Name: La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri come isolare cellule emopoietiche primarie dal midollo osseo murino e trasfettarle con efficienza del 30% mediante elettroporazione. Questo protocollo consente la differenziazione in mastociti e basofili per studi genetici.

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La raccolta di midollo osseo da femori e tibie <ol><li> Il primo passo della procedura è quello di raccogliere midollo osseo dal femore e la tibia di un 6 - a 12 settimane vecchio mouse (stiamo usando topi BALB / c, ma si può fare questa procedura con qualsiasi ceppo di topi). Per iniziare, eutanasia il mouse da CO 2 inalazioni (non sarà mostrato). Vendemmia femore e tibia dalle zampe posteriori di ciascuno. Poi, con una lametta da barba, tagliare ogni estremità del femori per rimuovere l&#39;anca e le articolazioni del ginocchio e per esporre il midollo. </li><li> In modo simile, tagliare ogni estremità della tibia per rimuovere il ginocchio e della caviglia regioni limitrofe e per esporre il midollo. </li><li> Fate una siringa da 3 ml con una 26-gauge e riempirlo con RPMI supplementato con 10% FBS, penicillina, streptomicina, e beta-mercaptoetanolo (BME = 100 uM). Utilizzando una pinzetta, tenere l&#39;osso su una piastra di Petri contenente RPMI media. Inserire l&#39;ago della siringa in una delle estremità delle ossa e premere lo stantuffo per scovare il midollo osseo. L&#39;ago della siringa può essere spostato su e giù dentro l&#39;osso per scovare midollo residuo. </li><li> Ripetere la procedura per tutte le ossa, e quindi procedere con istituisce la culture. </li></ol> Stabilire Culture <ol><li> Per stabilire le culture del midollo osseo, pipetta il midollo osseo lavata su e giù parecchie volte per rompere il tessuto in una sospensione cellulare. </li><li> Collocare un filtro di 70 micron in cima ad un tubo 50 ml conica, e aggiungere la sospensione cellulare al filtro. </li><li> Sciacquare la piastra Petri una volta con RPMI, quindi aggiungere il risciacquo del filtro per i 70 micron. </li><li> Utilizzando la fine di gomma di una siringa da 1 ml stantuffo, macinare i pezzi rimanenti del midollo osseo nella parte superiore del filtro di 70 micron. </li><li> Lavare il filtro una volta con RPMI. </li><li> Dopo aver lavato il filtro, centrifuga la sospensione cellulare a 1200 rpm per 5 minuti. </li><li> Lavare il pellet da risospendere in PBS. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Noi di solito ottenere ~ 90 milioni di cellule di ossa di un mouse (due femori e due tibie). Dopo il conteggio delle cellule, li centrifuga di nuovo a 1200 rpm per 5 minuti. </li><li> Risospendere le celle di una piccola quantità di RPMI e le aliquote in fiasche colture di tessuti contenenti abbastanza RPMI in modo che l&#39;concentrazione finale è di 1 milione di cellule per mL. </li><li> Aggiungi citochine a promuovere lo sviluppo del vostro tipo di cellula di interesse. In questo caso, la citochina interleuchina-3 (IL-3 = 10 ng / mL) viene aggiunto per promuovere lo sviluppo dei basofili e mastociti. Per acquisire basofili, incubare per 10 giorni. Per i mastociti, incubare per 5 settimane. Quando si genera mastociti, i media e IL-3 dovrebbe essere cambiata una volta alla settimana. </li><li> Ecco uno sguardo a come mastociti dovrebbe apparire subito dopo placcatura. Questa immagine mostra la differenziazione delle cellule del midollo dell&#39;albero in basofili e mastociti 10 giorni dopo l&#39;aggiunta di interleuchina-3. </li><li> Una volta che il tipo cellulare desiderato si ottiene, procedere con il passaggio elettroporazione. </li></ol> Cellule Electroporating <ol><li> Per iniziare il passo elettroporazione, determinare il numero di cellule nel pallone cultura. </li><li> Le cellule sono in genere elettroporate ad una densità di 10 milioni per ml, in modo da trasferire il numero di cellule per tubi conici e centrifugare le provette a 1200 rpm per 5 minuti. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare i media, lavare le cellule con PBS 1X, e centrifugare di nuovo a 1200 rpm per 5 minuti. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere Bio-Rad Gene buffer di elettroporazione Pulser per fare una sospensione di cellule di 10 milioni di cellule per ml. </li><li> Dopo risospendere le cellule, aggiungere il DNA desiderato plasmide ad una concentrazione finale di 10 a 20 microgrammi per ml. </li><li> Aliquota 150 microlitri di sospensione cellulare in pozzi di vostra scelta su un piatto elettroporazione 96-bene. </li><li> Mettete la placca nella camera di elettroporazione MXcell piastra e chiudere il coperchio. </li><li> Prima di trasfezione dei mastociti, un protocollo di elettroporazione deve essere programmato in MXcell a meno di utilizzare un protocollo predefinito o memorizzati. Attraverso esperimenti di ottimizzazione che hanno scoperto che la più alta efficienza di trasfezione dei mastociti avvenire utilizzando protocolli di piazza dell&#39;onda di polso. Noi variare le condizioni elettroporazione sul piatto per fornire 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms e 350V/10ms impulsi a onda quadra 2000uF e 1000 ohm. Una volta che il protocollo è stato impostato e caricata sul dispositivo, premere il tasto &quot;Pulse&quot; per electroporate le cellule. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione è completa, trasferire le cellule a una piastra di coltura dei tessuti. Noi di solito trasferire ogni campione elettroporazione 150 microlitri di un pozzo in un 48-pozzetti di coltura contenente 300 microlitri RPMI (supplementato con 10% FCS, penicillina, streptomicina, e beta-mercaptoetanolo) con 10 nanogrammi per ml interleuchina-3. Le cellule vengono incubate overnight a 37 ° C, poi analizzati 24 ore più tardi per l&#39;espressione e la soppressione. </li></ol> Transfection Risultati L&#39;immagine di microscopia a fluorescenza delle cellule dopo l&#39;elettroporazione di successo con 20 microgrammi per ml GFP plasmide viene mostrato nel video. Utilizzando il sistema di elettroporazione MXcell efficienze di trasfezione di circa il 30% può essere ottenuto. Il sistema consente di variare le condizioni per massimizzare l&#39;efficienza di trasfezione, pur mantenendo la vitalità cellulare.

