Generazione di anticorpi: produzione di anticorpi monoclonali attraverso l'utilizzo di ibridomi

Gli anticorpi sono un potente strumento per la ricerca e la diagnosi, il che significa che spesso è necessario produrli in grandi quantità.

Il primo passo per generare anticorpi è iniettare l'antigene di interesse in un animale ospite. L'antigene attiva le cellule B dell'ospite, che quindi producono e rilasciano anticorpi specifici per quell'antigene. Quindi, viene effettuato uno screening regolare degli antisieri dell'animale ospite per la presenza dell'anticorpo bersaglio, utilizzando ELISA o un altro metodo di rilevamento. Una volta rilevato, la milza dell'animale ospite, che contiene le cellule B, viene rimossa. Se tutte le cellule B della milza sono ora isolate, ciò dovrebbe includere una popolazione che secerne anticorpi contro l'antigene di interesse. Ci riferiamo a questa popolazione come policlonale, perché ogni cellula probabilmente si è legata a un epitopo diverso dell'antigene e, quindi, ha generato il proprio anticorpo individuale e unico.

Per generare anticorpi monoclonali, anticorpi sollevati per riconoscere un epitopo specifico, la singola cellula B che produce l'anticorpo desiderato deve prima essere isolata e coltivata. Sfortunatamente, le cellule B non sopravvivono bene in coltura. Quindi, per superare questo ostacolo, gli scienziati fondono le cellule B con cellule di mieloma immortale, dando vita agli ibridomi. Queste cellule vengono poi coltivate in un mezzo selettivo che consente solo agli ibridomi di crescere e rilasciare anticorpi. Anche in questo caso, il terreno viene sottoposto a screening utilizzando un metodo come l'ELISA per l'anticorpo desiderato. Una volta rilevato, gli ibridomi vengono clonati tramite un processo chiamato diluizione limitante, una diluizione seriale della coltura madre, che dovrebbe portare alla semina di singole cellule nei pozzetti di una piastra di screening. Ciò consente la crescita di ibridomi da una singola cellula madre, producendo una linea cellulare monoclonale che rilascia solo l'anticorpo desiderato. Queste linee monoclonali possono essere espanse in fiasche di coltura tissutale per produrre grandi quantità di anticorpi monoclonali. Dopodiché, quando le cellule iniziano a morire, gli anticorpi possono essere precipitati dal mezzo con solfato di ammonio. Normalmente, in soluzione, gli anticorpi interagiscono con l'acqua attraverso interazioni idrofile. Tuttavia, l'ammonio e il solfato sono ioni altamente carichi che separano le molecole d'acqua dagli anticorpi, diminuendo la solubilità degli anticorpi e provocandone la precipitazione.

Per iniziare, controlla prima l'elenco dei materiali e prepara tutti i supporti, le forniture e le superfici di lavoro per il protocollo.

Quindi, accendi un bagnomaria e impostalo a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 10 millilitri di RPMI completo a una provetta conica da 15 millilitri e 15 millilitri di RPMI completo a un pallone di coltura cellulare T75 e metterli da parte. Usando cautela e indossando gli opportuni dispositivi di protezione individuale, rimuovere la fiala congelata contenente cellule di ibridoma dal deposito di azoto liquido. Per rilasciare la pressione all'interno del flaconcino, allentare leggermente il tappo. Ora, incubare con cura la fiala nel bagnomaria, assicurandosi che il tappo rimanga sopra la superficie dell'acqua per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione. Quando le cellule sono quasi scongelate, il che in genere richiede circa due minuti, spostare la fiala sulla cappa di coltura tissutale.

