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Basic Care Procedures

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Lab Animal Research

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Basic Care Procedures

5.1: Rodent Handling and Restraint Techniques

5.14: Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest

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14:44 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Topi e ratti rappresentano oltre il 90% degli animali utilizzati per la ricerca biomedica. La cura adeguata di questi animali da ricerca è fondamentale per l’esito degli esperimenti. Esistono procedure generali che si applicano alla maggior parte di questi topi e ratti, ma alcuni degli animali, come quelli immunocompromessi, richiedono ulteriori misure da adottare per sostenerli per la sperimentazione.

I topi immunocompromessi comunemente usati includono quelli che si sono verificati naturalmente nei topi consanguinei e quelli che sono stati creati attraverso l’ingegneria genetica. I primi topi immunocompromessi utilizzati nella ricerca erano topi “nudi”. Il topo BALB/c Nude (nu) è stato scoperto nel 1966, all’interno di una colonia BALB/c che produceva topi privi sia di capelli che di timo. Questi topi atimici hanno un sistema immunitario inibito che è privo di cellule T. Il valore di questo animale è stato presto scoperto per l’uso in studi di infezioni microbiche, immunodeficienze e autoimmunità. Anche se non è così comunemente usato come il topo nudo, c’è anche un topo nudo. Il ratto nudo è carente di cellule T e mostra popolazioni cellulari impoverite nelle aree dipendenti dal timo degli organi linfoidi periferici. Un altro topo immunodeficiente naturale è il topo immunodeficienza combinata grave (SCID). Questi topi hanno un difetto che compromette la produzione di cellule B e T funzionali. Con l’incapacità di montare un’adeguata risposta immunitaria, questi topi possono servire come riceventi ospiti per trapianti di cellule umane. Diversi ceppi di topo geneticamente modificati con deficienze immunitarie sono disponibili in commercio. ¹ La gravità della carenza varia con la modificazione genetica; tuttavia, tutti i topi e i ratti immunocompromessi sono gestiti in modo simile.

Questo manoscritto descriverà la cura degli animali immunocompetenti e immunocompromessi. L’alloggio, la dieta, i requisiti ambientali e la manipolazione saranno discussi per entrambi i gruppi di animali.

Principles

Alloggiamento/Intarsio

Topi e ratti sono principalmente alloggiati in intasature tipo scatola da scarpe con un fondo solido che contiene materiale da letto. La tipica gabbia per mouse shoebox fornisce 75 pollici quadrati di spazio sul pavimento, che è adeguato per un massimo di cinque topi adulti. Tuttavia, il disegno sperimentale può richiedere gruppi di quattro topi. In questo caso, i topi dovrebbero essere alloggiati al ricevimento in gruppi di quattro, per evitare l’interruzione dei gruppi sociali quando inizia l’esperimento. In generale, l’intasamento dei ratti consente un massimo di due animali adulti adulti. Se i ratti devono essere ospitati a lungo termine, dovrebbero essere stabiliti in alloggi di coppia.

Le gabbie possono essere statiche o ventilate individualmente (IVC). Le gabbie statiche sono coperte con un coperchio a barra metallica o sono sistemate su un rack sotto uno scaffale che è quindi la parte superiore della gabbia. Il materiale filtrante viene aggiunto sopra la parte superiore della gabbia come un cofano sopra il coperchio della barra metallica o come un foglio di carta da filtro sopra i ripiani del rack. Gli IPC sono impostati come una gabbia, un coperchio a barra metallica e un cofano che vengono posizionati su un rack che fornisce il flusso d’aria nella gabbia. L’uso di IPC elimina la necessità di cambiare la gabbia tutte le volte che vengono cambiate le gabbie statiche.

I sistemi di gabbie standard forniscono una fonte d’acqua e un’area per la distribuzione del cibo. L’acqua può essere fornita tramite una bottiglia d’acqua posizionata sulla parte superiore della gabbia o tramite un tubo del sorso che è un componente incorporato della gabbia animale. Quando la gabbia è inserita su un rack, l’acqua viene trasportata nel tubo del sipper per un sistema di irrigazione automatico progettato per soddisfare le esigenze dell’animale in tutta la struttura per animali. L’intasamento deve essere adeguatamente preparato per fornire cure adeguate agli animali. Ci sono alimentatori collocati all’interno della gabbia per animali, o una sezione del coperchio della barra metallica viene utilizzata per la conservazione degli alimenti. Il cibo deve essere posto in modo tale che non sia sporcato dagli animali.

La Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio²(la “Guida”) afferma che tutti gli attrezzi di intasamento devono essere disinfettati almeno ogni 2 settimane. Alcune gabbie e accessori potrebbero dover essere cambiati più spesso come dettato dal livello di odore e ammoniaca nell’involucro. In generale, gli IPC sono programmati per cambiare ogni due settimane a meno che non ci siano quattro o più maschi o una femmina con una cucciolata; tali custodie possono richiedere cambi settimanali. Poiché il cambio di gabbia è un’opportunità per i topi di essere esposti a patogeni, il cambiamento dell’ingabbiamento per topi immunodeficienti dovrebbe essere fatto il più raramente possibile.

Dieta

Ci sono molte composizioni di diete disponibili con variazioni nei livelli di proteine, carboidrati e grassi. In genere, i mangimi dovrebbero essere composti da 15-19% di proteine, 44% di carboidrati e 4-9% di grassi. Il cibo con un aumentato contenuto di grassi viene spesso utilizzato per le colonie riproduttive per migliorare la riproduzione. Poiché il cibo può essere una fonte di contaminazione per i topi immunocompromessi, deve essere sterilizzato a vapore o irradiato. Gli alimenti sottoposti al processo di autoclave devono essere appositamente formulati per resistere al processo. Tuttavia, il processo di irradiazione non altera il contenuto degli alimenti.

