Cromatografia su colonna
Fonte: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
La cromatografia su colonna è una delle tecniche più utili per purificare i composti. Ques…
1. Liquame di gel di silice
- Versare il gel di silice in un matraccio Erlenmeyer. Il peso del materiale d'imballaggio deve essere circa 50 volte quello del campione da separare. Se i composti separati hanno valori Rf molto simili, potrebbe essere necessario utilizzare una maggiore quantità di silice per campione, come nel caso di questo esempio.
- Posizionare 10 g di silice nel matraccio Erlenmeyer, poiché 50 mg di campione (45 mg di fluorenone e 5 mg di tetrafenilporfirina) vengono isolati.
- Aggiungere il sistema solvente (esano/diclorometano, 70%: 30%) al matraccio Erlenmeyer contenente il gel di silice. Aggiungere abbastanza solvente per garantire che tutto il gel di silice sia ben solvatato. La silice non si dissolverà, ma la miscela sarà visivamente evidente quando viene solvata. Una volta aggiunto il solvente, ruotare il matraccio Erlenmeyer per garantire che tutta la silice sia ben solvata.
2. Preparazione della colonna
- Selezionare la colonna di dimensioni appropriate. In genere la colonna deve essere riempita circa a metà strada con liquame di gel di silice. Più grande è il campione da purificare, maggiore è la colonna richiesta.
- Tappare il fondo della colonna con un pezzo di lana di vetro. Usando un'asta lunga, assicurati che la lana sia saldamente alloggiata nella parte inferiore della colonna appena sopra il rubinetto.
- Una volta che la lana è saldamente in posizione, applicare un sottile strato di sabbia sulla lana di vetro.
Nota: Se la colonna è dotata di una fritta di vetro sopra il rubinetto, questo passaggio dovrebbe essere omesso. - Bloccare la colonna in posizione verticale a un supporto ad anello.
- Usando un imbuto, versare delicatamente il liquame preparato di gel di silice nella colonna. Potrebbe essere necessario aggiungere ulteriore solvente per trasferire il liquame dal matraccio Erlenmeyer alla colonna. Usando una pipetta, lavare qualsiasi gel di silice che si attacca ai lati della colonna.
- Mentre il gel di silice si deposita nella colonna, picchiettare delicatamente i lati della colonna per assicurarsi che il gel di silice si impacchetta strettamente ed escluda eventuali bolle d'aria.
- Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente si scarichi in un matraccio Erlenmeyer pulito fino a poco prima che il gel di silice e il fronte del solvente si incontrino. Il gel di silice non dovrebbe mai asciugarsi fino al completamento della procedura.
- Posizionare un sottile strato di sabbia sopra il gel di silice (Figura 1). Usando una pipetta, lavare via tutta la sabbia che potrebbe essersi attaccata ai lati della colonna.
- Scolare qualsiasi solvente aggiuntivo fino a quando la sabbia non è asciutta, ma non fino allo strato di gel di silice.
Figura 1. La configurazione corretta per un esperimento di cromatografia su colonna prima dell'aggiunta del campione.
3. Aggiunta dell'esempio alla colonna
- Sciogliere il campione nella minor quantità possibile di solvente (utilizzando lo stesso solvente utilizzato per produrre il liquame di gel di silice).
- Utilizzando una pipetta, aggiungere delicatamente il campione nella parte superiore della colonna.
- Una volta che il campione è stato applicato sulla parte superiore della colonna, aprire il rubinetto e lasciare che il solvente dreni attraverso lo strato di sabbia ma non lo strato di gel di silice. Utilizzare una quantità molto piccola di solvente per lavare qualsiasi campione che potrebbe essersi aggrappato ai lati della colonna. Scolare questo solvente aggiuntivo anche attraverso lo strato di sabbia.
4. Eluire il campione attraverso la colonna
- Usando una pipetta, aggiungere molto delicatamente 4-5 ml di solvente in modo tale da non disturbare lo strato di sabbia.
- Posizionare un imbuto nella parte superiore della colonna e riempire molto lentamente e delicatamente il resto della colonna con solvente.
- Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente scarichi attraverso la colonna.
- Inizia a raccogliere la fase mobile mentre drena dalla colonna in provette.
- Le provette devono essere collocate in una griglia per provette in modo sequenziale.
- Aggiungere ulteriore solvente nella parte superiore della colonna secondo necessità fino a quando tutti i composti desiderati non sono stati eluiti dalla colonna.
