Generazione di anticorpi: produzione di anticorpi monoclonali attraverso l'utilizzo di ibridomi
42,971 Views
Panoramica
Fonte: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3e Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Gli anticorpi policlonali sono definiti come una raccolta di anticorpi diretti contro diversi determinanti antigenici di un antigene o di più antigeni (1). Mentre gli anticorpi policlonali sono potenti strumenti per identificare le molecole biologiche, c’è una limitazione importante: non sono in grado di distinguere tra antigeni che condividono determinanti antigenici. Ad esempio, quando l’albumina sierica bovina viene utilizzata per immunizzare un animale, le cellule B con Ig di superficie diversa risponderanno a diversi determinanti antigenici sull’albumina sierica bovina. Il risultato è una miscela di anticorpi nell’antiserum. Poiché l’albumina sierica bovina condivide alcuni epitopi con l’albumina sierica umana in regioni evolutivamente conservate della proteina, questo antisiero dell’albumina sierica anti-bovina reagirà anche con l’albumina sierica umana. Pertanto, questo antiserum non sarà utile per distinguere tra albumine sieriche bovine e umane.
Sono stati adottati diversi approcci per superare il problema della specificità degli antisieri policlonali. Uno è assorbendo gli anticorpi indesiderati facendo passare l’antiserum attraverso una colonna cromatografica di antigeni immobilizzati (2). Questo metodo è noioso e spesso incapace di rimuovere completamente gli anticorpi indesiderati. Un altro approccio è quello di isolare le singole cellule B produttrici di anticorpi ed espanderle in coltura. Tuttavia, come la maggior parte delle normali cellule non trasformate, le cellule B non sopravvivono in coltura a lungo termine.
Per superare l’incapacità delle cellule B di sopravvivere in coltura, un approccio è quello di preparare un ibridoma a cellule mieloma-B. Nel 1847, Henry Bence-Jones scoprì che i pazienti con mieloma multiplo, un tumore linfoide, producevano una grande quantità di anticorpi (3). Le cellule B in questi pazienti sono diventate maligne e crescono in modo incontrollabile. Poiché le cellule B maligne sono derivate da un singolo clone, sono identiche e producono solo un singolo tipo di anticorpo(cioèun anticorpo monoclonale o mAb). Tuttavia, la maggior parte di queste cellule del mieloma producono anticorpi di specificità sconosciute. Nel 1975, fondendo una cellula di mieloma con una cellula B, Cesar Milstein e Georges Kohler sono riusciti a produrre un ibridoma che può essere coltivato indefinitamente in vitro e produce un numero illimitato di anticorpi monoclonali di nota specificità antigenica (4). Il razionale alla base del loro approccio è quello di combinare le proprietà immortali della cellula mieloma e le proprietà di produzione di anticorpi della cellula B. La loro tecnica ha rivoluzionato la produzione di anticorpi e fornisce un potente mezzo per l’identificazione e la purificazione di molecole biologiche utilizzando anticorpi monoclonali.
Generalmente, la preparazione di un anticorpo monoclonale richiede diversi mesi. La procedura generale include i seguenti passaggi:
- Immunizzazione e screening del titolo anticorpale
- Fusione di cellule B produttrici di anticorpi e cellule di mieloma
- Crescita selettiva dell’ibridoma
- Screening degli ibridomi per la produzione dell’anticorpo monoclonale desiderato
- Clonazione limitando la diluizione – un processo in cui le cellule vengono diluite a una concentrazione per consentire statisticamente di aggiungere meno di 1 cellula ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Alcuni pozzedi finiranno con 0 cellule e alcuni avranno 1 cella. I pozzeggi con seme con 1 cellula alla fine cresceranno in una popolazione monoclonale di cellule.
- Crescita dell’ibridoma e preparazione dell’anticorpo monoclonale
Questo protocollo si concentra sull’ultimo passo: la crescita dell’ibridoma e la preparazione dell’anticorpo monoclonale. L’anticorpo viene purificato dal surnatante di coltura mediante precipitazione del solfato di ammonio (spesso indicato come salatura) – un metodo comunemente usato per rimuovere le proteine da una soluzione. Le proteine in soluzione formano legami idrogeno, insieme ad altre interazioni idrofile, con l’acqua attraverso i loro gruppi polari e ionici esposti. Quando vengono aggiunte concentrazioni di ioni piccoli e altamente carichi (come ammonio o solfato), questi gruppi competono con le proteine per legarsi all’acqua. Questo rimuove le molecole d’acqua dalla proteina e diminuisce la sua solubilità, con conseguente precipitazione della proteina.
