimostrare un protocollo per quantificare i fagi, noto come test della placca; e infine, esplorare diverse applicazioni di scienze ambientali per il rilevamento e il conteggio di fagi e altri virus.

I batteriofagi, come tutti i virus, devono parassitare le cellule viventi, in questo caso i batteri, per riprodursi.

I fagi lo fanno atterrando e attaccandosi alla superficie cellulare batterica e iniettando i loro materiali genetici nella cellula. Una volta all’interno della cellula, il genoma virale viene replicato e vengono prodotti i componenti proteici del capside virale, entrambi utilizzando il macchinario biochimico della cellula ospite. Una volta che le particelle di fagi sono assemblate, vengono rilasciate dai batteri, spesso lysing l’ospite e scoppiando, uccidendo la cellula ospite nel processo.

Un metodo ampiamente utilizzato per determinare la concentrazione di fagi in un campione sfrutta questa attività titica. In questa tecnica, il fago del campione viene miscelato con batteri e agar morbido. Questa miscela viene versata su piastre di Petri con agar normale come substrato e lo strato superiore forma una sovrapposizione.

I batteri sono ad una concentrazione così alta che formano un prato continuo. I batteri dovrebbero essere ottenuti da una coltura che si trova nella fase di log della crescita, per garantire che ogni batterio che i fagi infettano sia vivo e consenta al fago di produrre progenie.

Quando una particella fagica infetta e lisi un batterio, la progenie del fago si diffonderà alle cellule batteriche vicine e continuerà l’infezione. L’agar morbido limita la diffusione delle particelle fagiche. Alla fine, si formerà un’area di compensazione, nota come placca.

Se il fago viene diluito a una concentrazione abbastanza bassa, sul prato batterico si possono osservare placche individuali discrete. Questi possono essere contati e utilizzati per calcolare il numero di unità di formazione della placca, o PPU, di fagi per ml del campione originale.

Ora che hai capito come i fagi infettano i batteri e come questa attività può essere utilizzata per misurare la concentrazione dei fagi, passiamo attraverso un protocollo per l’utilizzo di un test della placca per enumerare i fagi nei campioni di acqua ambientale.

Un giorno prima di eseguire il test, inoculare una colonia di E. coli ceppo ATCC 15597 in 100 ml di brodo di soia triptasi in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL. Incubarlo con agitazione a 35 °C durante la notte.

3 ore prima del test, inoculare 1 mL della coltura notturna di E. coli in un fresco 100 mL di brodo. Mettere questa nuova cultura in un bagno d’acqua tremante ad una temperatura compresa tra 35 e 37 °C. Ciò garantisce che i batteri siano nella fase di log della crescita quando inizia il test.

Per avviare il test della placca, effettuare diluizioni seriali 10 e 100 volte del campione d’acqua, utilizzando 9 ml di tampone Tris.

Usando un bagno di vapore, sciogliere tre tubi da 5 ml di agar morbido al 0,7%, soia triptasi o agar nutriente. Una volta sciolto, porre a bagnomaria a 45-48 °C per almeno 15 minuti affinché la temperatura dell’agar scenda a 45 °C.

Al primo tubo di agar morbido, aggiungere 1 mL della coltura di E. coli in fase logaritmica precedentemente preparata e 1 mL del campione di acqua non diluita. Rimuovere il tubo dal bagno d’acqua e oscillare delicatamente tra le mani per 2-3 s per mescolare la sospensione.

Versare l’agar morbido su una capsula di Petri precedentemente preparata con soia triptasi o agar nutriente. Ruotare rapidamente la piastra per diffonderla, assicurandosi che copra l’intera superficie.

Ripetere l’inoculazione e la placcatura per gli altri due tubi, utilizzando 1 mL di ciascuno dei campioni diluiti.

Una volta che l’agar superiore si è solidificato, invertire i piatti e incubarli a 37 °C per 48 ore.

Dopo l’incubazione, conta il numero di piaghe su ogni piatto. Dal conteggio, calcolare la concentrazione di fagi nel campione originale

Ad esempio, se sono state ottenute 9 placche dalla piastra di diluizione 10 volte, allora ci sono 9 volte 10 divise per 1 ml o 90 PPU / mL di colifago nel campione di acqua originale.

Ora che hai visto come vengono eseguiti i test della placca fagica, diamo un’occhiata a come i saggi della placca possono essere utilizzati per enumerare i fagi e altri tipi di virus da una varietà di fonti.