5. Recupero dei costituenti
- Se i composti sono colorati, possono essere identificati visivamente. Tuttavia, se i composti sono incolori, dovranno essere identificati utilizzando la luce ulta-visibile (UV) (se i composti contengono coniugazione) o con la macchia appropriata. La purezza dei composti può essere verificata utilizzando la cromatografia a strato sottile.
- Identificare le provette che contengono i composti desiderati.
- Unire tutte le frazioni che contengono il composto o i composti isolati desiderati in un matraccio a fondo tondo (RB) prepesato. Fallo per ogni composto isolato.
- Evaporare il solvente posizionando il pallone RB sull'evaporatore rotante.
- Una volta rimosso tutto il solvente, pesare il RB con il prodotto essiccato e sottrarre il peso iniziale del RB per ottenere una resa.
La cromatografia su colonna è un metodo di purificazione versatile utilizzato per separare i composti in una soluzione. Una miscela di soluzione viene trasportata da un solvente attraverso una colonna contenente un solido adsorbente, chiamata fase stazionaria. La miscela combinata di solvente e campione è chiamata fase mobile.
Le molecole nella fase mobile viaggiano attraverso la colonna a velocità diverse in base alle loro proprietà chimiche e alla loro affinità per la fase stazionaria. Pertanto, ogni composto esce dalla colonna in un momento diverso. Una volta che i composti sono stati separati e purificati, possono essere ulteriormente lavorati o sono pronti per la distribuzione. Questo video introdurrà le basi della cromatografia su colonna, quindi dimostrerà la tecnica con la purificazione dei composti organici.
Nella cromatografia su colonna, le molecole si adsorbono in modo reversibile alla fase stazionaria mentre scorrono attraverso la colonna, rallentando così il loro progresso. I composti che interagiscono debolmente con la fase stazionaria sono più veloci a uscire dalla colonna o ad eluire. I composti che interagiscono fortemente con la fase stazionaria sono più lenti ad eluire. La fase stazionaria è una polvere o un gel adsorbente come il gel di silice o l'allumina. Il gel di silice e l'allumina sono altamente polari, quindi interagiscono fortemente con composti polari e solventi e debolmente con molecole non polari. La fase stazionaria viene caricata nella colonna come un impasto liquido con il solvente e viene quindi impacchettata facendo scorrere il solvente attraverso la fase stazionaria. Se adeguatamente impacchettata, la fase stazionaria è omogenea dall'alto verso il basso e non contiene bolle d'aria o chiazze secche, poiché il flusso irregolare causato da queste irregolarità interferisce con la separazione dei composti. Il solvente, o eluente, è tipicamente un solvente organico fornito da un serbatoio. In generale, i solventi non polari eluiscono solo composti non polari, mentre i solventi polari eluiscono sia composti polari che non polari. Se una miscela contiene composti di polarità significativamente diverse, una serie di solventi sempre più polari può essere utilizzata per eluire tutti i composti di interesse. La portata della fase mobile è solitamente controllata da un rubinetto di arresto nella parte inferiore della colonna. Le pause nel flusso sono ridotte al minimo per evitare la diffusione dei composti. La fase mobile in uscita dalla colonna, chiamata eluato, viene raccolta in frazioni per preservare la separazione dei composti. Ora che hai compreso i principi della cromatografia su colonna, esaminiamo una procedura per la purificazione di una miscela di composti organici.
Per iniziare la procedura, procurarsi l'attrezzatura come indicato nel testo. Pesare un pallone a fondo tondo per ogni composto da isolare e registrare la massa. Quindi, pesare il campione e scioglierlo nel volume minimo di solvente necessario. Il solvente appropriato deve essere predeterminato utilizzando la cromatografia su strato sottile. Il valore Rf deve essere compreso tra 0,2 e 0,3. Quindi, determinare la quantità di gel di silice necessaria per la fase stazionaria in base al peso secco del campione e alla differenza nella distanza di migrazione dei composti di interesse in base al pre-screening TLC. Versare la quantità appropriata di gel di silice in un pallone di Erlenmeyer. Aggiungere il solvente al gel di silice fino a quando l'impasto non è traslucido e si muove liberamente quando il pallone viene fatto roteare. Quindi, seleziona una colonna abbastanza grande da essere riempita a metà dal gel di silice. Se la colonna non ha una fritta di vetro, posizionare la lana di vetro nella colonna e premerla saldamente sul fondo con un'asta lunga. Coprire la lana di vetro con circa 2 cm di sabbia per evitare che la silice passi attraverso la lana di vetro. In una cappa aspirante, fissare la colonna a un supporto ad anello, lasciando spazio sufficiente sotto per ospitare le provette.