Procedura
Nota: La tecnica di coltura cellulare sterile deve essere mantenuta quando si maneggiano le cellule di ibridoma e il mezzo in modo sterile (ad esempio, in un armadio di biosicurezza) fino alle fasi di purificazione degli anticorpi.
1. Scongelamento delle cellule di ibridoma congelato
- Incubare il flaconcino contenente le cellule di ibridoma congelate in un bagno d’acqua a 37°C fino a quando non si è appena scongelato (circa 2 minuti).
- Aggiungere le cellule scongelate in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPMI completo (RPMI integrato con 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 1mM di piruvato di sodio, 1x aminoacidi non essenziali, 50 μM di 2-Mercaptoetanolo, 10 mM HEPES).
- Centrifugare per 5 minuti a 1200 RPM per lavare via eventuali congelanti contaminanti.
- Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante liquido e risusciere il pellet cellulare in 5 ml di RPMI fresco completo. Quindi, aggiungere le cellule a un pallone di coltura tissutale T75 contenente 15 ml di RPMI completo (il volume finale di RPMI è di 20 ml).
- Far crescere le cellule in un incubatore standard a 37°C con il 5% di CO2. Le cellule non sono aderenti mentre sono in coltura.
2. Espansione dell’ibridoma
- Lasciare che le cellule si espandano per circa 3 giorni fino a quando il pallone è confluente all’80%.
Nota: Questa quantità di tempo può variare in base al numero iniziale di cellule, nonché alle differenze intrinseche nei tassi di crescita delle diverse cellule. È importante che le cellule siano nella fase di crescita esponenziale. - Una volta che il pallone iniziale raggiunge una confluenza di ~ 80%, rimuovere le celle da questo pallone T75 iniziale, metterle in un tubo conico della centrifuga e girare (1200 RPM per 5 min) per pellettizzare le celle.
- Riaspensionare le celle in 6 mL di RPMI completo, quindi distribuire la sospensione cellulare in tre nuovi palloni T75 (2 mL/pallone contenente 18 mL RPMI). Incubare questi tre palloni T75 a 37 ° C con il 5% di CO2 fino a quando non sono confluenti ~ 80% (questo dovrebbe richiedere circa 3 giorni).
3. Produzione di anticorpi in mezzo privo di siero
Nota: A questo punto, le cellule sono pronte a continuare la loro crescita in un mezzo privo di siero progettato per la crescita di linee cellulari di ibridomi. In questo protocollo, utilizziamo il mezzo liquido basale HB pronto all’uso, disponibile in commercio, contenente il prodotto di supplemento HB101.
- Le celle di ciascuno dei tre palloni T75 (a ~ 80% di confluenza) vengono raccolte e centrifugate (1200 RPM per 5 min).
- Il pellet cellulare di ciascun matraccio T75 viene riconsosciato in un mezzo privo di siero HB101 integrato da 10 mL e quindi aggiunto a due palloni T225 integrati con mezzo privo di siero HB101 (cioè 5 mL di sospensione cellulare in ciascuno dei 6 palloni contenenti ~ 220-240 mL HB101 in ciascun pallone).
- Continuare a far crescere le cellule in palloni T225 e hb101 a 37 ° C con il 5% di CO2 per tre settimane o fino a quando le cellule iniziano a morire. Le cellule producono mAb durante queste 3 settimane e lo secernono nel terreno di coltura. Una volta che le cellule stanno iniziando a morire, non producono più alcun mAb.
4. Purificazione degli anticorpi – Giorno 1
Nota: A questo punto, la sterilità non ha bisogno di essere mantenuta, quindi non è necessario maneggiare il supporto in modo sterile (ad esempio, in un armadio di biosicurezza). Inoltre, gli ibridomi non sono considerati un agente di “livello BSL2”.
- Versare i mezzi dai palloni in tubi per un rotore ad angolo fisso. Ruotare i tubi in una centrifuga con un rotore ad angolo fisso a 10.000 giri / min per 8 minuti. Questo passaggio è progettato per rimuovere i detriti cellulari dal surnatante di coltura.
Nota: Le dimensioni dei tubi possono variare a seconda del rotore utilizzato. La cosa importante da ricordare è avere lo stesso volume nei tubi per garantire che il rotore sia correttamente bilanciato prima della centrifugazione. È probabile che l’intero volume del supporto non si adatti alla centrifuga in una sola volta. I mezzi rimanenti saranno centrifugati in seguito (fase 4.5) utilizzando gli stessi tubi. - Preparare un becher di plastica da 2 L con una barra di agitazione in un secchio circondato da ghiaccio. Mettere su un piatto di agitazione.