L’acqua è un’altra potenziale fonte di contaminazione per gli animali immunodeficienti. L’acqua deve essere lavorata attraverso un’autoclave o una filtrazione che include l’acqua che passa attraverso un filtro UV. Per sterilizzare a vapore l’acqua in un’autoclave, le singole bottiglie d’acqua sono coperte con un foglio di alluminio. I coperchi delle bottiglie con tubi per sorseggiatori vengono sterilizzati separatamente in un sacchetto per autoclave. L’acidificazione dell’acqua a un pH di 2,5-3 aiuta a controllare la crescita degli organismi batterici nelle bottiglie d’acqua. L’acqua viene acidificata aggiungendo due gocce di acido cloridrico (HCl) 12 mole (M) a otto litri di acqua ad osmolalità inversa (RO). I sistemi di irrigazione automatici possono essere utilizzati con una serie di filtrazione in tutto il sistema che include filtri antiparticolato e un filtro a luce ultravioletta.

Ambiente

Le condizioni ambientali all’interno di una struttura per la cura degli animali devono essere strettamente controllate. I regolamenti e le linee guida federali hanno stabilito gli standard per la cura e la manipolazione degli animali di uso comune. L’illuminazione, la temperatura ambiente, l’umidità e il flusso d’aria sono forniti per soddisfare le esigenze fisiologiche degli animali. Ad eccezione della necessità di una temperatura ambiente leggermente aumentata, i parametri per gli animali immunocompromessi sono gli stessi di quelli per gli animali convenzionali. Gli animali nudi atimici richiedono anche lettiera aggiuntiva e materiali di nidificazione di carta triturati nelle loro gabbie per aiutare con la termoregolazione.

Le stanze degli animali devono essere mantenute a una temperatura compresa tra 68-72 ° F con un livello di umidità del 40-60%. ² Livelli di umidità inferiori al 40% possono causare la coda di topi e ratti, una condizione che fa asciugare la pelle della coda al punto da restringersi attorno alla coda, che può portare allo sloughing della coda. I cicli di illuminazione devono essere impostati per evitare fattori di stress per gli animali causati da fotoperiodi o intensità luminosa inappropriati. Normalmente, i fotoperiodi sono 12 ore accesi e 12 ore spenti. L’intensità luminosa dovrebbe variare in base all’attività nella stanza. Quando i tecnici lavorano nella stanza degli animali, è possibile utilizzare livelli di illuminazione più elevati. Tuttavia, l’illuminazione dovrebbe essere abbassata a circa 325 lux una volta conclusa tutta l’attività. ² Le luci devono essere accese sui timer e i cicli verificati attraverso sistemi di monitoraggio. Come indicato dalla Guida, le stanze degli animali devono avere un minimo di 10-15 cambi d’aria del 100% di aria fresca all’ora. ^{2 I} cambi d’aria diminuiscono i microbi e gli odori nella stanza degli animali. Nelle stanze degli animali densamente popolate, potrebbe essere necessario aumentare il numero di cambi d’aria all’ora.

I fattori ambientali a livello di gabbia includono il tipo di ingabbiamento, il substrato utilizzato all’interno della gabbia, il sistema di erogazione dell’acqua e la dieta. L’edilizia sociale è obbligatoria a meno che non sia scientificamente giustificato, o un animale è incompatibile con tutti gli altri. Le disposizioni di arricchimento ambientale, come capanne di carta e materiali di nidificazione, consentono agli animali di esibire comportamenti specifici per specie, che a loro volta diminuiscono il livello di stress e aumentano il benessere generale degli animali. I materiali di nidificazione forniscono anche una zona notte satura di feromoni calmanti che aiuta con l’alloggiamento di più topi maschi nella stessa gabbia. L’area di nidificazione viene spostata nella gabbia pulita al momento del cambio della gabbia per aiutare a prevenire l’aggressività nei maschi mentre vengono introdotti in un nuovo ambiente. ³

Procedure

1. Manipolazione di topi immunocompetenti (convenzionali)

È stato dimostrato che i disturbi immunitari dei topi sono molto simili a quelli degli esseri umani. ² Poiché questi animali hanno capacità immunologiche limitate, le procedure di manipolazione e cura di tali animali sono state concepite per ridurre al minimo il rischio di malattie infettive mediante l’uso di controlli tecnici, dispositivi di protezione individuale per il personale addetto alla cura degli animali e procedure operative standard; mitigano la contaminazione dell’ingabbiamento e di altre attrezzature con cui gli animali sono in contatto.

