2.6: Estrazione del DNA di comunità da colonie batteriche

1. Estrazione del DNA della comunità batterica

1. Per iniziare la procedura, pesare 100 g di terreno setacciato. Aggiungi questo a un recipiente di polipropilene e aggiungi 100 ml di tampone di estrazione composto da tampone Tris modificato con EDTA per promuovere il rilascio di batteri dalla matrice del suolo, quindi stringi la mano.
2. Quindi, pesare 100 g di perle di vetro e aggiungerle al recipiente di miscelazione. Agitare il campione per 5 minuti utilizzando un dispositivo di battitura delle pere o uno shaker meccanico ad azione da polso per 15 minuti. Aggiungere 10 ml di dodecil solfato di sodio al 20%, o SDS, alla miscela, quindi agitare per un ulteriore minuto. Incubare ad una temperatura elevata di 60 - 65 °C per 60 min.
3. Distribuire equamente il campione tra tubi separati da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 6.000 x g. Trasferire il surnatante dai tubi in un unico contenitore sterile. Quindi, ripetere l'estrazione sul pellet di terreno come descritto in precedenza, utilizzando un volume fresco di tampone di estrazione.
4. Quindi, aggiungere il volume totale del surnatante lavorato, circa 200 ml, in un tubo pulito da 50 ml riempito a metà volume con una soluzione di polietilenglicole al 30% e cloruro di sodio 1,6 M. Invertire le bottiglie più volte a mano per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 20 minuti per pellettizzare il DNA.
5. Rimuovere accuratamente il surnatante dal tubo della centrifuga, lasciando dietro di sé il pellet di acido nucleico parzialmente purificato. Aggiungere 20 mL di TE Buffer e 1,5 mL di una soluzione di acetato di potassio da 7,5 M per sospendare il pellet, quindi vortice. Posizionare la sospensione sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare a 16.000 x g per 30 min a 4 °C per precipitare proteine e polisaccaridi.
6. Quindi, aggiungere una RNAsi e una proteinasi K al campione, mescolare delicatamente a mano e lasciare riposare per un momento. Aggiungere un volume equivalente di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (rapporto miscela di 25:24:1) alla sospensione da estrarre e mescolare delicatamente a mano. Centrifugare la preparazione per 10 min a 13.000 x g. Rimuovere con attenzione il recipiente dalla centrifuga e annotare i due strati.
7. Lo strato inferiore, più pesante, è composto dal fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e detriti estratti, e lo strato superiore è l'acquoso e contiene il DNA. Posizionare la fase acquosa in un recipiente sterile, aggiungere un volume equivalente di isopropanolo e invertire delicatamente per avviare la precipitazione del DNA. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 2 ore. Pellet il DNA purificato mediante centrifugazione a 16.000 x g per 30 min. Rimuovere con attenzione il surnatante poiché il DNA pellettato può o non può essere visibile sul fondo del vaso, quindi ricaspendare in 1 mL di TE Buffer.
8. Utilizzando uno spettrofotometro o un fluorimetro di quantificazione DNA/RNA, misurare il livello di DNA estratto dal campione. La quantità di DNA è stimata dalla lettura di 260 nm. Una lettura di assorbanza di 1,0 equivale a 50 μg di DNA per mL di soluzione. Se la concentrazione è troppo alta per letture accurate, diluire la sospensione da 1 a 10 o da 1 a 100 utilizzando acqua di grado molecolare.
9. La purezza del DNA è stimata dal rapporto tra la lettura a 260 nm a quella a 280 nm. Un valore > 1,7 indica DNA relativamente puro. Il valore teorico massimo è 2.0.

L'estrazione del DNA della comunità batterica è un processo mediante il quale il DNA viene ottenuto da più specie batteriche all'interno di una comunità durante un'unica procedura di estrazione.

Le analisi tradizionali delle comunità microbiche nel suolo hanno solitamente coinvolto saggi colturali, utilizzando la metodologia di diluizione e placcatura su diversi terreni selettivi. Tuttavia, molti batteri crescono male in condizioni di laboratorio o nelle specifiche condizioni dei mezzi di crescita selezionati, il che significa che potrebbero non essere rappresentati o gravemente sottorappresentati.

