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La microscopia è un metodo ampiamente utilizzato per visualizzare la struttura dettagliata dei campioni. I microscopi ottici, che focalizzano la luce attraverso una serie di lenti per ingrandire i campioni, sono in uso da secoli con il primo microscopio composto che è apparso nel 17° secolo. Durante quel periodo, Antonie van Leeuwenhoek fu il primo a osservare batteri, lieviti, globuli rossi e circolazione nei vasi capillari, apportando significativi contributi scientifici e aprendo la strada a progressi microscopici.
I microscopi ottici sono ancora oggi ampiamente utilizzati nella ricerca e in ambito clinico per la diagnosi medica. Tuttavia, negli ultimi 60 anni, è emersa la microscopia confocale che illumina il campione attraverso un foro stenopeico per aumentare la risoluzione ottica e il contrasto.
Questo video illustrerà i principi di funzionamento della microscopia ottica e confocale, dimostrerà come vengono analizzate le immagini ad alta risoluzione e discuterà diverse applicazioni della microscopia nel campo dell'ingegneria biomedica.
Iniziamo discutendo i fondamenti della microscopia confocale. La microscopia ottica si basa sul principio di focalizzare la luce su un campione per visualizzarne la struttura dettagliata. Un microscopio è formato da due componenti di ingrandimento; la lente dell'obiettivo, che mette a fuoco un'immagine reale di un oggetto, e l'oculare, che mette a fuoco un'immagine virtuale ingrandita prima che venga ricevuta dall'occhio. L'ingrandimento totale si ottiene moltiplicando gli ingrandimenti di queste due lenti.
La messa a fuoco della luce fornisce un piano di messa a fuoco specificato in cui l'ingrandimento e la luce della lampada si incontrano tutti nello stesso punto, il che offre la migliore risoluzione nell'immagine. Quando si trova al di fuori del piano focale, l'area di illuminazione è più ampia e i fasci di luce interferiscono con altre parti del campione, causando la sfocatura dell'immagine. Mentre i microscopi ottici illuminano e visualizzano l'intero campione in vista, un microscopio confocale utilizza un foro di spillo tra il tavolino del campione e il rivelatore in modo che solo un piccolo raggio di luce venga focalizzato a una profondità ristretta alla volta.
Di conseguenza, l'unica area visibile del campione è il punto di messa a fuoco, che fornisce un'immagine ben risolta. Tuttavia, con una risoluzione più elevata, viene visualizzata solo una piccola parte di questo campione alla volta. Spostando il campione sul piano X-Y, è possibile eseguire una scansione raster della sua superficie. Per ogni punto della scansione, la messa a fuoco viene ottimizzata regolando l'altezza Z per accedere a diversi piani focali. Ciò garantisce una risoluzione massima punto per punto del campione di immagine.
Ora usiamo questi principi di microscopia e risoluzione dell'immagine per visualizzare il cervello di un topo utilizzando sia un microscopio confocale che ottico.
Dopo aver esaminato i principi fondamentali della microscopia, eseguiamo ora una misurazione utilizzando un microscopio confocale. Innanzitutto, accendi il microscopio alla postazione di lavoro del computer. Quindi caricare il campione sul tavolino e centrarlo sotto la lente. Ora apri il software di imaging e seleziona Crea nuovo lavoro. Vai alla colonna della topografia e scegli il pulsante dell'assistente. Selezionare l'ingrandimento più basso, che per questo microscopio è 2,5x. Quindi utilizzare il manipolatore del microscopio 3D per regolare la posizione Z del campione e mettere a fuoco il campione. Premere il pulsante sul lato in modo che appaia una luce blu intorno ai bordi. Ciò consente un movimento e una messa a fuoco Z più precisi. Ora cattura un'immagine panoramica.
Aumentare lentamente l'ingrandimento dell'obiettivo e regolare l'intensità della luce e la messa a fuoco per ottenere l'ingrandimento desiderato. Utilizzare il manipolatore 3D nelle direzioni X e Y per selezionare diverse aree di interesse sul campione. Una volta scattata un'immagine a basso ingrandimento, premere Avanti per acquisire un punto di riferimento. Utilizzare il punto di riferimento predefinito o specificarne uno nuovo nell'angolo del campione, quindi premere Avanti. A questo punto, modificare gradualmente l'obiettivo alla risoluzione desiderata per il campione. Per questo campione, viene utilizzato un obiettivo 20x per visualizzare le cellule nel tessuto cerebrale del topo. Assicurarsi che ci sia spazio per diminuire la distanza di lavoro.