Disimballaggio dai container di spedizione: ricevere animali da altre istituzioni o venditori di animali rappresenta un rischio per gli animali già ospitati all’interno della struttura per animali. Durante il transito, le scatole di trasporto degli animali possono venire a contatto con agenti patogeni. Pertanto, è necessario eseguire una procedura corretta quando si disimballano i contenitori di spedizione.
1. I requisiti minimi dei dispositivi di protezione individuale (DPI) sono guanti, camici da laboratorio o scrub puliti, una maschera antiparticolato e occhiali di sicurezza quando si maneggiano gli animali.
2. Selezionare la gabbia appropriata, compreso il coperchio della barra metallica e la parte superiore della barriera. La gabbia deve essere fornita con lettiere e materiali di nidificazione appropriati. Tutte le intasagioni devono essere preparate e collocate nell’area ricevente prima dell’arrivo degli animali.
3. All’arrivo, le scatole di trasporto vengono collocate in una stanza sicura e a temperatura controllata. Quindi, esaminare il contenitore per eventuali danni.
4. Disinfettare le superfici esterne del contenitore di spedizione con un prodotto a biossido di colina per distruggere eventuali agenti patogeni dannosi. Assicurarsi che il disinfettante sia a contatto con la scatola in conformità con le raccomandazioni dei produttori, di solito 15-30 minuti.
5. Posizionare il contenitore in una stazione di trasferimento degli animali (ATS). L’ATS fornisce un flusso d’aria filtrato HEPA all’interno della cappa che fornisce protezione dagli allergeni creando una barriera d’aria sottovuoto tra l’utente e la zona di lavoro. Ciò garantisce un’esposizione minima ai peli di animali / peli e al materiale della lettiera della gabbia. L’aria unidirezionale protegge anche gli animali dall’aria della stanza circostante, riducendo al minimo la possibilità di contaminazione.
6. Una volta aperto il container, valutare la salute generale degli animali. Prendi nota di eventuali animali feriti o malati.
7. Metti gli animali nelle gabbie assemblate nelle dimensioni del gruppo appropriate. Il raggruppamento dovrebbe essere conforme alle normative spaziali e al protocollo sperimentale a cui saranno assegnati.
8. Coprire la gabbia con il coperchio della barra metallica. Fissare il divisore sul coperchio della barra metallica per creare due aree sul coperchio.
9. Selezionare il cibo appropriato e posizionare il cibo in un lato del coperchio della barra metallica. Lasciare aperto il secondo lato per consentire una migliore circolazione dell’aria.
10. L’acqua sarà fornita tramite bottiglie d’acqua o un sistema di irrigazione automatico. Le bottiglie d’acqua vengono utilizzate per i topi appena svezzati per garantire che siano in grado di mantenere i loro livelli di idratazione. Per l’ingabbiamento IVC con irrigazione automatica, caricare il tubo di irrigazione prima di posizionarlo sul rack.
11. Posizionare la gabbia su un rack. Se si utilizzano IPC, verificare che la gabbia sia completamente inserita nel rack e che il tubo del sorso sia fissato al sistema di irrigazione.
Gabbia che cambia topi convenzionali
1. Le gabbie per animali vengono cambiate in un ATS. L’ATS viene disinfettato alla fine di ogni sessione.
2. È possibile aprire una sola gabbia alla volta.
3. L’intasamento preparato con la lettiera appropriata e i materiali di nidificazione viene portato nella stanza degli animali. Un piccolo numero di gabbie sono collocate nell’ATS.
4. Le gabbie IVC con tubi di sorso interni devono essere caricate per forzare l’acqua nel sorso per rimuovere lo spazio morto dell’aria nel tubo del sorso. Se non caricati correttamente, i mouse potrebbero non essere in grado di fornire una pressione sufficiente sul tubo del sorso per rimuovere l’aria da esso.
5. I requisiti minimi dei dispositivi di protezione individuale (DPI) sono guanti, camici da laboratorio o scrub puliti, una maschera antiparticolato e occhiali di sicurezza quando si maneggiano gli animali.
6. Una gabbia di animali da cambiare viene collocata in una nuova gabbia e quindi nell’ATS.
7. Gli animali vengono trasferiti a mano o con l’uso di una pinina imbottita. I guanti vengono cambiati tra le gabbie o tra gruppi di topi. I guanti possono anche essere disinfettati con una sostanza chimica non tossica tra le gabbie.
8. È stato dimostrato che il trasferimento dell’area di nidificazione dei topi in una gabbia pulita aiuta con la transizione nella gabbia pulita, specialmente per i maschi ospitati in gruppo. Anche altri elementi di arricchimento vengono trasferiti nella nuova gabbia.
9. Una volta che la parte superiore della gabbia o l’alimentatore viene inserito nella nuova gabbia, viene aggiunto il cibo.
10. Il piano della barriera viene posizionato sulla nuova gabbia e la gabbia viene restituita al rack.
11. Le gabbie IVC devono essere correttamente agganciate al rack per garantire che le valvole dell’aria e dell’acqua siano inserite.