I metodi basati sul test della placca possono essere utilizzati per isolare il batteriofago da diversi campioni ambientali come il suolo. In questo esempio, i ricercatori hanno prima raccolto i fagi dal suolo mediante filtrazione. Il fago è stato quindi utilizzato per infettare i comuni batteri del suolo Arthrobacter in un test della placca. I fagi sono stati prelevati da singole placche e striati su nuove piastre di agar, e poi sovrapposti con agar superiore contenente batteri. La concentrazione dei fagi diminuisce lungo la lunghezza della striscia, in modo da ottenere placche discrete, probabilmente formate da un singolo tipo di fago. Queste singole placche potrebbero quindi essere raccolte per analizzare ulteriormente i fagi all’interno.

Oltre ai batteriofagi, i saggi della placca possono essere eseguiti anche con altri virus, compresi quelli, come l’influenza, che infettano i mammiferi. Per fare questo, le cellule di mammifero vengono prima cresciute come monostrati in piatti di coltura tissutale. I mezzi contenenti i virus vengono quindi aggiunti alle cellule per consentire l’infezione, prima che le cellule siano sovrapposte con un mezzo immobilizzante come l’agarose gelatinoso. Dopo un periodo di incubazione che potrebbe durare fino a due settimane, le cellule infette vengono fissate e macchiate per consentire la visualizzazione e il conteggio delle placche.

Infine, oltre ai campioni raccolti dall’ambiente, i saggi della placca sono utili per rilevare ed enumerare i virus nei campioni di tessuto di individui infetti. Qui, i ricercatori hanno ottenuto e omogeneizzato tessuti polmonari da topi infetti da gamma-herpesvirus. Questo omogeneo contenente virus è stato quindi utilizzato per infettare la coltura cellulare di mammiferi. Il numero di placche potrebbe quindi essere contato per fornire una stima del titolo virale nei tessuti polmonari infetti.

Hai appena visto il video di JoVE sul rilevamento di batteriofagi in campioni ambientali. Ora dovresti capire la biologia di base dei fagi, come eseguire un test della placca per quantificare i fagi in un campione ambientale e come i saggi della placca possono essere utilizzati per studiare i fagi e altri virus in campioni ambientali o clinici. Come sempre, grazie per aver guardato!

Results

Diluizione del campione di acque reflue = 10^-1

Numero di placche ottenute = 9

Pertanto, concentrazione di fagi nel campione di acque reflue
= 10 x 9 ÷ 1 ml
= 90 unità formanti placche / mL

Le acque reflue grezze contengono in genere^{10 3} –^{10 4} colifagi per ml, con un intervallo di 10² – 10⁸ per ml.

Applications and Summary

Ci sono molte potenziali applicazioni dei colifagi come indicatori ambientali. Questi includono il loro uso come indicatori di contaminazione delle acque reflue, l’efficienza del trattamento delle acque e delle acque reflue e la sopravvivenza di virus e batteri enterici nell’ambiente. L’uso di batteriofagi come indicatori della presenza e del comportamento di batteri enterici e virus animali è sempre stato attraente a causa della facilità di rilevamento e del basso costo associato ai saggi fagici. Inoltre, possono essere quantificati in campioni ambientali entro 24 ore rispetto a giorni o settimane per i virus enterici.

¹E. coli ceppo ATCC 15597 di solito produce il maggior numero di placche da campioni di acque reflue. Deve essere coltivato durante la notte in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL contenente 100 mL di brodo di soia nutriente o triptasi e incubato in condizioni di agitazione a 35 °C. 3 ore prima del saggio fagico inoculare un mL di questa coltura in un matraccio fresco contenente 100 ml di brodo di soia nutriente o triptasi e posto in un bagno d’acqua tremante a 35-37 °C. Ciò garantirà che i batteri siano nella fase di log della crescita.

Transcript

Viruses are infectious biological particles that are responsible for many diseases, cold and flu, to hepatitis and HIV.

Viruses are biological particles consisting of either a DNA or RNA genome, wrapped inside a protein coat known as a capsid, sometimes with an additional lipid envelope. Viruses have no metabolic or reproductive ability on their own, and must invade living cells and hijack their cellular machinery in order to make more copies of themselves.

Both prokaryotic cells, such as bacteria, and eukaryotic cells, such as those of humans, can be infected by specific classes of viruses. Specifically, bacteriophages are viruses that infect bacteria. For example, coliphages are those phages that infect E. coli, a common gut bacterium, some strains of which can cause food poisoning, and which is an indication of fecal contamination of the water supply.

While phages themselves are not generally known to be pathogenic in humans, there is evidence that they are reliable surrogate indicators for disease-causing enteroviruses that are also fecally-transmitted but difficult to assay. The availability of relatively quick and inexpensive methods to enumerate bacteriophages makes them an attractive tool for the assessment of fecal contamination in environmental samples.

This video will introduce the principles behind phage enumeration; demonstrate a protocol for quantifying phages, known as the plaque assay; and finally, explore several environmental science applications for the detection and counting of phages and other viruses.