- Fissare una parte superiore del filtro da 500 ml su una bottiglia da 1 L. Collegare l’unità filtrante superiore della bottiglia al vuoto della casa tramite un tubo appropriato.
- Versare il surnatante dal punto 4.1 (che contiene ancora il mAb prodotto dalle cellule dell’ibridoma) nella parte superiore del filtro.
- Continuare a utilizzare lo stesso set di tubi per i detriti delle celle di pellet dal supporto (il pellet continuerà a costruire). Attendere di eseguire il vuoto fino a quando la parte superiore del filtro è piena e un altro lotto di surnatante è pronto per essere versato. Non lasciare asciugare il filtro o il filtraggio diventerà molto lento.
- Quando il flacone da 1 L è vicino al pieno, rimuovere la parte superiore del filtro e versare il surnatante nel becher da 2 L preparato al punto 4.2. Ricollegare la parte superiore del filtro. Tieni traccia del volume.
- Ripetere le fasi di centrifugazione e filtrazione fino a quando tutto il mezzo viene elaborato.
- Misurare 295g di solfato di ammonio per 1L di surnatante filtrato raccolto. Mentre si mescola, aggiungere lentamente il solfato di ammonio al surnatante nelle prossime due ore (~ 25 g ogni 15 minuti) per evitare un’alta concentrazione localizzata di sale di solfato di ammonio che potrebbe causare la precipitazione di proteine indesiderate.
- Una volta aggiunto tutto il solfato di ammonio, coprire il becher con un foglio e spostarsi con la piastra di agitazione a 4 ° C (ad esempio, frigorifero walk-in o cella frigorifera). Mescolare durante la notte. Per solubilizzare il sale è necessaria una costante agitazione della soluzione, ma un’agitazione prolungata può portare alla denaturazione delle proteine nella soluzione all’interfaccia superficie/aria.
- Lavare i tubi utilizzando il rotore ad angolo fisso.
5. Purificazione degli anticorpi – Giorno 2
- Versare il solfato di ammonio contenente surnatante dal becher da 2L in tubi per un rotore ad angolo fisso. Centrifuga con rotore ad angolo fisso a 6500 RPM per 20 minuti senza freno.
- Aspirare sottovuoto il surnatante, facendo attenzione a non aspirare il pellet in quanto sarà morbido. Continuare a utilizzare lo stesso set di tubi per raccogliere il pellet dal solfato di ammonio contenente surnatante.
- Dopo l’ultima aspirazione, risospenare ogni pellet (che contiene anticorpi) in ~ 1 ml pbS.
- Rimuovere il solfato di ammonio dalla soluzione precipitata di mAb mediante dialisi contro grandi volumi di PBS. Per fare ciò, tagliare prima circa 1 pollice di tubo di dialisi (ad esempio, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Tubi di dialisi di cellulosa cut-off Dalton) per ogni mL di soluzione mAb. Bagnare il tubo con dH2O. Legare un nodo in un’estremità del tubo e riempire con dH2O per verificare che il nodo non perda. Svuotare dH2O dal tubo.
- Pipetta PBS/soluzione anticorpale nel tubo. Risciacquare i tubi con un PBS aggiuntivo di 0,25 ml e trasferirle nel tubo.
- Fissare la parte superiore del tubo il più vicino possibile alla soluzione con una clip per dialisi arancione.
- Fissare la parte superiore del tubo sulla parte superiore esterna di un becher da 4 L. Lasciare che la parte riempita del tubo penda nel becher. Riempire il becher con PBS e aggiungere una barra di agitazione.
- Mescolare durante la notte per ~ 8 ore a 4 ° C.
- Sostituire il PBS nel becher con PBS fresco e mescolare per ~ 8 ore altre due volte.
- Trasferire l’anticorpo dal tubo a tubi conici da 15 o 50 ml. Centrifugare per 5 minuti a 1200 RPM per rimuovere qualsiasi precipitato che potrebbe essersi formato. Trasferire il surnatante in un tubo fresco.
- Diluire un’aliquota di anticorpo 1:20 con PBS (anticorpo 5 μl + 95 μl PBS). Quantitare la concentrazione anticorpale con uno spettrofotometro (in bianco con PBS) a 280 nm. Utilizzare un coefficiente di estinzione (ε) di 1,43. La concentrazione è calcolata come
- Aliquotare l’anticorpo in flaconcini a vite e conservare a -80°C.
