Cromatografia su colonna

1. Liquame di gel di silice

1. Versare il gel di silice in un matraccio Erlenmeyer. Il peso del materiale d'imballaggio deve essere circa 50 volte quello del campione da separare. Se i composti separati hanno valori R_f molto simili, potrebbe essere necessario utilizzare una maggiore quantità di silice per campione, come nel caso di questo esempio.
   1. Posizionare 10 g di silice nel matraccio Erlenmeyer, poiché 50 mg di campione (45 mg di fluorenone e 5 mg di tetrafenilporfirina) vengono isolati.
2. Aggiungere il sistema solvente (esano/diclorometano, 70%: 30%) al matraccio Erlenmeyer contenente il gel di silice. Aggiungere abbastanza solvente per garantire che tutto il gel di silice sia ben solvatato. La silice non si dissolverà, ma la miscela sarà visivamente evidente quando viene solvata. Una volta aggiunto il solvente, ruotare il matraccio Erlenmeyer per garantire che tutta la silice sia ben solvata.

2. Preparazione della colonna

1. Selezionare la colonna di dimensioni appropriate. In genere la colonna deve essere riempita circa a metà strada con liquame di gel di silice. Più grande è il campione da purificare, maggiore è la colonna richiesta.
2. Tappare il fondo della colonna con un pezzo di lana di vetro. Usando un'asta lunga, assicurati che la lana sia saldamente alloggiata nella parte inferiore della colonna appena sopra il rubinetto.
3. Una volta che la lana è saldamente in posizione, applicare un sottile strato di sabbia sulla lana di vetro.
   Nota: Se la colonna è dotata di una fritta di vetro sopra il rubinetto, questo passaggio dovrebbe essere omesso.
4. Bloccare la colonna in posizione verticale a un supporto ad anello.
5. Usando un imbuto, versare delicatamente il liquame preparato di gel di silice nella colonna. Potrebbe essere necessario aggiungere ulteriore solvente per trasferire il liquame dal matraccio Erlenmeyer alla colonna. Usando una pipetta, lavare qualsiasi gel di silice che si attacca ai lati della colonna.
   1. Mentre il gel di silice si deposita nella colonna, picchiettare delicatamente i lati della colonna per assicurarsi che il gel di silice si impacchetta strettamente ed escluda eventuali bolle d'aria.
6. Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente si scarichi in un matraccio Erlenmeyer pulito fino a poco prima che il gel di silice e il fronte del solvente si incontrino. Il gel di silice non dovrebbe mai asciugarsi fino al completamento della procedura.
7. Posizionare un sottile strato di sabbia sopra il gel di silice (Figura 1). Usando una pipetta, lavare via tutta la sabbia che potrebbe essersi attaccata ai lati della colonna.
8. Scolare qualsiasi solvente aggiuntivo fino a quando la sabbia non è asciutta, ma non fino allo strato di gel di silice.

Figura 1. La configurazione corretta per un esperimento di cromatografia su colonna prima dell'aggiunta del campione.

3. Aggiunta dell'esempio alla colonna

1. Sciogliere il campione nella minor quantità possibile di solvente (utilizzando lo stesso solvente utilizzato per produrre il liquame di gel di silice).
2. Utilizzando una pipetta, aggiungere delicatamente il campione nella parte superiore della colonna.
3. Una volta che il campione è stato applicato sulla parte superiore della colonna, aprire il rubinetto e lasciare che il solvente dreni attraverso lo strato di sabbia ma non lo strato di gel di silice. Utilizzare una quantità molto piccola di solvente per lavare qualsiasi campione che potrebbe essersi aggrappato ai lati della colonna. Scolare questo solvente aggiuntivo anche attraverso lo strato di sabbia.

4. Eluire il campione attraverso la colonna

1. Usando una pipetta, aggiungere molto delicatamente 4-5 ml di solvente in modo tale da non disturbare lo strato di sabbia.
2. Posizionare un imbuto nella parte superiore della colonna e riempire molto lentamente e delicatamente il resto della colonna con solvente.
3. Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente scarichi attraverso la colonna.
4. Inizia a raccogliere la fase mobile mentre drena dalla colonna in provette.
   1. Le provette devono essere collocate in una griglia per provette in modo sequenziale.
5. Aggiungere ulteriore solvente nella parte superiore della colonna secondo necessità fino a quando tutti i composti desiderati non sono stati eluiti dalla colonna.

5. Recupero dei costituenti

1. Se i composti sono colorati, possono essere identificati visivamente. Tuttavia, se i composti sono incolori, dovranno essere identificati utilizzando la luce ulta-visibile (UV) (se i composti contengono coniugazione) o con la macchia appropriata. La purezza dei composti può essere verificata utilizzando la cromatografia a strato sottile.
2. Identificare le provette che contengono i composti desiderati.
3. Unire tutte le frazioni che contengono il composto o i composti isolati desiderati in un matraccio a fondo tondo (RB) prepesato. Fallo per ogni composto isolato.
4. Evaporare il solvente posizionando il pallone RB sull'evaporatore rotante.
5. Una volta rimosso tutto il solvente, pesare il RB con il prodotto essiccato e sottrarre il peso iniziale del RB per ottenere una resa.