Per definire la distanza di raccolta delle fette, andare prima alla pagina di definizione del campo di misura e utilizzare il manipolatore 3D per regolare infine il campione nella direzione Z. Fare clic su Imposta per ultimo quando la parte superiore del campione è a fuoco e fare clic su Imposta per primo quando la parte inferiore del campione è a fuoco. Assicurarsi che il numero di sezioni calcolate non superi 1.000, altrimenti il programma avrà esito negativo. Verificare che non siano presenti pixel rossi, il che indica che l'intensità della luce è sovrasatura.
Infine, premi Fine per acquisire l'immagine della tomografia. Quando si apre il software di tomografia, selezionare la scheda degli studi per visualizzare i dati in 3D ed eseguire misurazioni 2D e 3D.
Ora scattiamo un'immagine utilizzando un microscopio ottico digitale. Innanzitutto, accendi il microscopio e apri il software di imaging. Quindi caricare il campione sul tavolino e centrarlo sotto la lente. Quando il software di imaging è aperto, selezionare un lavoro dall'elenco dei modelli o scegliere l'esame gratuito. Quindi, acquisire un'immagine panoramica che mostri l'intero palco. Utilizzare il controller per modificare la messa a fuoco e la posizione dell'immagine.
Una volta completata l'acquisizione, posizionare un sistema di coordinate sull'immagine. Il sistema di coordinate predefinito si trova al centro dello stage. Per una maggiore flessibilità, le coordinate possono essere modificate manualmente.
Quindi assegna un nome all'esempio e seleziona il pulsante della fotocamera. Premere il pulsante live mentre si naviga nel campione e spostare la messa a fuoco verso il basso finché il campione non è chiaramente a fuoco. Se necessario, utilizzare la linguetta di illuminazione e apertura per regolare l'illuminazione. Quindi acquisire un'immagine del campione.
Utilizza gli strumenti sotto il pannello di ottimizzazione dell'immagine, come l'inclinazione dell'obiettivo, i livelli di illuminazione sul campione e la luminosità e il contrasto nell'immagine per ottimizzare l'immagine alla nitidezza desiderata. Ora tocca lo strumento matita per eseguire le misurazioni. Utilizzare gli strumenti di distanza e area per misurare la dimensione delle celle sul campione.
Infine, vai alla scheda del flusso di lavoro dei risultati e configura il layout del report. Toccare il pulsante Salva per salvare il lavoro per ulteriori analisi.
Analizziamo ora le immagini di un cervello di topo che sono state scattate con microscopi ottici confocali e digitali. L'immagine confocale con ingrandimento 50x è ad alta risoluzione e fornisce una messa a fuoco profonda con diversi livelli di profondità delle informazioni.
Sulla mappa tomografica, l'altezza di questo campione varia da uno a nove micron. Caratteristiche come l'ampiezza, il profilo di rugosità e i parametri della curva possono essere ulteriormente analizzate. Tuttavia, l'intero vetrino del tessuto cerebrale sezionato può essere visualizzato utilizzando un microscopio ottico digitale.
Ingrandendo una sezione si mostrano più dettagli del campione, ma con una risoluzione molto più bassa rispetto a quella ottenuta con il microscopio confocale. Questo campione è stato ottenuto con un ingrandimento di 300x. Un software dedicato offre strumenti per misurare le dimensioni della sezione trasversale, come il diametro, nonché per calcolare l'area interna della sezione.
La microscopia digitale, ottica e confocale sono strumenti standard utilizzati in varie applicazioni biomediche. L'oftalmoscopia laser a scansione o SLO è una tecnica di imaging non invasiva ampiamente utilizzata in oftalmologia clinica per diagnosticare e monitorare lo sviluppo di malattie retiniche.
SLO produce immagini stereoscopiche ad alto contrasto che visualizzano la microglia. I macrofagi residenti nella retina, che sono coinvolti in diverse malattie della retina. La microscopia confocale viene utilizzata anche nell'imaging di cellule vive che consente ai ricercatori di visualizzare la funzione microscopica delle cellule biologiche in tempo reale.
Questa tecnica viene utilizzata, tra l'altro, per studiare la migrazione e la proliferazione cellulare e la dinamica delle proteine. Qui, i recettori transmembrana e i lisosomi sono stati marcati con coloranti fluorescenti e la loro colocalizzazione è stata analizzata utilizzando l'imaging timelapse per studiare l'internalizzazione del recettore.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla microscopia digitale, ottica e confocale. A questo punto è necessario comprendere i principi della microscopia e della risoluzione delle immagini, come utilizzare i microscopi ottici e confocali per l'imaging di campioni biologici e le diverse applicazioni del loro utilizzo nel campo dell'ingegneria biomedica.
Grazie per l'attenzione.