Gli anticorpi sono un potente strumento per la ricerca e la diagnosi, il che significa che è spesso necessario produrli in grandi quantità.
Il primo passo per generare anticorpi è iniettare l’antigene di interesse in un animale ospite. L’antigene attiva le cellule B dell’ospite che poi producono e rilasciano anticorpi specifici per quell’antigene. Quindi, viene effettuato uno screening regolare degli antisieri dell’animale ospite per la presenza dell’anticorpo bersaglio, utilizzando ELISA o un altro metodo di rilevamento. Una volta rilevato, la milza dell’animale ospite, che contiene le cellule B, viene rimossa. Se tutte le cellule B della milza sono ora isolate, questo dovrebbe includere una popolazione che secerne anticorpi contro l’antigene di interesse. Ci riferiamo a questa popolazione come policlonale, perché ogni cellula probabilmente legata a un epitopo diverso dell’antigene e, quindi, ha generato il proprio anticorpo individuale e unico.
Per generare anticorpi monoclonali, anticorpi sollevati per riconoscere un epitopo specifico, la singola cellula B che produce l’anticorpo desiderato deve prima essere isolata e coltivata. Sfortunatamente, le cellule B non sopravvivono bene in coltura. Quindi, per superare questo ostacolo, gli scienziati fondono le cellule B con le cellule immortali del mieloma, con conseguente ibridomi. Queste cellule vengono quindi coltivate in un mezzo selettivo che consente solo agli ibridomi di crescere e rilasciare anticorpi. Ancora una volta, il mezzo viene sottoposto a screening utilizzando un metodo come ELISA per l’anticorpo desiderato. Una volta rilevato, gli ibridomi vengono clonati tramite un processo chiamato diluizione limitante, una diluizione seriale della coltura madre, che dovrebbe portare a seminare singole cellule nei pozzetti di una piastra di screening. Ciò consente la crescita di ibridomi da una singola cellula madre, producendo una linea cellulare monoclonale che rilascia solo l’anticorpo desiderato. Queste linee monoclonali possono essere espanse in palloni di coltura tissutale per produrre grandi quantità di anticorpi monoclonali. Dopo questo, quando le cellule iniziano a morire, gli anticorpi possono essere precipitati dal mezzo con solfato di ammonio. Normalmente, in soluzione, gli anticorpi interagiscono con l’acqua attraverso interazioni idrofile. Tuttavia, l’ammonio e il solfato sono ioni altamente carichi che separano le molecole d’acqua dagli anticorpi, diminuendo la solubilità degli anticorpi e facendoli precipitare.
Per iniziare, controlla prima l’elenco dei materiali e prepara tutti i supporti, le forniture e le superfici di lavoro per il protocollo.
Quindi, accendere un bagno d’acqua e impostarlo a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 10 millilitri di RPMI completo a un tubo conico da 15 millilitri e 15 millilitri di RPMI completo a un pallone di coltura cellulare T75 e metterli da parte. Usando cautela e indossando gli appositi dispositivi di protezione individuale, rimuovere il flaconcino congelato contenente cellule di ibridoma dallo stoccaggio di azoto liquido. Per rilasciare la pressione all’interno del flaconcino, allentare leggermente il cappuccio. Ora, incubare attentamente la fiala nel bagno d’acqua, assicurandosi che il cappuccio rimanga sopra la superficie dell’acqua per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione. Quando le cellule sono quasi scongelate, che in genere richiede circa due minuti, spostare la fiala sul cappuccio della coltura del tessuto.
Quindi, pulire l’esterno del flaconcino con etanolo al 70% prima di rimuovere il tappo. Utilizzando una pipetta sterile, trasferire le celle nel tubo conico che contiene 10 millilitri di mezzo RPMI completo. Quindi, centrifugare il tubo per cinque minuti a 1200 RPM. Dopo la centrifugazione, spostare il tubo di nuovo sulla cappa di tessuto e pulire l’esterno del tubo con etanolo. Senza disturbare il pellet, scartare il surnatante e quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo RPMI fresco completo e pipettare delicatamente su e giù per ricandidare. Quindi, trasferire le cellule al pallone di coltura cellulare T75 e posizionare il pallone all’interno di un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Consentire alle cellule di raggiungere circa l’80% di confluenza, che di solito richiede circa tre giorni. Si noti che le cellule di ibridoma non sono aderenti e cresceranno sospese nel mezzo. Il tempo per raggiungere una confluenza sufficiente può variare in base al numero iniziale di cellule vive e al tipo di cellula di ibridoma utilizzata.