Come più informazioni genomiche emerge e nuovi strumenti come siRNA sono sviluppati, l&#39;uso di cellule fisiologicamente rilevanti è diventato sempre più importante per migliorare la nostra comprensione delle vie di malattia, interazioni proteina-proteina, e la trasduzione del segnale. Pile sono ottenute direttamente da tessuti o fluidi e coltivate in vitro. Queste cellule possono essere manipolati in vari modi, anche attraverso l&#39;introduzione di materiale genetico esogeno. E &#39;sempre più evidente che il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie è elettroporazione. Elettroporazione espone le cellule a impulsi elettrici al fine di aumentare temporaneamente la permeabilità della membrana cellulare, consentendo in tal modo esogeno acidi nucleici per entrare nella cellula. Questo metodo di trasfezione può essere ottimizzato per accogliere le differenze tra diversi tipi di cellule / linee e, quindi, può essere utilizzato per trasfettare mastociti così come qualsiasi altro osso cellule derivate dal midollo. Inoltre, a differenza virale mediata trasfezione, elettroporazione non impone limiti alle dimensioni del DNA transfettate, né richiedono una preparazione. A differenza dei lipidi mediata trasfezione, elettroporazione può essere meno tossico e non dia luogo a cattura endosomiali degli acidi nucleici transfettate. Bio-Rad ha sviluppato il sistema di elettroporazione MXcell appositamente per queste cellule. il MXcell consente di variare le condizioni per massimizzare l&#39;efficienza di trasfezione e la vitalità cellulare. Al fine di ottimizzare l&#39;efficienza di trasfezione e ridurre al minimo la morte delle cellule, una moltitudine di parametri tra cui elettroporazione tensione, capacità, resistenza e durata dell&#39;impulso può essere regolata e valutati.