Recentemente, l'estrazione del DNA di comunità da campioni batterici del suolo ha permesso un campionamento più completo delle comunità batteriche. Si ritiene che questo approccio non basato sulla cultura sia più rappresentativo delle comunità reali presenti rispetto ai metodi tradizionali basati sulla cultura.

Questo video dimostrerà un metodo non colturale di estrazione del DNA della comunità batterica, come controllare la qualità e la quantità del DNA estratto ed esplorare come questo DNA può essere utilizzato per studiare la diversità batterica.

L'estrazione del DNA dal suolo può essere condotta in due modi. Nel metodo di frazionamento, le cellule vengono prima separate dalla matrice del suolo prima dell'estrazione del materiale genetico. Il campione viene quindi sottoposto a cicli successivi di miscelazione e centrifugazione lenta al fine di raccogliere le cellule intatte in un pellet.

I lisozimi vengono quindi aggiunti alle cellule e la sospensione viene incubata. I lisozimi sono enzimi che rompono le pareti cellulari batteriche. Una volta che la struttura della parete cellulare è stata compromessa, il DNA può essere liberato per la purificazione. Tuttavia, è stato dimostrato che un secondo metodo di estrazione del DNA comunitario, il metodo in situ, produce una maggiore concentrazione di DNA.

Qui, una massa di terreno viene combinata con un volume equivalente di tampone di estrazione Tris-EDTA e perle di vetro e mescolata in modo aggressivo per facilitare la separazione delle cellule dalle particelle di terreno. Viene quindi aggiunto un detergente, generalmente sodio dodecil solfato, o SDS, e il campione viene ulteriormente miscelato per promuovere la lissi delle cellule e il rilascio del loro contenuto, compreso il DNA.

Viene quindi intrapresa l'incubazione ad alta temperatura per lisare le cellule batteriche rimanenti. I campioni vengono centrifugati e sul surnatante viene eseguita un'estrazione e incubazione con glicole polietilenico per far precipitare il DNA, che viene poi centrifugato in un pellet.

Il DNA viene risospeso in tampone TE e acetato di potassio per lavare ulteriormente il DNA da proteine e polisaccaridi, quindi viene eseguita la centrifugazione per pellettare questi componenti indesiderati. Il surnatante acquoso contenente il DNA viene rimosso e sottoposto a un'estrazione fenolo-cloroformio e a precipitazione di isopropanolo per pulire e concentrare ulteriormente il DNA. Dopo un periodo di incubazione a temperatura ambiente di due ore, il DNA viene centrifugato e risospeso in tampone TE per essere conservato fino all'analisi.

Ora che abbiamo familiarità con i concetti e i processi alla base dell'estrazione del DNA della comunità batterica, diamo un'occhiata a come viene eseguita in laboratorio.

Per iniziare la procedura, pesare 100 g di terreno setacciato. Aggiungerlo a un recipiente in polipropilene e aggiungere 100 ml di tampone di estrazione composto da tampone Tris modificato con EDTA per favorire il rilascio di batteri dalla matrice del suolo, quindi agitare a mano.

Quindi, pesare 100 g di perle di vetro e aggiungerle al recipiente di miscelazione. Agitare il campione per 5 minuti utilizzando un dispositivo di battitura delle perline o un agitatore meccanico da polso. Aggiungere 10 ml di dodecil solfato di sodio al 20%, o SDS, alla miscela, quindi agitare per un altro minuto. Incubare ad alta temperatura per 60 minuti.

Distribuire equamente il campione in provette separate da 50 mL e centrifugare per 10 minuti a 6.000 x g. Trasferire il surnatante dalle provette in un unico contenitore sterile. Successivamente, ripetere l'estrazione sul pellet di terreno come descritto in precedenza, utilizzando un volume fresco di tampone di estrazione.