Una volta che le cellule sono sufficientemente confluenti, utilizzare una pipetta sterile da 25 millilitro per trasferirle dal pallone di coltura in un tubo centrifugo conico. Pellet le celle per centrifugazione a 1200 RPM per cinque minuti. Mentre le celle sono nella centrifuga, aggiungere 18 millilitri di RPMI completo in ciascuno dei tre nuovi palloni di coltura cellulare T75 e metterli da parte. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospenare delicatamente il pellet cellulare in sei millilitri di RPMI completo. Quindi, aggiungere due millilitri della sospensione cellulare in ciascuno dei tre nuovi palloni di coltura cellulare. Infine, mettere i palloni in un incubatore impostato al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius e incubare fino a quando i palloni sono confluenti all’80% circa, circa tre giorni.
A questo punto, le cellule sono pronte a continuare la loro crescita nel mezzo privo di siero progettato per le linee cellulari di ibridoma, come il mezzo liquido basale HB disponibile in commercio contenente l’integratore HB101. Trasferire le cellule da ciascun pallone di coltura cellulare in tubi conici per centrifughe e quindi pellettare le celle mediante centrifugazione a 1200 RPM per cinque minuti. Ora, aggiungi 230 millilitri di mezzo privo di siero HB101 integrato in ciascuno dei sei palloni di coltura cellulare quadrati da 225 centimetri e metterli da parte. Quando la centrifugazione è completa, rimuovere il surnatante e risospenare ogni pellet in 10 millilitri di mezzo HB101 integrato. Quindi, in ogni pallone di coltura cellulare, aggiungere cinque millilitri della sospensione cellulare. Posizionare i palloni nell’incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius e continuare a far crescere le cellule per circa tre settimane. Durante questo periodo, le cellule produrranno e rilasceranno l’anticorpo monoclonale di interesse nel terreno di coltura e l’anticorpo sarà pronto per la purificazione quando le cellule inizieranno a morire.
Per rimuovere i detriti cellulari dal mezzo di coltura contenente anticorpi, versare il contenuto dei palloni di coltura in tubi per un rotore ad angolo fisso. Posizionare i tubi nel rotore e assicurarsi che sia correttamente bilanciato prima della centrifugazione. Ruotare i tubi a 10.000 rpm per otto minuti. Mentre i campioni sono centrifugati, posizionare un becher di plastica da due litri con una barra di agitazione in un secchiello del ghiaccio e quindi mettere il secchiello del ghiaccio su una piastra di agitazione.
Quindi, collegare un top del filtro da 500 millilitri a una bottiglia da un litro. Collegare questa unità filtrante superiore della bottiglia a un aspirapolvere domestico utilizzando il tubo appropriato. Quindi, versare il surnatante che contiene l’anticorpo nella parte superiore del filtro. Centrifugare il mezzo rimanente per separare i detriti cellulari dal surnatante contenente anticorpi. Quando la parte superiore del filtro è piena di surnatante, avviare il vuoto. Quindi, quando la bottiglia di raccolta da un litro è quasi piena, rimuovere la parte superiore del filtro e versare il surnatante filtrato nel becher da due litri sul ghiaccio. Ripetere le fasi di filtrazione fino a quando tutto il surnatante non viene elaborato.
Quando tutto il campione è stato elaborato, pesare 295 grammi di solfato di ammonio per un litro di surnatante filtrato. Avviare la piastra di agitazione e aggiungere lentamente il solfato di ammonio al surnatante nelle prossime due ore. Ciò impedisce un’alta concentrazione localizzata di sale solfato di ammonio che può causare la precipitazione di proteine indesiderate. Una volta aggiunto tutto il solfato di ammonio, coprire il becher con un foglio e spostarlo, insieme alla piastra di agitazione, in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius e impostarlo per mescolare la soluzione anticorpale durante la notte.
La mattina successiva, versare la soluzione anticorpale contenente solfato di ammonio dal becher da due litri in tubi puliti per il rotore ad angolo fisso. Centrifugare i tubi a 6500 RPM per 20 minuti senza interruzione per pellettare l’anticorpo sul fondo dei tubi. Quindi, aspirare sottovuoto il surnatante, usando cautela per non aspirare il pellet morbido. Continuare a utilizzare lo stesso set di tubi per raccogliere l’anticorpo pellettato dal resto del surnatante contenente solfato di ammonio. Dopo l’ultima aspirazione, sospendere ogni pellet di anticorpi in circa un millilitro di PBS.