<table><tbody><tr><td>Sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per elettroporazione Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

la preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

E &#39;sempre più evidente che elettroporazione è il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie. Il gene Pulser sistema di elettroporazione MXcell e Gene buffer di elettroporazione Pulser sono stati specificamente sviluppati per trasfettare acidi nucleici nelle cellule dei mammiferi e di difficile trasfezione delle cellule, come i video cells.This primarie e staminali dimostra come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino , e poi li preparano per l&#39;elettroporazione nel sistema MXcell. Si comincia isolando femore e della tibia. Midollo osseo da femore e della tibia vengono poi raccolte e le culture sono stabiliti. Colture di cellule del midollo osseo sono poi transfettate e analizzati.

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Sta diventando sempre più evidente che l'elettroporazione sia il metodo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie. Il Gene Pulser ...

Questa procedura inizia con il prelievo di femori e tibie da mouse. Dopo la rimozione delle articolazioni dell'anca, del ginocchio e della caviglia, il midollo viene isolato mediante iniezione di mezzo RPMI nell'estremità aperta dell'osso. Dopo aver ottenuto una sospensione di singole cellule, le cellule del midollo osseo vengono differenziate in mastociti, caricate in piastre di elettroporazione a 96 pozzetti e quindi trasfettate.Utilizzando il sistema di elettroporazione genica o cellule MX. Impiegando protocolli di impulsi a onda quadra, è possibile ottenere efficienze di trasfezione di circa il 30%. Il primo passaggio della procedura consiste nel prelevare il midollo osseo dal femore e dalla tibia di un topo di età compresa tra le sei e le dodici settimane.Per iniziare, eutanasia il topo mediante inalazione di CO2, quindi preleva il femore e la tibia da zampe posteriori di ciascun topo. Successivamente, con la lametta, taglia ciascuna estremità del femore per rimuovere le articolazioni dell'anca e del ginocchio ed esporre il midollo in modo analogo. Taglia ciascuna estremità della tibia per rimuovere le regioni adiacenti al ginocchio e alla caviglia ed esporre il midollo.Successivamente, prendere una siringa con un ago da 26 e mezzo di calibro e rilasciare RPMI integrato con 10% di FBS, penicillina, streptomicina, beamer, etanolo capita e L-glutammina. Utilizzando pinzette, tenere l'osso sopra una piastra di Petri contenente mezzo RPMI. Inserire l'ago della siringa in una delle estremità dell'osso e premere lo stantuffo per espellere il midollo osseo.L'ago della siringa può essere spostato su e giù all'interno dell'osso per espellere il midollo residuo. Ripetere la procedura per tutte le ossa, quindi procedere con l'allestimento delle colture. Per allestire le colture di midollo osseo, aspirare il midollo espulso su e giù diverse volte per frammentare il tessuto e ottenere una sospensione cellulare.Quindi posizionare un filtro da 70 micron sopra un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere la sospensione cellulare sul filtro. Successivamente, risciacquare una volta la piastra di Petri con RPMI. Quindi aggiungere il risciacquo sul filtro da 70 micron utilizzando l'estremità di gomma dello stantuffo di una siringa da un millilitro per macerare i pezzi di midollo osseo rimasti sulla superficie del filtro da 70 micron.Lavare il filtro una volta con RPMI dopo aver lavato il filtro. Centrifugare la sospensione cellulare a 1200 RPM per cinque minuti. Lavare il pellet cellulare risospendendolo in PBS.Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Tipicamente otteniamo circa 90 milioni di cellule dalle ossa di un topo, due femori più due tibie. Dopo aver contato le cellule, centrifugarle nuovamente a 1200 giri/min per cinque minuti.Risospendere le cellule in una piccola quantità di RPMI e aliquotarle in fiaschi per coltura cellulare, contenenti quantità sufficiente di RPMI in modo che la concentrazione finale sia di 1 milione di cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere citochine per favorire lo sviluppo del tipo cellulare di interesse. In questo caso, viene aggiunta la citochina interleuchina-3 per promuovere lo sviluppo di basofili e mastociti: per ottenere basofili, incubare per 10 giorni; per ottenere mastociti, incubare per cinque settimane.Il mezzo e l'IL-3 devono essere sostituiti una volta alla settimana. Ecco come dovrebbero apparire le cellule del midollo osseo subito dopo la semina. Questa immagine mostra la differenziazione delle cellule del midollo osseo in basofili e mastociti a 10 giorni dall'aggiunta dell'interleuchina 3.Ottenuto il tipo cellulare desiderato, procedere con il passaggio di elettroporazione. Per iniziare il passaggio di elettroporazione, determinare il numero di cellule nella coltura. Le cellule in fiasca vengono solitamente sottoposte a elettroporazione a una densità di 10 milioni per millilitro.Trasferire il numero richiesto di cellule in provette coniche e centrifugare le provette a 1200 giri/min per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo, lavare le cellule con un volume di PBS e centrifugare nuovamente a 1200 giri/min per cinque minuti. Quindi aspirare il PBS e aggiungere il buffer per elettroporazione BioRad Gene Pulser per ottenere una sospensione cellulare di 10 milioni di cellule per millilitro.Dopo aver risospeso le cellule, aggiungere il DNA plasmidico desiderato a una concentrazione finale di 10-20 microgrammi per millilitro. Mescolare delicatamente la soluzione cellulare e trasferire 150 microlitri della sospensione cellulare nei pozzetti scelti di una piastra da elettroporazione a 96 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra da elettroporazione nella camera della piastra MXL e chiudere il coperchio prima della trasfezione delle cellule del midollo osseo e dell'elettroporazione.Il protocollo deve essere programmato nell'MXL, a meno che non si utilizzi un protocollo preimpostato o memorizzato. Attraverso esperimenti di ottimizzazione, abbiamo scoperto che le più elevate efficienze di trasfezione delle cellule del midollo osseo si ottengono utilizzando protocolli di impulsi a forma d'onda quadra. Varieremo le condizioni di elettroporazione sulla piastra per erogare impulsi a forma d'onda quadra a 2000 micro phs in un migliaio di ohm. Una volta impostato e caricato il protocollo sul dispositivo, premere pulsante per trattare le cellule; al termine dell'elettroporazione, trasferire le cellule in una piastra per colture cellulari.Di solito trasferiamo ogni campione da 150 microlitri destinato all'elettroporazione in una pozzetta di una piastra per colture cellulari a 48 pozzette contenente 300 microlitri di RPMI con 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina tre. Le cellule vengono incubate tutta la notte a 37 gradi Celsius, quindi analizzate 24 ore dopo per verificarne l'espressione e la soppressione. Questa è un'immagine di microscopia fluorescente delle cellule.Dopo un'electroporazione riuscita utilizzando 20 microgrammi per millilitro di plasmide GFP, mediante il sistema di elettroporazione cellulare MX, è possibile ottenere efficienze di trasfezione di circa il 30%. Il sistema consente di variare le condizioni per massimizzare l'efficienza di trasfezione mantenendo al contempo la vitalità cellulare. Il sistema cellulare MX è particolarmente utile per cellule primarie di mammifero come queste cellule ematopoietiche di topo.Abbiamo appena mostrato come isolare le cellule del midollo osseo da topi e trasfettare mastociti differenziati utilizzando il sistema di elettroporazione per cellule MX. Questo è tutto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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