2. Manipolazione di topi immunocompromessi

Disimballaggio dai container di spedizione
1. Gli animali immunocompromessi devono essere disimballati in condizioni sterili. Tutti gli individui che maneggiano topi immunodefici devono indossare un camice sterilizzato a vapore, maschera, cofano per capelli e guanti sterili. La tecnica asettica dovrebbe essere usata in ogni momento quando si consegnano questi animali.
2. Tutte le attrezzature e l’intasamento dovrebbero essere state sterilizzate a vapore, radiazioni UV o sterilizzate chimicamente con un ammollo in etanolo al 70% per almeno 30 minuti Ci sono due opzioni per l’intasamento sterile: intasamento standard che è stato avvolto e sterilizzato a vapore, o intasamento che viene sterilizzato – di solito attraverso l’irradiazione – dal venditore. Queste gabbie sono un uso unico, unità usa e getta.
3. Prima di manipolare i topi sotto il cappuccio a flusso laminare, il cappuccio viene spruzzato con etanolo al 70% con il ventilatore in funzione. Il ventilatore del cappuccio deve rimanere sempre acceso per mantenere l’ambiente sterile. Dopo ogni utilizzo, il cappuccio viene spruzzato con un disinfettante e pulito da tutti i detriti e nuovamente spruzzato con etanolo al 70%.
4. In modo ottimale, sono necessarie due persone per la corretta ricezione dei topi immunocompromessi: una per gestire gli animali usando tecniche asettiche (il tecnico sterile) e una che gestirà gli oggetti contaminati (il tecnico non sterile). La persona non sterili dovrebbe comunque indossare un abito pulito a maniche lunghe; cappotto da laboratorio o smock; maschera; cofano; e guanti sterili per prevenire la contaminazione dell’interno sterile nel caso in cui debbano raggiungere il cofano.
5. Preparare una cappa a flusso laminare come descritto in precedenza. È preferibile avere una cappa dedicata agli animali immunocompromessi. Si raccomanda che la cappa sia dotata di luci di sterilizzazione a raggi ultravioletti (UV) che possono essere utilizzate per sterilizzare l’interno della cappa tra un uso e l’altro. Un timer viene utilizzato per garantire che la superficie della cappa abbia un’adeguata esposizione ai raggi UV.
6. L’esterno di tutte le forniture che vengono inserite nel cofano viene spruzzato con alcol al 70%, incluso l’imballaggio esterno di cibo, acqua e intasamento.
7. I contenitori di spedizione vengono spruzzati con una soluzione di biossido di cloro prima di essere collocati nel cofano. Una volta messi nel cappuccio, devono rimanere aperti per 15-30 minuti.
8. Il conduttore di animali designato apre il cibo sterile e l’acqua sotto il cofano.
9. Il tecnico non sterilia apre la scatola di spedizione sotto il cofano. Il tecnico non sterili deve prestare attenzione per evitare il contatto con le superfici interne della cappa e l’interno della scatola di spedizione.
10. Il conduttore di animali apre la gabbia sterile e prepara la gabbia posizionando cibo e acqua sulla parte superiore della gabbia. I topi vengono quindi rimossi dalla scatola di spedizione e collocati nella gabbia sterile.
11. Le condizioni degli animali sono notate dal conduttore di animali sterili. Tutti gli animali che appaiono malati o hanno lesioni evidenti saranno segregati. Tutte le gabbie contrassegnate con animali che richiedono attenzione veterinaria saranno posizionate per la manipolazione, il cambio della gabbia o la manipolazione sperimentale per ultimo, per ridurre la potenziale contaminazione di altri animali.
12. La persona non sterilista rimuoverà la gabbia popolata dal cofano. Le gabbie possono essere posizionate su un rack standard come gabbie statiche o su un rack ventilato come IPC. Negli IPC, i topi dovrebbero essere dotati di materiali di nidificazione aggiuntivi per aiutare con la regolazione termica.
13. Il conduttore di animali dovrebbe cambiare i guanti dopo ogni contenitore di spedizione per evitare possibili contaminazioni incrociate di gruppi di animali. Il numero del contenitore di spedizione è registrato sulla scheda della gabbia per tracciare l’origine degli animali in caso di malattia.
14. Le forniture inutilizzate possono essere salvate per un uso futuro a condizione che il contenitore originale possa essere risigillato. Il cibo inutilizzato viene rimosso dalla stanza.
15. I topi devono sottoporsi a un periodo di acclimatazione minimo di una settimana prima dell’uso sperimentale.
Cambio gabbia per topi immunocompromessi
1. Le gabbie per topi vengono cambiate almeno una volta alla settimana, o più spesso se ritenuto necessario.
2. I passaggi per la preparazione della cappa, la preparazione della gabbia e i DPI del personale sono gli stessi del disimballaggio degli animali.
3. Gli animali vengono trasferiti a mano o con l’uso di pinse di forza imbottite. Il conduttore di animali designato dovrebbe reglove dopo ogni 5-10 gabbie, se i guanti sono strappati o contaminati, o se un animale appare malato.
4. Eventuali gabbie con animali che appaiono malati saranno posizionate alla fine dell’ordine di cambio della gabbia, per evitare la possibile esposizione di animali sani a patogeni o contaminanti.
5. Se il cibo e/o l’acqua devono essere aggiunti alla gabbia prima del successivo cambio di gabbia programmato, deve essere fatto in modo asettico sotto il cofano preparato.

Poiché topi e ratti rappresentano oltre il novanta per cento degli animali utilizzati per la ricerca biomedica, prendersi cura di questi organismi è fondamentale per l’esito degli esperimenti. Queste procedure di cura iniziano fin dall’inizio con il disimballaggio degli animali dai container di spedizione, al cambio della gabbia, al mantenimento di condizioni abitative adeguate, fornendo una dieta appropriata e garantendo un ambiente adatto. Sebbene esistano procedure generali che si applicano alla maggior parte dei topi e dei ratti in laboratorio, alcuni animali, come quelli immunocompromessi, richiedono un’attenzione aggiuntiva per sostenerli a fini sperimentali.

Questo video descriverà gli standard e le procedure di cura essenziali sia per gli animali immunocompetenti che per quelli immunocompromessi. E infine, illustreremo alcuni esperimenti di esempio che mostrano come gli scienziati usano questa conoscenza per diversi scopi di ricerca.

Ricevere animali da altre istituzioni rappresenta un rischio per gli animali già ospitati all’interno della struttura, poiché durante il transito, le scatole di trasporto possono venire a contatto con agenti patogeni. Pertanto, è necessario utilizzare una procedura adeguata quando si disimballano i contenitori di spedizione.

Prima di maneggiare qualsiasi animale, è importante indossare gli appositi dispositivi di protezione individuale o DPI. Il DPI minimo da indossare è un cappotto da laboratorio, guanti, occhiali di sicurezza e una maschera di tipo chirurgico che ridurrà l’esposizione a polvere e allergeni. Il prossimo passo è selezionare le gabbie appropriate per gli animali in arrivo. Quindi, fornire la gabbia con lettiere e materiali di nidificazione appropriati. E porta le gabbie preparate nella stanza di ricezione a temperatura controllata, in modo che siano pronte per il trasferimento prima dell’arrivo degli animali.