Bacteriophages, like all viruses, must parasitize living cells, in this case bacteria, in order to reproduce.

Phages do so by landing and attaching to the bacterial cell surface and injecting their genetic materials into the cell. Once inside the cell, the viral genome is replicated and the protein components of the viral capsid are produced, both using the host cell’s biochemical machinery. Once the phage particles are assembled, they are released from the bacteria, often by lysing the host and bursting out, killing the host cell in the process.

A widely used method for determining phage concentration in a sample takes advantage of this lytic activity. In this technique, the phage from the sample is mixed with bacteria and soft agar. This mixture is poured onto Petri dishes with regular agar as a substrate, and the top layer forms an overlay.

The bacteria are at such a high concentration that they form a continuous lawn. The bacteria should be obtained from culture that is in the log phase of growth, to ensure that every bacterium that the phages infect is alive and allows the phage to produce progeny.

When a phage particle infects and lyses a bacterium, the phage progeny will spread to nearby bacterial cells and continue the infection. The soft agar restricts the diffusion of the phage particles. Eventually, an area of clearing, known as a plaque, will be formed.

If the phage is diluted to a low enough concentration, then discrete, individual plaques can be observed on the bacterial lawn. These can be counted and used to calculate the number of plaque-forming units, or PFUs, of phage per mL of the original sample.

Now that you understand how phages infect bacteria and how this activity can be used to measure phage concentration, let’s go through a protocol for using a plaque assay to enumerate phages in environmental water samples.

One day before performing the assay, inoculate a colony of E. coli strain ATCC 15597 into 100 mL of trypticase soy broth in a 250-mL Erlenmeyer flask. Incubate it with shaking at 35 °C overnight.

3 h before the assay, inoculate 1 mL of the overnight E. coli culture into a fresh 100 mL of broth. Place this new culture into a shaking water bath at a temperature between 35 and 37 °C. This ensures that the bacteria are in the log phase of growth when the assay begins.

To start the plaque assay, make 10- and 100-fold serial dilutions of the water sample, using 9 mL of Tris buffer.

Using a steam bath, melt three 5-mL tubes of 0.7% soft top agar, either trypticase soy or nutrient agar. Once melted, place in a water bath at 45 to 48 °C for at least 15 min for the agar’s temperature to drop to 45 °C.

To the first tube of soft agar, add 1 mL of the previously prepared log-phase E. coli culture and 1 mL of the undiluted water sample. Remove the tube from the water bath and gently rock between your hands for 2-3 s to mix the suspension.

Pour the soft agar over a previously prepared Petri dish with trypticase soy or nutrient agar. Quickly rotate the plate to spread, making sure that it covers the entire surface.

Repeat the inoculation and plating for the other two tubes, using 1 mL of each of the diluted samples.

Once the top agar has solidified, invert the dishes and incubate them at 37 °C for 48 h.

After the incubation, count the number of plagues on each plate. From the count, calculate the phage concentration in the original sample

For example, if 9 plaques were obtained from the 10-fold dilution plate, then there are 9 times 10 divided by 1 mL, or 90 PFUs/mL of coliphage in the original water sample.

Now that you have seen how phage plaque assays are performed, let’s look at how plaque assays can be used to enumerate phage and other types of viruses from a variety of sources.

Plaque assay-based methods can be used to isolate bacteriophage from different environmental samples such as soil. In this example, researchers first collected phage from soil by filtration. The phage was then used to infect the common soil bacteria Arthrobacter in a plaque assay. Phages were picked from individual plaques and streaked onto new agar plates, and then overlaid with bacteria-containing top agar. Phage concentration decreases along the length of the streak, so that discrete plaques, likely formed by a single type of phage, might be obtained. These individual plaques could then be picked to further analyze the phages within.

In addition to bacteriophages, plaque assays can also be performed with other viruses, including those, such as influenza, that infect mammals. To do this, mammalian cells are first grown up as monolayers in tissue culture dishes. Media containing the viruses are then added to the cells to allow infection to occur, before the cells are overlaid with an immobilizing medium such as the gel-like agarose. After an incubation period that could last up to two weeks, the infected cells are fixed and stained to allow the plaques to be visualized and counted.

Finally, in addition to samples collected from the environment, plaque assays are useful for detecting and enumerating viruses in tissue samples from infected individuals. Here, researchers obtained and homogenized lung tissues from mice infected with gamma-herpesviruses. This virus-containing homogenate was then used to infect mammalian cell culture. The number of plaques could then be counted to provide an estimate for the viral titer in the infected lung tissues.

You have just watched JoVE’s video on the detection of bacteriophages in environmental samples. You should now understand the basic biology of phages, how to perform a plaque assay to quantitate phages in an environmental sample, and how plaque assays can be used to study phages and other viruses in environmental or clinical samples. As always, thanks for watching!