Test di induzione neurale nell'embrione Chick

Questo video illustra i diversi passaggi del saggio per l'induzione neurale nell'embrione di pollo. Innanzitutto, l'embrione ospite viene espiantato in una nuova coltura; l'embrione donatore viene espiantato in soluzione salina e il nodo di Hensen viene marcato con un colorante fluorescente. Il nodo di Hensen viene quindi escisso dall'embrione donatore e trapiantato nell'embrione ospite.

L'embrione ospite viene coltivato per 24 ore, fissato ed elaborato per l'ossidazione fotochimica mediante fluorescenza fey. Con dab. L'embrione viene quindi elaborato per ibridazione in situ con un marcatore neurale.

Ciao, sono Delphine del Laboratorio Fennell presso il Centro di Medicina Ambientale e Genomica dell'Università Texas A&M di Houston. Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire saggi di induzione neurale nell'embrione di guancia. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare gli effetti dei farmaci antiepilettici sulle proprietà induttive neurali del nodo di Hensen.

Iniziamo. Per il saggio di induzione neurale, è necessario preparare le uova. Queste uova devono essere incubate in posizione orizzontale in un incubatore umidificato per 13 ore fino allo stadio tre più di Hamburger e Hamilton o HH tre più.

Successivamente, preparare l'embrione ospite utilizzando il nuovo metodo di coltura, precedentemente dimostrato. In JoVE, coprire la superficie dell'embrione ospite con 200 microlitri di soluzione salina. Questo agevolerà il successivo trasferimento e posizionamento dell'innesto donatore.

Infine, coprire l'assemblaggio con una capsula di Petri Falcon da 35 millimetri capovolta. Per esporre l'embrione donatore, aprire l'uovo picchiettando sul guscio con una pinzetta. Rimuovere la parte superiore del guscio e scartarla.

Rimuovere l'albume spesso con pinzette e inclinare il sacco vitellino con pinzette grossolane in modo che l'embrione sia rivolto verso l'alto. Dopo aver rimosso l'albume, utilizzare forbici fini per tagliare un quadrato di sacco vitellino intorno all'embrione. Prelevare l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio e posizionarlo in una piastra contenente PBS.

Successivamente, utilizzare una pinzetta per staccare l'embrione donatore dal tuorlo e dalla zona lucida. Una volta staccato, trasferire l'embrione donatore in una piastra con protezione SIL contenente PBS per etichettare e trapiantare l'innesto. Utilizzare un estrattore di microelettrodi per tirare pipette di vetro capillari da 50 microlitri al microscopio.

Tagliare la punta della micropipetta utilizzando pinzette fini. Posizionare la micropipetta in una capsula di Petri foderata con un nastro di argilla da modellare. Successivamente, preparare la soluzione di colorante, che verrà utilizzata per etichettare l'innesto prima del trapianto.

Per prima cosa, preparare una soluzione madre di colorante in un millilitro di etanolo assoluto allo 0,5%. Questa soluzione madre può essere conservata a meno 20 gradi Celsius al buio. Successivamente, in un blocco riscaldante impostato a 45 gradi Celsius, mescolare 10 microlitri della soluzione madre pre-riscaldata con 90 microlitri di saccarosio 0,3 molare. Questa temperatura è necessaria per evitare la precipitazione del colorante e la formazione di cristalli insolubili.

Centrifugare brevemente la soluzione su una minicentrifuga SPECT per cinque-dieci secondi. La soluzione DAI è ora pronta per l'uso; utilizzare spilli per insetti per fissare l'embrione donatore sul fondo della piastra coperta, con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Una volta fissato l'embrione, riempire nuovamente la micropipetta con D eye applicando una pressione delicata.

Utilizzando un'aspira collegata a un tubo. Applicare una piccola bolo di dai al nodo di Henson. Ripetere, assicurandosi che l'intero nodo di Henson sia marcato successivamente.

Utilizzando una pipetta capillare micrometrica o un coltello microchirurgico, sezionare il nodo di Hensen; il lato dorsale del nodo può essere distinto dal lato ventrale poiché forma una scanalatura, mentre il lato ventrale del nodo è piatto. Se necessario, contrassegnare il lato dorsale dell'innesto con polvere di carminio. Questo garantirà che l'innesto venga posizionato con la corretta orientazione dorso-ventrale.

Utilizzando una pipetta Gilson da 10 microlitri, trasferire l'innesto nell'embrione ospite mediante una pipetta capillare microscopica. Avvicinare l'innesto alla regione area lucida, zona al confine opaco a livello del nodo di Henson dell'embrione ospite. Successivamente, utilizzare una pipetta capillare microscopica o un coltello microchirurgico per praticare una piccola incisione profonda da 80 a 100 micrometri nella zona.