Quindi, pulire l'esterno del flaconcino con etanolo al 70% prima di rimuovere il tappo. Utilizzando una pipetta sterile, trasferire le cellule nella provetta conica che contiene 10 millilitri di terreno RPMI completo. Quindi, centrifugare la provetta per cinque minuti a 1200 giri/min. Dopo la centrifugazione, riportare la provetta sulla cappa di tessuto e pulire l'esterno della provetta con etanolo. Senza disturbare il pellet, scartare il surnatante e quindi aggiungere cinque millilitri di terreno RPMI completo fresco e pipettare delicatamente su e giù per ririspendere. Quindi, trasferire le cellule nel pallone di coltura cellulare T75 e posizionare il pallone all'interno di un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Lasciare che le celle raggiungano circa l'80% di confluenza, operazione che di solito richiede circa tre giorni. Si noti che le cellule di ibridoma non sono aderenti e cresceranno sospese nel terreno. Il tempo per raggiungere una confluenza sufficiente può variare in base al numero iniziale di cellule vive e al tipo di cellula di ibridoma utilizzata.

Una volta che le cellule sono sufficientemente confluenti, utilizzare una pipetta sterile da 25 millilitri per trasferirle dal pallone di coltura in una provetta da centrifuga conica. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 1200 giri/min per cinque minuti. Mentre le cellule sono nella centrifuga, aggiungere 18 millilitri di RPMI completo in ciascuno dei tre nuovi palloni di coltura cellulare T75 e metterli da parte. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in sei millilitri di RPMI completo. Quindi, aggiungere due millilitri di sospensione cellulare in ciascuno dei tre nuovi fiaschi per colture cellulari. Infine, posizionare i palloni in un incubatore impostato al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius e incubare fino a quando i palloni non sono confluenti all'80%, circa tre giorni.

A questo punto, le cellule sono pronte per continuare la loro crescita nel terreno privo di siero progettato per le linee cellulari di ibridoma, come il terreno HB Basal Liquid contenente l'integratore HB101, disponibile in commercio. Trasferire le cellule da ciascun pallone di coltura cellulare in provette da centrifuga coniche e quindi pellettare le cellule mediante centrifugazione a 1200 giri/min per cinque minuti. Ora, aggiungi 230 millilitri di terreno integrato senza siero HB101 in ciascuna delle sei fiasche di coltura cellulare quadrate da 225 centimetri e mettile da parte. Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 10 millilitri di terreno HB101 integrato. Quindi, in ogni pallone di coltura cellulare, aggiungere cinque millilitri di sospensione cellulare. Metti i palloni nell'incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius e continua a far crescere le cellule per circa tre settimane. Durante questo periodo, le cellule produrranno e rilasceranno l'anticorpo monoclonale di interesse nel terreno di coltura e l'anticorpo sarà pronto per la purificazione quando le cellule inizieranno a morire.

Per rimuovere i detriti cellulari dai terreni di coltura contenenti anticorpi, versare il contenuto dei palloni di coltura in provette per un rotore ad angolo fisso. Posizionare le provette nel rotore e assicurarsi che sia correttamente bilanciato prima della centrifugazione. Far girare le valvole a 10.000 giri/min per otto minuti. Durante la centrifugazione dei campioni, posizionare un becher di plastica da due litri con una barra di agitazione in un secchiello per il ghiaccio e quindi posizionare il secchiello per il ghiaccio su una piastra di agitazione.

Quindi, attacca un tappo filtrante da 500 millilitri a una bottiglia da un litro. Collegare questa unità filtro per flaconi a un aspirapolvere domestico utilizzando il tubo appropriato. Quindi, versare il surnatante che contiene l'anticorpo nella parte superiore del filtro. Centrifugare il terreno rimanente per separare i detriti cellulari dal surnatante contenente anticorpi. Quando la parte superiore del filtro è piena di surnatante, avviare l'aspirapolvere. Quindi, quando la bottiglia di raccolta da un litro è quasi piena, rimuovere la parte superiore del filtro e versare il surnatante filtrato nel becher da due litri con ghiaccio. Ripetere le fasi di filtrazione fino a quando tutto il surnatante non viene lavorato.