Per rimuovere il solfato di ammonio dalla soluzione anticorpale, tagliare prima circa un pollice di tubo di dialisi per ogni millilitro di soluzione anticorpale. Quindi, pulire il tubo con acqua distillata e legare un nodo su un’estremità del tubo. Riempire il tubo con acqua distillata per verificare la perdita dal nodo. Se non ci sono perdite dopo pochi minuti, svuotare l’acqua dal tubo.
Quindi, pipettare la soluzione anticorpale nel tubo. Per recuperare il maggior numero possibile di anticorpi, sciacquare i tubi con ulteriori 0,25 millilitri di PBS e trasferirlo anche nel tubo. Fissare la parte superiore del tubo il più vicino possibile alla soluzione con una clip per dialisi. Quindi, fissare la parte superiore del tubo alla parte superiore esterna di un becher da quattro litri con la parte riempita del tubo appesa al becher. Ora, porta il becher nella cella frigorifera a quattro gradi Celsius e mettilo su un piatto di agitazione. Riempi il becher verso l’alto con PBS e aggiungi una barra di agitazione. Lasciare che il tubo e la soluzione si mescolino durante la notte per circa otto ore. La mattina successiva, sostituire il PBS nel becher con PBS fresco e quindi lasciare che il becher mescolmi di nuovo per circa otto ore. Più tardi quella sera, ripeti il processo un’ultima volta. Al mattino, aprire il tubo di dialisi e quindi trasferire la soluzione anticorpale dal tubo a tubi conici da 15 millilitro. Per rimuovere qualsiasi precipitante che potrebbe essersi formato durante la dialisi, centrifugare i tubi per cinque minuti a 1200 RPM. Infine, trasferire il surnatante in tubi freschi.
Per quantificare la concentrazione di anticorpi, prima fare una diluizione di 20 volte aggiungendo cinque microlitri da un’aliquota anticorpale a 95 microlitri di PBS. Quindi, pipettare l’anticorpo diluito in una cuvetta e utilizzare uno spettrofotometro per registrare la concentrazione a 280 nanometri. Quindi, calcolare la concentrazione di anticorpi utilizzando la formula mostrata. Infine, etichettare i flaconcini con tappo a vite con il nome dell’anticorpo, la concentrazione, la data di preparazione e, se applicabile, il numero di lotto e il nome dello sperimentatore, quindi aliquotare l’anticorpo nei flaconcini del tappo a vite etichettati. Questi possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino a quando necessario.
I rendimenti di esempio utilizzando la linea di ibridomi anti-mouse CD317 o PDCA-1 1 120G8 variavano tra 44 e 99,6 milligrammi, che in genere produce, in media, una quantità di 67,3 milligrammi. È importante notare che ogni ciclo di produzione con la stessa linea cellulare di ibridoma può essere leggermente diverso nella quantità di anticorpi monoclonali disponibili alla fine.
Risultati
Utilizzando questo protocollo, abbiamo ottenuto i seguenti risultati con diversi ibridomi:
Ibridoma: RB6-BC5 (ratto anti-topo Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
OD280 – 1,103
(1.103/1.43) (20) = 15,42 mg/ml
Ibridoma: GK1.5 (ratto anti-mouse CD4 IgG2b, κ mAb)
OD280 – 0,485
(0.485/1.43) (20) = 6,78 mg/ml
Ibridoma: 2.43 (ratto anti-mouse CD8 IgG2b, κ mAb)
OD280 – 0,209
(0.209/1.43) (20) = 2,92 mg/ml
Questi sono tutti risultati di esempio, ed è importante notare che ogni ciclo di produzione con lo stesso ibridoma può essere leggermente diverso nella quantità di mAb disponibile alla fine.
Applications and Summary
La procedura sopra descritta è un modo semplice e diretto per purificare gli anticorpi monoclonali dal surnatante della coltura dell’ibridoma. È importante ricordare, tuttavia, che il solfato di ammonio precipiterà altre proteine che potrebbero essere nel surnatante di coltura. Di conseguenza, le concentrazioni di anticorpi determinate dalle misurazioni dell’assorbanza sono stime. L’utente potrebbe voler valutare la purezza del campione dializzato eseguendo una piccola quantità su un gel di poliacrilammide SDS. Il mAb prodotto da un ibridoma, una volta purificato utilizzando questa metodologia, può essere utilizzato in vari modi. I sopra descritti RB6-BC5, GK1.5 e 2.43 mAb sono comunemente usati per l’esaurimento in vivo di neutrofili, cellule T CD4 e cellule T CD8, rispettivamente, nei topi. Altri mAb prodotti e purificati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per la citometria a flusso (quando coniugato a un fluoroforo o in combinazione con un Ab secondario), ELISA o Western blotting.