Limite opaco della zona lucida a livello del nodo di Hensen dell'embrione ospite. Utilizzando una pipetta capillare micrometrica o un bisturi da dissezione microscopica, posizionare l'innesto in modo che il lato ventrale sia rivolto verso di voi e l'estremità posteriore sia parallela alla regione corrispondente nell'embrione ospite. Una volta posizionato, rimuovere il liquido salino dall'embrione ospite, assicurandosi che l'innesto rimanga in prossimità stretta del sito ospite, quindi sottoporre l'embrione ospite a una nuova coltura per 18-22 ore come descritto nella nostra precedente pubblicazione.

Dopo 24 ore di coltura, l'embrione viene prelevato dall'incubatore e fissato in una capsula petri. Il contenuto di P-B-S-P-B-S viene rimosso e sostituito con paraformaldeide al 4%. L'embrione viene quindi fissato per 24 ore.

Smaltire il fissativo in un apposito contenitore per rifiuti pericolosi e aggiungere PBS alla piastra di fissazione. Rimuovere i perni metallici con pinzette dopo che i perni sono stati tolti. Utilizzare una pipetta Pasteur con estremità smussata per trasferire l'embrione in un vial di scintillazione contenente PBS.

Lavare l'embrione due volte in PBS per cinque minuti ciascuna e una volta in soluzione tampone twist per cinque minuti dopo il lavaggio; trasferire quindi l'embrione in un vetrino portaoggetti in vetro contenente 0,1 millilitri di tampone Tris. Sostituire la soluzione tampone Tris con 0,1 millilitro di soluzione DAB. Smaltire la punta einor nel contenitore contenente una soluzione di candeggina.

Per decontaminare il DAB, posizionare un coprioggetto sulla cavità del vetrino sotto il fuoco della fluorescenza di isotiocianato di fluoresceina FEI. L'obiettivo del microscopio sulle cellule del donatore del trapianto apparirà rosso fluorescente ed esposto alla fluorescenza FEI fino a quando tutte le cellule rosso fluorescenti non diventeranno marroni. Questo avviene perché il fluorocromo viene fotoconvertito in cristalli marroni insolubili dall'esposizione alla lunghezza d'onda di eccitazione FEI.

4 88 nanometri in presenza di dab. Questo processo richiede da 20 minuti a due ore. Al termine della reazione di fotoossidazione, rimuovere il vetrino coprioggetto utilizzando pinzette fini.

Trasferire l'embrione in un vial da 20 millilitri contenente PBTW o PBS con lo 0,1% di tween 20. Infine, disattivare il DAB dal coperchio, dallo slip e dalla cavità di vetro. Far scivolare l'embrione incubandolo in una soluzione sbiancante per elaborarlo e renderlo visibile.

Procedere con l'ibridazione in situ, incubando l'embrione solo con la sonda marcate con DIG. Successivamente, iniziare a scattare fotografie e a effettuare sezioni come descritto in JoVE Video due. Ecco un esempio di un saggio di induzione neurale.

Inizialmente, l'innesto viene posizionato al confine tra l'area lucita e l'area alpaca dell'embrione ospite. Sia l'embrione donatore che l'embrione ospite sono allo stadio tre più. Dopo nove ore in coltura, l'innesto inizia a differenziarsi e induce ciò che appare come una testa in miniatura allo stadio otto meno.

Dopo 24 ore di coltura, l'induzione neurale è completa a seguito della fissazione. L'embrione viene sottoposto a fotoossidazione. Inizialmente, le cellule marcate con il colorante derivato dal donatore nell'occhio mostrano di essersi proliferate per formare un miniaturizzato Noor, come visibile qui in rosso.

Dopo l'ossidazione fotochimica, queste cellule appaiono marroni. L'embrione viene quindi sottoposto a ibridazione in situ su preparato intero per il marcatore neurale. O otx due è stato sviluppato nel laboratorio del Dott. Bonelli.

Si osserva che l'innesto donatore induce l'espressione di OTX2 nei tessuti derivati dall'ospite. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio di induzione neurale nell'embrione di pesce zebra. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di rimuovere tutto il liquido presente nella zona circostante l'innesto dopo il trapianto, utilizzando una pipetta.

Questo garantirà che l'innesto sia posizionato in modo sicuro e che non si sposti dall'embrione ospite durante la coltura. È tutto. Grazie. Buona visione e buona fortuna con i vostri esperimenti.