Quando tutto il campione è stato elaborato, pesare 295 grammi di solfato di ammonio per un litro di surnatante filtrato. Avvia la piastra di agitazione e aggiungi lentamente il solfato di ammonio al surnatante nelle prossime due ore. Ciò impedisce un'elevata concentrazione localizzata di sale di solfato di ammonio che può causare la precipitazione di proteine indesiderate. Una volta aggiunto tutto il solfato di ammonio, coprire il becher con un foglio di alluminio e spostarlo, insieme alla piastra di agitazione, in una stanza fredda a quattro gradi Celsius e impostarlo per mescolare la soluzione di anticorpi durante la notte.

La mattina successiva, versare la soluzione di anticorpi contenenti solfato di ammonio dal becher da due litri in tubi puliti per il rotore ad angolo fisso. Centrifugare le provette a 6500 giri/min per 20 minuti senza interruzioni per pellettare l'anticorpo sul fondo delle provette. Quindi, aspirare sottovuoto il surnatante, facendo attenzione a non aspirare il pellet morbido. Continuare a utilizzare lo stesso set di provette per raccogliere l'anticorpo pellettato dal resto del surnatante contenente solfato di ammonio. Dopo l'ultima aspirazione, risospendere ogni pellet di anticorpi in circa un millilitro di PBS.

Per rimuovere il solfato di ammonio dalla soluzione anticorpale, tagliare prima circa un pollice di tubo di dialisi per ogni millilitro di soluzione anticorpale. Quindi, pulire il tubo con acqua distillata e fare un nodo su un'estremità del tubo. Riempire il tubo con acqua distillata per verificare la presenza di perdite dal nodo. Se non ci sono perdite dopo alcuni minuti, svuotare l'acqua dal tubo.

Quindi, pipettare la soluzione di anticorpi nel tubo. Per recuperare la maggior quantità possibile di anticorpi, sciacquare i tubi con altri 0,25 millilitri di PBS e trasferirli anche nel tubo. Fissare la parte superiore del tubo il più vicino possibile alla soluzione con una clip per dialisi. Quindi, fissare la parte superiore del tubo alla parte superiore esterna di un becher da quattro litri con la parte piena del tubo appesa al becher. Ora, porta il bicchiere nella cella frigorifera a quattro gradi Celsius e posizionalo su un piatto per mescolare. Riempire il bicchiere fino in cima con PBS e aggiungere una barra di agitazione. Lasciare agitare il tubo e la soluzione per una notte per circa otto ore. La mattina successiva, sostituire il PBS nel becher con PBS fresco e lasciare il becher mescolare di nuovo per circa otto ore. Più tardi quella sera, ripeti il processo un'ultima volta. Al mattino, aprire la provetta per dialisi e quindi trasferire la soluzione anticorpale dal tubo a provette coniche da 15 millilitri. Per rimuovere eventuali precipitanti che potrebbero essersi formati durante la dialisi, centrifugare le provette per cinque minuti a 1200 giri/min. Infine, trasferire il surnatante in tubi freschi.

Per quantificare la concentrazione di anticorpi, effettuare prima una diluizione di 20 volte aggiungendo cinque microlitri da un'aliquota di anticorpi a 95 microlitri di PBS. Quindi, pipettare l'anticorpo diluito in una cuvetta e utilizzare uno spettrofotometro per registrare la concentrazione a 280 nanometri. Quindi, calcola la concentrazione di anticorpi utilizzando la formula mostrata. Infine, etichettare le fiale con tappo a vite con il nome dell'anticorpo, la concentrazione, la data di preparazione e, se applicabile, il numero di lotto e il nome dello sperimentatore, quindi aliquotare l'anticorpo nelle fiale con tappo a vite etichettate. Questi possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Le rese di esempio utilizzando la linea di ibridoma CD317 o PDCA-1 anti-topo 120G8 variavano tra 44 e 99,6 milligrammi, che in genere produce, in media, una quantità di 67,3 milligrammi. È importante notare che ogni ciclo di produzione con la stessa linea cellulare di ibridoma può essere leggermente diverso nella quantità di anticorpi monoclonali disponibili alla fine.