Riferimenti
- Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
- Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
- Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
- Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).
Trascrizione
Antibodies are a powerful tool for research and diagnosis, which means producing them in large quantities is often necessary.
The first step to generating antibodies is to inject the antigen of interest into a host animal. The antigen activates the host’s B-cells which then produce and release antibodies specific to that antigen. Then, regular screening of the host animal’s antisera for the presence of the target antibody is carried out, using ELISA or another detection method. Once it’s detected, the host animal’s spleen, which contains the B-cells, is removed. If all of the B-cells from the spleen are now isolated, this should include a population which are secreting antibodies to the antigen of interest. We refer to this population as polyclonal, because each cell likely bound to a different epitope of the antigen, and therefore, generated its own individual and unique antibody.
To generate monoclonal antibodies, antibodies raised to recognize one specific epitope, the individual B-cell that produces the desired antibody must first be isolated and cultured. Unfortunately, B-cells do not survive well in culture. So to overcome this hurdle, scientists fuse B-cells with immortal myeloma cells, resulting in hybridomas. These cells are then grown in a selective medium that only allows the hybridomas to grow and release antibodies. Again, the medium is screened using a method such as ELISA for the desired antibody. Once it is detected, the hybridomas are cloned via a process called limiting dilution, a serial dilution of the parent culture, which should result in single cells being seeded into the wells of a screening plate. This allows growth of hybridomas from a single parent cell, yielding a monoclonal cell line that only releases the desired antibody. These monoclonal lines can be expanded in tissue culture flasks to produce large quantities of monoclonal antibody. After this, as the cells begin to die off, the antibodies can be precipitated from the medium with ammonium sulfate. Normally, in solution, antibodies interact with water through hydrophilic interactions. However, ammonium and sulfate are highly-charged ions that separate the water molecules from the antibodies, decreasing the solubility of the antibodies and causing them to precipitate.
To begin, first check the list of materials and prepare all the media, supplies, and work surfaces for the protocol.
Then, turn on a water bath and set it to 37 degrees Celsius. Next, add 10 milliliters of complete RPMI to a 15-milliliter conical tube and 15 milliliters of complete RPMI to a T75 cell culture flask and set them aside. Using caution and wearing the appropriate personal protective equipment, remove the frozen vial containing hybridoma cells from the liquid nitrogen storage. To release the pressure inside the vial, loosen the cap slightly. Now, carefully incubate the vial in the water bath, making sure that the cap remains above the water surface to minimize the chances of contamination. When the cells are almost thawed, which typically takes around two minutes, move the vial to the tissue culture hood.
Then, wipe the outside of the vial with 70% ethanol before removing the cap. Using a sterile pipette, transfer the cells into the conical tube that contains 10 milliliters of complete RPMI medium. Then, centrifuge the tube for five minutes at 1200 RPM. After centrifugation, move the tube back to the tissue hood and wipe the outside of the tube with ethanol. Without disturbing the pellet, discard the supernatant and then add five milliliters of fresh complete RPMI medium and gently pipette up and down to resuspend. Next, transfer the cells to the T75 cell culture flask and place the flask inside a 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Allow the cells to reach approximately 80% confluency, which usually takes about three days. Notice that hybridoma cells are nonadherent and will grow suspended in the medium. The time to reach sufficient confluency may vary based on the starting number of live cells and the type of hybridoma cell used.
Once the cells are sufficiently confluent, use a sterile 25-milliliter pipette to transfer them from the culture flask into a conical centrifuge tube. Pellet the cells by centrifugation at 1200 RPM for five minutes. While the cells are in the centrifuge, add 18 milliliters of complete RPMI into each of three new T75 cell culture flasks and set these aside. After centrifugation, remove the supernatant and gently resuspend the cell pellet in six milliliters of complete RPMI. Next, add two milliliters of the cell suspension into each of the three new cell culture flasks. Finally, place the flasks into an incubator set to 5% carbon dioxide and 37 degrees Celsius and incubate until the flasks are around 80% confluent, approximately three days.