All’arrivo della spedizione, posizionare le scatole di trasporto in un luogo sicuro nella stanza di ricezione. Esaminare il contenitore per eventuali danni e disinfettare le superfici esterne per distruggere eventuali agenti patogeni dannosi. Assicurarsi che il disinfettante sia a contatto con la scatola per almeno 15-30 minuti, secondo le raccomandazioni del produttore. Quindi, posizionare il contenitore nella stazione di trasferimento degli animali o ATS. Questa stazione offre high efficiency particulate air, o HEPA, flusso d’aria unidirezionale filtrato all’interno della cappa. HEPA protegge l’utente dagli allergeni e protegge gli animali dall’aria della stanza circostante, riducendo al minimo la possibilità di contaminazione. Quindi, apri il container di spedizione e valuta la salute generale dei roditori. Prendi nota di qualsiasi animale che sembra essere ferito o malato. Successivamente, posizionali nella gabbia già assemblata nelle dimensioni del gruppo appropriate, copri la gabbia con il coperchio della barra metallica e fissa il divisore per creare due aree. Selezionare il cibo appropriato e posizionarlo su un lato e lasciare aperto il secondo lato per consentire una migliore circolazione dell’aria. Infine, se gli animali non vengono collocati su una rastrelliera con irrigazione automatica, aggiungere una bottiglia d’acqua per garantire un adeguato approvvigionamento idrico. Ricorda, l’ATS deve essere disinfettato alla fine di ogni sessione e il ventilatore deve essere spento durante la disinfezione.

Per il cambio della gabbia, posizionare le due gabbie – una gabbia fresca con il materiale di lettiera appropriato e la gabbia usata con gli animali – nell’ATS. Si possono trasferire gli animali dalla vecchia gabbia alla nuova gabbia a mano o con l’uso di una pincaccia imbottita. Entrambi questi metodi sono stati discussi in un altro video di questa raccolta. Ricorda che è possibile aprire solo una gabbia di animali alla volta. Per i topi maschi o le femmine con una cucciolata, è stato dimostrato che il trasferimento dell’area di nidificazione dei topi nella gabbia pulita aiuta gli animali con la transizione. Una volta che la parte superiore della gabbia è posizionata sulla nuova gabbia, trasferire il cibo dalla vecchia parte superiore della gabbia alla nuova parte superiore e aggiungere altro cibo se necessario. Quindi, posizionare la parte superiore della barriera e riportare la gabbia al rack. È buona norma cambiare i guanti tra gabbie o tra gruppi.

La procedura di disimballaggio per gli animali immunocompromessi è un po ‘diversa, poiché le cose devono essere sterili. Si raccomanda che il ventilatore all’interno del cappuccio sia acceso almeno 24 ore prima dell’uso. Come per gli animali immunocompenenti, all’arrivo della spedizione spruzzare il contenitore con una soluzione disinfettante nella stanza di ricezione e lasciarlo aperto per 15-30 minuti. All’ATS designato per i topi immunocompromessi, spruzzare il cappuccio a flusso laminare con etanolo al 70% 30 minuti prima di manipolare gli animali. È ideale che due persone partecipino a questa attività di disimballaggio: una persona sarebbe il tecnico sterile che indossa il camice sterilizzato a vapore e un doppio paio di guanti sterili per gestire gli animali usando tecniche asettiche e l’altra sarebbe il tecnico non sterile che indossa un camice di isolamento pulito e un paio di guanti per gestire oggetti contaminati. Entrambi dovrebbero indossare una maschera, un cofano per capelli e occhiali di sicurezza.

Prima di aprire il contenitore di spedizione all’interno del cofano, posizionare tutte le forniture e l’incanatura in queste e spruzzare il loro esterno con alcool. E all’arrivo della spedizione, posiziona la scatola degli animali ricevuta nel cofano e spruzza anche con etanolo al 70%. Esistono due opzioni per l’intasamento sterile, o l’intasamento standard che è stato avvolto e sterilizzato a vapore, o unità monouso che sono state sterilizzate utilizzando l’irradiazione dal fornitore.

Iniziare la procedura di disimballaggio aprendo il cibo sterile, seguito dall’apertura della scatola di trasporto. A questo punto, il conduttore dovrebbe scartare il primo paio di guanti sterili. Successivamente, la persona non sterile scarta la gabbia sterile e la passa asetticamente al conduttore animale che quindi rimuove il cofano e il coperchio della barra metallica e li mette a testa in giù nel cofano. Successivamente, il tubo del sorso sulla gabbia viene riempito d’acqua nella stazione situata nel cofano. Infine, il conduttore di animali mette l’animale nella gabbia, lo fissa con il coperchio della barra metallica, aggiunge cibo e mette il cofano in posizione. Si noti che il ventilatore del cappuccio deve rimanere sempre acceso per mantenere l’ambiente sterile. Alla fine, la persona non sterile rimuove la gabbia popolata dal cofano e la posiziona su un rack appropriato. Per evitare possibili contaminazioni incrociate tra gruppi, il conduttore di animali dovrebbe cambiare i guanti dopo ogni container di spedizione.

Per il cambio di gabbia degli animali immunocompromessi, la preparazione del cappuccio e delle gabbie e dei DPI è la stessa che per il disimballaggio di questi animali. E la tecnica di trasferimento è la stessa degli animali immunocompetenti, ma in condizioni sterili.

Ora discutiamo le condizioni di alloggio appropriate per gli animali, che è un altro aspetto importante della fornitura di cure essenziali. Topi e ratti sono principalmente alloggiati in cassette da scarpe con un fondo solido contenente materiale da letto. La tipica gabbia per topi fornisce 75 pollici quadrati di spazio sul pavimento, che è adeguato per un massimo di 5 topi adulti. D’altra parte, una gabbia per ratti ha l’area di 142 pollici quadrati ed è adeguata per 2 ratti adulti. Le gabbie statiche sono solitamente coperte da un coperchio a barra metallica e il materiale filtrante viene aggiunto sopra la parte superiore della gabbia come un cofano. Le gabbie ventilate individualmente, o IPC, hanno anche un coperchio e un cofano a barra metallica, ma sono posizionate su un rack che fornisce il flusso d’aria nella gabbia. Ciò elimina la necessità di cambiare la gabbia con la 1tà delle gabbie statiche, il che può essere utile per gli animali immunocompromessi.