Posizionare un imbuto nella colonna e assicurarsi che il rubinetto sia chiuso. Versare l'impasto nella colonna, picchiettando delicatamente i lati mentre l'impasto si deposita per escludere le bolle d'aria. Sciacquare l'imbuto, il pallone e le pareti della colonna con solvente per trasferire tutto il gel nella colonna.
Posizionare un pallone di Erlenmeyer sotto la colonna. Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente scarichi nel pallone fino a quando il livello del solvente non è appena sopra il gel di silice, quindi chiudere il rubinetto. Versare circa 2 cm di sabbia sul gel. Sciacquare delicatamente la sabbia attaccata ai lati della colonna con solvente. Scolare il solvente secondo necessità in modo che la sabbia sia per lo più asciutta, ma la silice rimanga completamente coperta.
Per iniziare la separazione, aggiungere il campione alla colonna senza disturbare la sabbia. Utilizzare piccole porzioni di solvente per sciacquare il campione che aderisce alle pareti della colonna e per risciacquare il contenitore del campione. Scolare accuratamente il solvente fino a quando il livello non è appena sopra la silice. Quindi, con una pipetta, aggiungere delicatamente 4,5 mL di solvente senza disturbare lo strato di sabbia. Posizionare un imbuto nella colonna e riempire lentamente con solvente. Rimuovere il pallone e sostituirlo con una provetta etichettata. Con la prima provetta in posizione, aprire il rubinetto e raccogliere l'eluato fino a quando la provetta non è quasi piena.
Continuare a raccogliere le frazioni fino a quando tutti i composti desiderati non sono stati eluiti, procedendo in sequenza attraverso le provette etichettate. Al termine, chiudere il rubinetto.
Per ogni composto isolato, combinare le frazioni pure in un pallone a fondo tondo pre-pesato. Rimuovere il solvente dal pallone su un evaporatore rotante e quindi pesare il pallone a fondo tondo contenente il composto secco. Per ulteriori informazioni, vedere il video di questa raccolta sull'evaporazione rotante.
Questo campione conteneva una miscela di tetrafenilporfirina, o TPP, e fluorenone. Il TPP rosso-viola scuro è stato eluito per primo, seguito dal fluorenone giallo. La purezza di ciascun composto isolato è stata confermata dalla spettroscopia NMR.
La cromatografia su colonna viene utilizzata nella purificazione e nell'analisi in una varietà di campi scientifici.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è una forma di cromatografia su colonna che fornisce un'eccellente separazione tra i composti e può incorporare rivelatori specializzati come un rivelatore di radiazioni per molecole radiomarcate. Utilizzando l'HPLC, un fosfolipide radiomarcato può essere facilmente isolato da una miscela di molti altri, anche se costituisce una piccola percentuale della miscela. Queste informazioni possono aiutare a chiarire la produzione, la regolazione e le funzioni di molte importanti biomolecole.
La cromatografia flash è una variante della cromatografia su colonna in cui la fase mobile si muove attraverso la colonna sotto la pressione dell'aria o del gas piuttosto che per il solo flusso per gravità.
Questo crea una portata più veloce, riducendo al minimo la diffusione per una migliore separazione. Il composto desiderato viene raccolto in poche frazioni pure e concentrate, come mostrato con la cromatografia su strato sottile, ottenendo un'eccellente resa e purezza post-purificazione.
Il solito apparato a colonna non è adatto per separare piccoli volumi, ma alcune miscele non sono compatibili con tecniche specializzate come l'HPLC. La purificazione su piccola scala viene eseguita con colonne per pipette in vetro, con un bulbo per pipette utilizzato per la cromatografia flash su piccola scala. Ciò è particolarmente utile quando si prepara un campione per tecniche di purificazione specializzate o come fase finale dopo la purificazione su larga scala.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia su colonna. A questo punto dovreste avere familiarità con i principi della cromatografia su colonna, una procedura per la cromatografia su colonna su gel di silice e alcune applicazioni della tecnica.
Grazie per l'attenzione!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.