Biodistribuzione dei vettori di nanofarmaci: applicazioni del microscopio elettronico a scansione (SEM)

1. Iniezione di nanoparticelle e prelievo di organi

1. Iniettare nanoparticelle in un topo anestetizzato per via endovenosa per consentire il targeting passivo.
2. Nei momenti desiderati, cioè 1, 4 e 8 settimane, dopo l'iniezione, eutanasizzano umanamente i topi secondo le linee guida dell'American Veterinary Medical Association (AVMA).
3. Aprire la cavità corporea e rimuovere chirurgicamente gli organi di interesse. Mettere gli organi in formalina tamponata al 10% di fosfato in un contenitore di polipropilene fino alla preparazione del campione.

2. Preparazione del campione di tessuto

1. Utilizzare una pinna per trasferire il tessuto di topo dal fissativo alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Scuotere il campione per 30 minuti, sostituendo il PBS ogni 10 minuti.
2. Rimuovere il tessuto e asciugare con un kimwipe. Quindi posizionarlo in uno stampo di plastica contenente un composto di temperatura di taglio ottimale (OCT). Conservare a -80 °C durante la notte.
3. Il giorno successivo, trasferire il campione al criostato e impostare la temperatura a -23 °C.
4. Etichettare i vetrini con il tipo di organo e la dimensione delle nanoparticelle e posizionarli su uno scaffale nel criostato.
5. Coprire il mandrino criostato con OCT e posizionare il campione sopra. Abbassare lo stantuffo dell'estrattore sul campione e lasciarlo equilibrare per 3-5 minuti.
6. Montare il mandrino sul portacampioni e orientarlo in modo che la lama possa tagliare dritto attraverso il campione congelato. Avvicinare il campione alla lama per un rivestimento ruvido. Impostare lo spessore a 30 μm e affettare diverse sezioni fino a produrre una fetta tagliata uniformemente.
7. Passare alla faccia fine diminuendo lo spessore della sezione a 7-8 μm. Raccogliere una sezione affettata premendo un vetrino etichettato sulla fetta. Posizionare due diapositive su ciascuna diapositiva e conservare in un rack di scorrimento. Lasciare asciugare a temperatura ambiente.
8. Una volta asciutti, disidratare i campioni immergendo il portaslivelli in etanolo al 50% per 3 minuti per rimuovere l'OCT. Quindi trasferire il rack all'80% di etanolo per 3 minuti prima di posizionare il rack in un rapporto 1: 1 di metanolo freddo ad acetone per 10 minuti a -20 ° C.
9. Rimuovere la griglia scorrevole e scaricare il solvente in eccesso su un tovagliolo di carta. Dopo 20-30 minuti, posizionare i vetrini in una scatola di diapositive e conservare in un congelatore a -20 °C fino all'imaging.

3. Imaging ad alta risoluzione con SEM ed EDS

1. Preparare il campione come descritto in "SEM Imaging di campioni biologici". Quindi caricare il campione nel SEM.
2. Accendere il SEM e regolare la distanza di lavoro a circa 5 mm e la tensione di accelerazione e la corrente del fascio a 25 keV, che normalmente sarebbero troppo alte per un campione biologico. Tuttavia, il campione è rivestito per conduttività e protezione.
3. Inizia l'imaging e ingrandisci fino a circa 1.000-2.000X di ingrandimento per vedere le strutture che conterrebbero le nanoparticelle. Si noti che senza il rilevamento back-scatter (BSD) non è possibile distinguerli al di sotto di una certa profondità.
4. Inserite il BSD con gli stessi parametri e spostate lo stage nella direzione z alla stessa distanza di lavoro di prima.
5. Inizia a visualizzare all'incirca lo stesso ingrandimento e controlla di essere in grado di vedere un contrasto elevato in presenza di nanoparticelle. Salva le immagini.
6. Utilizzare diverse configurazioni BSD (in cui le cariche sul rilevatore si allineano) per scegliere quella che mostra il contrasto più elevato per le nanoparticelle.
7. Zoom su un'area ad alto contrasto che mostra una nanoparticella o un grumo di nanoparticelle.
8. Aprire la^2a telecamera della camera e guardare come si inserisce l'EDS nel sistema premendo il pulsante giù sull'attacco SEM. Una volta che l'EDS è vicino ma non tocca il BSD o la pistola, rilascia il pulsante.
9. Apri il programma Aztec sul computer EDS (ancora sulla postazione di lavoro) e acquisisci un'immagine dal SEM. Usa il metodo "punta e spara" per fare clic su un'area molto densa in contrasto e nanoparticelle.
10. L'EDS mostrerà lo spettro dei raggi X caratteristici da quel punto. Cerca sia i picchi di bario che quelli di titanio da identificare sul grafico. Ciò conferma che ciò che si sta osservando sono effettivamente le nanoparticelle e non alcun tipo di contaminazione.
11. Tornare all'esempio e utilizzare il software Atlas per mappare i bordi dell'organo sulla diapositiva. Seleziona il protocollo "Organo" per creare un'immagine a mosaico dell'area e lasciala funzionare (questo può richiedere al massimo alcune ore).
12. Una volta che l'immagine composita è stata creata e cucita dal software, esportarla come file Tif.
13. Apri il file Tif in ImageJ, un software open source, e regola i valori di soglia di contrasto per evidenziare le aree di contrasto molto elevato (cioè le nanoparticelle). Utilizzare le funzioni integrate per quantificare il volume delle nanoparticelle utilizzando la dimensione dei pixel definita nel protocollo Organ (dovrebbe essere di circa 100 nm).
14. Mentre questa procedura si riferisce solo al campione di 1 settimana del polmone del topo, questa procedura viene ripetuta con i campioni di altre settimane e altri organi per compilare un grafico che mostra la distribuzione.
15. Dopo aver calcolato la biodistribuzione per ogni organo per ogni settimana, i grafici di biodistribuzione mostreranno i cambiamenti nella biodistribuzione e nella concentrazione di nanoparticelle nel corso delle 8 settimane. Questi mostrano la concentrazione di picco e forniscono anche informazioni su quanto tempo ci vuole perché le nanoparticelle si schiarino dall'organo.