Tutti i sistemi di intasamento hanno una disposizione per l’approvvigionamento di cibo e acqua. Ci sono alimentatori collocati all’interno della gabbia per animali o una sezione del coperchio della barra metallica viene utilizzata per la conservazione degli alimenti. Il cibo deve essere posto in modo tale che non sia sporcato dagli animali. L’acqua viene solitamente fornita tramite una bottiglia d’acqua posizionata sulla parte superiore della gabbia o tramite una valvola di irrigazione automatica che è un componente integrato della gabbia animale. Per l’opzione della valvola per bere, quando la gabbia è inserita su un rack, l’acqua viene trasportata nel tubo per un sistema di irrigazione automatico progettato per soddisfare le esigenze dell’animale in tutta la struttura per animali.

La Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio afferma che tutti gli attrezzi di intasamento devono essere disinfettati almeno ogni 2 settimane. Alcune gabbie e accessori potrebbero dover essere cambiati più spesso come dettato dal livello di odore e ammoniaca nell’involucro.

Ora parliamo di un adeguato approvvigionamento di cibo e acqua per gli animali immunocompetenti e immunocompromessi. Ci sono molti mangimi disponibili in commercio con composizioni variabili di proteine, carboidrati e grassi. Idealmente, i mangimi dovrebbero comprendere il 15-19% di proteine, il 44% di carboidrati e il 4-9% di grassi. Per gli animali immunocompromessi, assicurarsi che il mangime sia stato sterilizzato.

L’acqua del rubinetto, o osmosi inversa che è acqua RO, può essere utilizzata per animali immunocompetenti, ma per gli animali immunodeficienti, l’acqua può essere una fonte di contaminazione e quindi deve essere sterilizzata. La sterilità nell’acqua viene mantenuta aggiungendo 2 gocce di acido cloridrico molare 12 a 8 litri di acqua RO, che acidificherà l’acqua a un pH di 2,5-3 e limiterà la crescita batterica. Quindi versare l’acqua in singole bottiglie e coprirle con un foglio di alluminio. Posizionare i coperchi delle bottiglie con i tubi del sorso separatamente in un sacchetto per autoclave e mettere tutto in un’autoclave per la sterilizzazione a vapore.

Ora discutiamo le condizioni ambientali standard essenziali per la cura degli animali.

A livello di gabbia, l’edilizia sociale è obbligatoria a meno che non sia scientificamente giustificato o se un animale è incompatibile con tutti gli altri. Arricchire l’ambiente con capanne di carta e materiali di nidificazione consente agli animali di esibire comportamenti specie-specifici come la costruzione del nido e la scavatura, che a sua volta diminuisce il livello di stress e aumenta il benessere generale degli animali. I materiali di nidificazione forniscono anche una zona notte satura di feromoni calmanti che aiuta con l’alloggiamento di più topi maschi nella stessa gabbia. Come accennato in precedenza, spostare l’area di nidificazione nella gabbia pulita al momento del cambio della gabbia aiuta a prevenire l’aggressività, specialmente nei maschi, poiché gli animali vengono introdotti in un nuovo ambiente. Per gli animali nudi atimici, si dovrebbe prendere in considerazione la possibilità di fornire lettiera aggiuntiva e materiali di nidificazione di tipo carta triturata nelle loro gabbie per aiutare con la termoregolazione.

A livello della stanza, la temperatura per topi e ratti dovrebbe essere compresa tra 68 e 79 ° F. Il livello di umidità della stanza dovrebbe essere del 30-70%, poiché livelli più bassi possono causare una condizione nota come coda ad anello. Il terzo parametro della stanza è l’illuminazione. Ciò include l’intensità della luce e i cicli. Normalmente, la stanza degli animali è impostata su un ciclo di luce di 12 ore / 12 ore di buio. L’intensità luminosa dovrebbe variare in base all’attività nella stanza. Quando i tecnici lavorano, è possibile utilizzare livelli di illuminazione più elevati. Tuttavia, dovrebbe essere abbassato a circa 325 lux una volta conclusa tutta l’attività. Infine, anche il flusso d’aria all’interno della stanza dovrebbe essere attentamente controllato. Un minimo di 10-15 cambi d’aria di aria fresca al 100% dovrebbe verificarsi ogni ora. Questo diminuisce i microbi e gli odori nella stanza degli animali.

Infine, vediamo come i ricercatori stanno usando questa conoscenza sull’alloggiamento degli animali da laboratorio, la dieta e le preferenze ambientali nei loro esperimenti.

Come discusso in precedenza, gli animali da laboratorio generalmente mostrano un comportamento di costruzione del nido, che riduce lo stress, e i ricercatori lo hanno usato come indicatore del benessere degli animali. In questo particolare esperimento, gli scienziati hanno sviluppato un sistema imparziale per segnare il nido costruito e poi lo hanno usato per studiare l’effetto della temperatura ambiente sul comportamento di costruzione del nido. Come puoi vedere, un aumento della temperatura ha causato un calo significativo del punteggio, evidenziando il ruolo della temperatura circostante nel benessere degli animali.

Dato che topi e ratti amano i carboidrati, i ricercatori hanno utilizzato mangimi di diverse forme per testare la funzione motoria dell’animale. Ciò include l’analisi della destrezza durante diversi tipi di attività di manipolazione degli alimenti e l’esame del comportamento di raggiungimento a seguito di interventi chirurgici o farmacologici.