At this point, the cells are ready to continue their growth in the serum-free medium designed for hybridoma cell lines, such as commercially-available HB Basal Liquid medium containing the HB101 supplement. Transfer the cells from each cell culture flask into conical centrifuge tubes and then pellet the cells by centrifugation at 1200 RPM for five minutes. Now, add 230 milliliters of supplemented HB101 serum-free medium into each of six 225-centimeter-squared cell culture flasks and set them aside. When centrifugation is complete, remove the supernatant and resuspend each pellet in 10 milliliters of supplemented HB101 medium. Then, into each cell culture flask, add five milliliters of the cell suspension. Place the flasks in the 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius and continue growing the cells for about three weeks. During this time, the cells will produce and release the monoclonal antibody of interest into the culture medium and the antibody will be ready for purification when the cells start to die.
To remove the cellular debris from the antibody-containing culture media, pour the contents of the culture flasks into tubes for a fixed angle rotor. Place the tubes in the rotor and make sure it is properly balanced prior to centrifugation. Spin the tubes at 10,000 RPM for eight minutes. While the samples are centrifuging, place a two-liter plastic beaker with a stir bar into an ice bucket and then put the ice bucket on a stir plate.
Next, attach a 500-milliliter filter top to a one-liter bottle. Attach this bottle top filter unit to a house vacuum using the appropriate tubing. Then, pour the supernatant that contains the antibody into the filter top. Centrifuge the remaining media to separate the cell debris from the antibody-containing supernatant. When the filter top is full of supernatant, start the vacuum. Then, when the one-liter collection bottle is close to full, remove the filter top and pour the filtered supernatant into the two-liter beaker on ice. Repeat the filtration steps until all of the supernatant is processed.
When all of the sample has been processed, weigh 295 grams of ammonium sulfate per one liter of filtered supernatant. Start the stir plate and slowly add the ammonium sulfate to the supernatant over the next couple of hours. This prevents a localized high concentration of ammonium sulfate salt that may cause unwanted proteins to precipitate. Once all of the ammonium sulfate has been added, cover the beaker with foil and move it, along with the stir plate, to a cold room at four degrees Celsius and set it to stir the antibody solution overnight.
The next morning, pour the ammonium sulfate-containing antibody solution from the two-liter beaker into clean tubes for the fixed angle rotor. Centrifuge the tubes at 6500 RPM for 20 minutes without break to pellet the antibody at the bottom of the tubes. Next, vacuum aspirate the supernatant, using caution not to suck up the soft pellet. Continue using the same set of tubes to collect the pelleted antibody from the remainder of the ammonium sulfate-containing supernatant. After the last aspiration, re suspend each antibody pellet in approximately one milliliter of PBS.
To remove the ammonium sulfate from the antibody solution, first cut approximately one inch of dialysis tubing for each milliliter of antibody solution. Next, wipe the tubing with distilled water and tie a knot on one end of the tubing. Fill the tubing with distilled water to check for leakage from the knot. If there is no leakage after a few minutes, empty the water out of the tubing.
Next, pipette the antibody solution into the tubing. To recover as much antibody as possible, rinse the tubes with an additional 0.25 milliliters of PBS and transfer this to the tubing also. Secure the top of the tubing as close to the solution as possible with a dialysis clip. Then, tape the top of the tubing to the outside top of a four-liter beaker with the filled portion of the tubing hanging into the beaker. Now, take the beaker to the four degree Celsius cold room and place it onto a stir plate. Fill the beaker to the top with PBS and add a stir bar. Allow the tube and solution to stir overnight for approximately eight hours. The next morning, replace the PBS in the beaker with fresh PBS and then leave the beaker to stir again for approximately eight hours. Later that evening, repeat the process one final time. In the morning, open up the dialysis tube and then transfer the antibody solution from the tubing to 15-milliliter conical tubes. To remove any precipitant that may have formed during dialysis, centrifuge the tubes for five minutes at 1200 RPM. Finally, transfer the supernatant to fresh tubes.
To quantify the antibody concentration, first make a 20-fold dilution by adding five microliters from an antibody aliquot to 95 microliters of PBS. Then, pipette the diluted antibody into a cuvette and use a spectrophotometer to record the concentration at 280 nanometers. Next, calculate the antibody concentration using the formula shown. Finally, label screw cap vials with the antibody name, concentration, date of preparation, and, if applicable, batch number and experimenter name, and then aliquot the antibody into the labeled screw cap vials. These can be stored at minus 80 degrees Celsius until needed.
Example yields using the 120G8 anti-mouse CD317 or PDCA-1 hybridoma line ranged between 44 and 99.6 milligrams, which typically yields, on average, 67.3 milligrams amount. It is important to note that each production run with the same hybridoma cell line can be slightly different in the amount of monoclonal antibody available at the end.