Quindi, aggiungere il volume totale del surnatante trattato in una provetta pulita da 50 ml riempita a metà volume con una soluzione di polietilenglicole al 30% e cloruro di sodio 1,6 M. Capovolgere le bottiglie più volte a mano per mescolarle e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 20 minuti per pellettare il DNA.

Rimuovere con cautela il surnatante dalla provetta da centrifuga, lasciando dietro di sé il pellet di acido nucleico parzialmente purificato. Aggiungere 20 mL di tampone TE e 1,5 mL di una soluzione di acetato di potassio 7,5 M per risospendere il pellet, quindi vortex. Posizionare la sospensione sul ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare a 16.000 x g per 30 min a 4 ? C per precipitare proteine e polisaccaridi.

Quindi, aggiungere una RNAsi e una proteinasi K al campione, mescolare delicatamente a mano e lasciare riposare per un momento. Aggiungere un volume equivalente di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico alla sospensione da estrarre e mescolare delicatamente a mano. Centrifugare il preparato per 10 minuti a 13.000 x g. Rimuovere con cautela il recipiente dalla centrifuga e annotare i due strati.

Lo strato inferiore, più pesante, è composto da fenolo:cloroformio:alcol isoamilico e detriti estratti, mentre lo strato superiore è acquoso e contiene il DNA. Mettere la fase acquosa in un recipiente sterile, aggiungere un volume equivalente di isopropanolo e capovolgere delicatamente per avviare la precipitazione del DNA. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 2 ore. Pellettare il DNA purificato mediante centrifugazione a 16.000 x g per 30 min. Rimuovere con cautela il surnatante poiché il DNA pellettato può essere visibile o meno sul fondo del vaso, quindi risospendere in 1 mL di tampone TE.

Utilizzando uno spettrofotometro o un fluorimetro per quantificazione di DNA/RNA, misurare il livello di DNA estratto dal campione. I fluorimetri DNA/RNA produrranno livelli di DNA in unità di nanogrammi per millilitro. Se la concentrazione è troppo alta per letture accurate, diluire la sospensione da 1 a 10 o da 1 a 100 utilizzando acqua di grado molecolare.

Una volta ottenuto il DNA da una comunità batterica, questo può essere utilizzato in diversi modi. Alcune di queste applicazioni sono esplorate qui.

Le analisi spettrofotografiche del DNA estratto dal DNA di comunità possono fornire una visione del numero di cellule batteriche presenti in un dato campione di terreno. La quantità stimata di DNA in ng per mL di soluzione può essere correlata al volume totale di DNA estratto in soluzione, per ottenere la quantità totale di DNA per g di terreno. Conoscendo il valore teorico del DNA per cellula, è possibile calcolare il numero totale di cellule per g di suolo.

Per applicazioni più mirate, il DNA estratto dalle comunità batteriche può essere sottoposto a PCR per determinare se una particolare specie è presente all'interno della comunità. Ad esempio, gli scienziati potrebbero voler identificare se i campioni di terreno contengono agenti patogeni specifici, come il Clostridium perfringens o il Bacillus anthracis.

Infine, per ottenere una comprensione più completa dei batteri presenti in una comunità, i campioni di DNA possono essere sottoposti a caratterizzazione "omica" e bioinformatica che consente un'analisi più approfondita dei batteri originali all'interno del campione. ? Omica? Descrive una serie di tecnologie che esplorano i ruoli, le relazioni e le azioni delle molecole negli organismi o nelle comunità. Ciò include gli studi sui geni e la loro funzione, o ? Genomica?, e ? Proteomica?, lo studio delle proteine e dei loro ruoli. Ad esempio, il sequenziamento di 16S? L'RNA dei campioni può consentire una determinazione metagenomica di specie specifiche all'interno della comunità, fornendo una stima più dettagliata della diversità. Questo approccio può fornire agli scienziati una migliore comprensione della composizione delle specie di una comunità e dei ruoli che potrebbero assumere.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione del DNA della comunità batterica. Ora dovresti capire come estrarre il DNA da una comunità batterica, come controllare la qualità di questo DNA e come questo DNA può essere utilizzato per le indagini sulla composizione della comunità batterica. Grazie per l'attenzione!