Infine, è noto che topi e ratti sono notturni e non preferiscono le aree illuminate. Gli scienziati usano questa conoscenza per costruire un ambiente per studiare l’ansia in queste specie. Ad esempio, qui le ricerche hanno introdotto gli animali in un semplice campo aperto e hanno studiato il tempo trascorso dal tipo selvatico e dai topi knockout nelle zone interne ed esterne archiviate, per analizzare l’effetto del gene knockdown sul comportamento simile all’ansia.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alle procedure di cura essenziali per topi e ratti. Ora dovresti avere una migliore comprensione delle misure che dovresti adottare per garantire che l’ambiente e la manipolazione di questi animali non causino alcun danno alla salute degli animali e dovresti anche sapere come i ricercatori possono modificare questi parametri per raggiungere diversi obiettivi scientifici. Come sempre, grazie per aver guardato!

Applications and Summary

La cura e la manipolazione adeguate degli animali utilizzati nella ricerca biomedica è fondamentale per l’esito degli esperimenti. Regolamenti e linee guida stabilite dettano molte delle pratiche utilizzate. Tuttavia, sono necessarie misure aggiuntive per topi e ratti che hanno deficienze immunitarie per mitigare l’esposizione accidentale a patogeni opportunistici. Quando le pratiche aderiscono a procedure stabilite, la salute e il benessere degli animali da esperimento vengono migliorati e si ottengono risultati sperimentali migliori.

References

Belizário J.E. 2009. Immunodeficient Mouse Models: An Overview. The Open Immunology Journal. 2. 79-85.
Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.
Van Loo, P. 2001. Modulation of aggression in male mice: influence of cage cleaning regime and scent marks. In Male Management: Coping with Aggression Problems in Male Laboratory Mice. Surrey: UK.

Transcript

Since mice and rats account for over ninety percent of the animals used for biomedical research, taking proper care of these organisms is critical to the outcome of the experiments. These care procedures begin right at the start with unpacking the animals from shipping containers, to cage changing, to maintaining proper housing conditions, providing appropriate diet, and ensuring suitable environment. Although, there are general procedures that apply to the majority of mice and rats in the laboratory, some animals, such as those that are immunocompromised, require additional attentiveness in order to sustain them for experimental purposes.

This video will describe the standards and essential care procedures for both immunocompetent and immunocompromised animals. And lastly, we will illustrate some example experiments showing how scientists use this knowledge for different research purposes.

Receiving animals from other institutions poses a risk to the animals already housed within the facility, as during transit, the transport boxes can come in contact with pathogenic agents. Therefore, a proper procedure should be employed when unpacking the shipping containers.

Before handling any animals, it is important to wear the appropriate Personal Protective Equipment, or PPE. The minimum PPE to wear is a lab coat, gloves, safety glasses, and a surgical type mask that will reduce the exposure to dust and allergens. The next step is to select appropriate cages for incoming animals. Then, furnish the cage with appropriate bedding and nesting materials. And take the prepared cages to the temperature-controlled receiving room, so that they are ready for transfer prior to the arrival of the animals.

Upon shipment arrival, place the transport boxes in a secure place in the receiving room. Examine the container for any damage and disinfect the outer surfaces to destroy any harmful pathogens. Make sure that the disinfectant is in contact with the box for at least 15-30 minutes, as per manufacturer’s recommendations. Then, place the container in the Animal Transfer Station, or ATS. This station offers High Efficiency Particulate Air, or HEPA, filtered unidirectional airflow within the hood. HEPA protects the user from allergens and shields the animals from the surrounding room air, minimizing the chance of contamination. Next, open the shipping container and evaluate the overall health of the rodents. Make a note of any animal that appears to be injured or ill. After that, place them into the already assembled cage in the proper group sizes, cover the cage with the wire bar lid and secure the divider to create two areas. Select the appropriate food and place it in one side and leave the second side open to allow for better air circulation. Lastly, if the animals are not being placed on a rack with automatic watering, add a water bottle to ensure adequate water supply. Remember, the ATS has to be disinfected at the end of each session, and the blower must be off when disinfecting.

For cage changing, place the two cages-a fresh cage with the appropriate bedding material and the used cage with the animals-in the ATS. One can transfer the animals from the old cage to the new cage by hand or with the use of a padded forceps. Both these methods have been discussed in another video of this collection. Remember only one cage of animals can be opened at a time. For male mice or females with a litter, it has been demonstrated that transferring the nesting area of the mice into the clean cage assists the animals with the transition. Once the cage top is placed on the new cage, transfer food from the old cage top to the new top and add more food if necessary. Next, place the barrier top, and return the cage to the rack. It is a good practice to change gloves between cages or between groups.

The unpacking procedure for immunocompromised animals is a bit different, as things need to be sterile. It is recommended that the blower inside the hood be on at least 24 hours before use. Like for immunocompenent animals, upon shipment arrival spray the container with a disinfectant solution in the receiving room and leave it unopened for 15-30 minutes. At the ATS designated for immunocompromised mice, spray the laminar flow hood with 70% ethanol 30 minutes prior to manipulating animals. It is ideal to have two people participate in this unpacking activity — one person would be the sterile technician wearing the steam sterilized gown and double pair of sterile gloves to handle the animals using aseptic techniques and the other would be the non-sterile technician wearing a clean isolation gown and a pair of gloves to handle contaminated items. Both should be wearing a, mask, hair bonnet, and safety glasses.

Before opening the shipping container inside the hood, place all the supplies and caging in these and spray their exterior of with alcohol. And upon shipment arrival, place the received animal box in the hood and sprays it with 70% ethanol as well. There are two options for sterile caging, either standard caging that has been wrapped and steam sterilized, or disposable units that has been sterilized using irradiation by the vendor.

