Estrazione del DNA di comunità da colonie batteriche

1. Estrazione del DNA della comunità batterica

1. Per iniziare la procedura, pesare 100 g di terreno setacciato. Aggiungi questo a un recipiente di polipropilene e aggiungi 100 ml di tampone di estrazione composto da tampone Tris modificato con EDTA per promuovere il rilascio di batteri dalla matrice del suolo, quindi stringi la mano.
2. Quindi, pesare 100 g di perle di vetro e aggiungerle al recipiente di miscelazione. Agitare il campione per 5 minuti utilizzando un dispositivo di battitura delle pere o uno shaker meccanico ad azione da polso per 15 minuti. Aggiungere 10 ml di dodecil solfato di sodio al 20%, o SDS, alla miscela, quindi agitare per un ulteriore minuto. Incubare ad una temperatura elevata di 60 - 65 °C per 60 min.
3. Distribuire equamente il campione tra tubi separati da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 6.000 x g. Trasferire il surnatante dai tubi in un unico contenitore sterile. Quindi, ripetere l'estrazione sul pellet di terreno come descritto in precedenza, utilizzando un volume fresco di tampone di estrazione.
4. Quindi, aggiungere il volume totale del surnatante lavorato, circa 200 ml, in un tubo pulito da 50 ml riempito a metà volume con una soluzione di polietilenglicole al 30% e cloruro di sodio 1,6 M. Invertire le bottiglie più volte a mano per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 20 minuti per pellettizzare il DNA.
5. Rimuovere accuratamente il surnatante dal tubo della centrifuga, lasciando dietro di sé il pellet di acido nucleico parzialmente purificato. Aggiungere 20 mL di TE Buffer e 1,5 mL di una soluzione di acetato di potassio da 7,5 M per sospendare il pellet, quindi vortice. Posizionare la sospensione sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare a 16.000 x g per 30 min a 4 °C per precipitare proteine e polisaccaridi.
6. Quindi, aggiungere una RNAsi e una proteinasi K al campione, mescolare delicatamente a mano e lasciare riposare per un momento. Aggiungere un volume equivalente di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (rapporto miscela di 25:24:1) alla sospensione da estrarre e mescolare delicatamente a mano. Centrifugare la preparazione per 10 min a 13.000 x g. Rimuovere con attenzione il recipiente dalla centrifuga e annotare i due strati.
7. Lo strato inferiore, più pesante, è composto dal fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e detriti estratti, e lo strato superiore è l'acquoso e contiene il DNA. Posizionare la fase acquosa in un recipiente sterile, aggiungere un volume equivalente di isopropanolo e invertire delicatamente per avviare la precipitazione del DNA. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 2 ore. Pellet il DNA purificato mediante centrifugazione a 16.000 x g per 30 min. Rimuovere con attenzione il surnatante poiché il DNA pellettato può o non può essere visibile sul fondo del vaso, quindi ricaspendare in 1 mL di TE Buffer.
8. Utilizzando uno spettrofotometro o un fluorimetro di quantificazione DNA/RNA, misurare il livello di DNA estratto dal campione. La quantità di DNA è stimata dalla lettura di 260 nm. Una lettura di assorbanza di 1,0 equivale a 50 μg di DNA per mL di soluzione. Se la concentrazione è troppo alta per letture accurate, diluire la sospensione da 1 a 10 o da 1 a 100 utilizzando acqua di grado molecolare.
9. La purezza del DNA è stimata dal rapporto tra la lettura a 260 nm a quella a 280 nm. Un valore > 1,7 indica DNA relativamente puro. Il valore teorico massimo è 2.0.