Start the unpacking procedure by opening the sterile food, followed by opening of the transport box. At this point, the handler should discard the first pair of sterile gloves. Next, the non-sterile person unwraps the sterile cage and aseptically passes it to the animal handler who then removes the bonnet and the wire bar lid, and places them upside down in the hood. Subsequently, the sipper tube on the cage is filled with water at the station located in the hood. Lastly, the animal handler places the animal into the cage, secures it with the wire bar lid, adds food and sets the bonnet in place. Note that the hood blower should remain on at all times to maintain the sterile environment. At the end, the non-sterile person removes the populated cage from the hood and places it on an appropriate rack. To avoid possible cross contamination between groups, the animal handler should change gloves after each shipping container.

For cage changing of the immunocompromised animals, the preparation of the hood and cages and PPE are the same as for the unpacking of these animals. And the transfer technique is same as the immunocompetent animals, but under sterile conditions.

Now let’s discuss appropriate housing conditions for the animals, which is another important aspect of providing essential care. Mice and rats are primarily housed in shoebox type caging with a solid bottom containing bedding material. The typical mouse cage provides 75 square inches of floor space, which is adequate for a maximum of 5 adult mice. On the other hand, a rat cage has the area of 142 square inches and is adequate for 2 adult rats. Static cages are usually covered with a wire bar lid and filter material is added over the cage top as a bonnet. Individually ventilated cages, or IVCs, also have a wire bar lid and bonnet, but they are placed on a rack that provides airflow into the cage. This eliminates the need to change the cage as often as static cages, which may be beneficial for immunocompromised animals.

All caging systems have a provision for food and water supply. There are either feeders placed within the animal cage or a section of the wire bar lid is used for food storage. Food must be placed such that it is not soiled by the animals. Water is usually supplied via a water bottle placed on the top of the cage, or via an automatic watering drinking valve that is a built in component of the animal cage. For drinking valve option, when the cage is engaged onto a rack, water is transported into the tube for an automatic watering system that is designed to meet the needs of the animal throughout the animal facility.

The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals states that all caging implements must be sanitized at least every 2 weeks. Some cages and accessories may need to be changed more often as dictated by the level of odor and ammonia in the enclosure.

Now let’s talk about proper food and water supply for immunocompetent and immunocompromised animals. There are many commercially available feeds with variable protein, carbohydrate, and fat compositions. Ideally, feeds should comprise 15-19% protein, 44% carbohydrates, and 4-9% fat. For immunocompromised animals, make sure that the feed has been sterilized.

Tap water, or reverse osmosis that is RO water, can be used for immunocompetent animals, but for immunodeficient animals, water can be a source of contamination, and therefore needs to be sterilized. Sterility in the water is maintained by adding 2 drops of 12 molar hydrochloric acid to 8 liters of RO water, which will acidify the water to a pH of 2.5-3 and limit bacterial growth. Then pour the water in individual bottles and cover them with aluminum foil. Place the bottle lids with sipper tubes separately in an autoclave bag, and put everything in an autoclave for steam sterilization.

Now let’s discuss the standard environmental conditions essential for animal care.

At the cage level, social housing is mandatory unless scientifically justified or if an animal is incompatible with all others. Enriching the environment with paper huts and nesting materials allows the animals to exhibit species-specific behaviors like nest building and burrowing, which in turn decreases the stress level and increases the overall well-being of the animals. Nesting materials also provide a sleeping area that is saturated in calming pheromones that assists with the housing of multiple male mice in the same cage. As mentioned previously, moving the nesting area to the clean cage upon cage changing helps prevent aggression, especially in males, as the animals are introduced into a new environment. For athymic nude animals, one should consider providing additional bedding and shredded paper type nesting materials in their cages to assist with thermoregulation.

At the room level, the temperature for mice and rats should be between 68 and 79° F. The room humidity level should be 30-70%, as lower levels can result in a condition known as ringtail. The third room parameter is lighting. This includes light intensity and cycles. Normally, the animal room is set to 12-hour light/12-hour dark cycle. The lighting intensity should vary in accordance with the activity in the room. When technicians are working, higher lighting levels can be used. However, it should be lowered to approximately 325 lux once all activity is concluded. Lastly, the airflow within the room should also be carefully controlled. A minimum of 10-15 air changes of 100% fresh air should occur every hour. This decreases microbes and odors in the animal room.

Lastly, let’s see how researchers are using this knowledge about lab animals housing, diet and environment preferences in their experiments.

As discussed earlier, lab animals generally exhibit nest-building behavior, which reduces stress, and researchers have used this as an indicator of animal welfare. In this particular experiment, scientists developed an unbiased system to score the nest built and then used it study the effect of ambient temperature on the nest-building behavior. As you can see, an increase in temperature caused a significant drop in the score, highlighting the role of surrounding temperature in animal welfare.

Given that mice and rats love carbohydrates, researchers have used feed of different shapes to test animal’s motor function. This includes analyzing dexterity during different types of food handling tasks, and examining reaching behavior following surgical or pharmacological interventions.

Lastly, it is known that mice and rats are nocturnal and they don’t prefer lit-up areas. Scientists use this knowledge to build environment to study anxiety in these species. For example, here the researches introduced animals into simple open field and studied the time spent by the wild type and knockout mice in the inner and outer filed zones, to analyze the effect gene knockdown on anxiety-like behavior.

You’ve just watched JoVE’s introduction to essential care procedures for mice and rats. You should now have a better understanding of the measures one should take to ensure that the environment and handling of these animals does not cause any harm to animal’s health and you should also know how researchers can modify these parameters to achieve different scientific goals. As always, thanks for watching!