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Microscopia a immunofluorescenza: colorazione a immunofluorescenza di sezioni di tessuto incorporato in paraffina

Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

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Immunology

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Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

5.6: Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

5.8: Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

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09:56 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4e Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Dipartimento di Medicina e Patologia di Laboratorio, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Le analisi patologiche delle sezioni tissutali possono essere utilizzate per ottenere una migliore comprensione della normale struttura tissutale e contribuire alla nostra comprensione dei meccanismi della malattia. Le biopsie tissutali, sia da pazienti che da modelli sperimentali in vivo, sono spesso conservate fissando in formalina o paraformaldeide e incorporando nella cera di paraffina. Ciò consente la conservazione a lungo termine e il seziono dei tessuti. I tessuti vengono tagliati in sezioni sottili (5 μm) utilizzando un microtomo e le sezioni sono aderenti a vetrini. Le sezioni dei tessuti possono essere colorate con anticorpi, che consentono il rilevamento di proteine specifiche all’interno delle sezioni tissutali. La colorazione con anticorpi coniugati a fluorofori (noti anche come fluorocromi) – composti che emettono luce a lunghezze d’onda specifiche quando eccitati da un laser – è nota come immunofluorescenza. La capacità di rilevare proteine all’interno di una sezione può fornire informazioni come l’eterogeneità del tipo di cellula all’interno del tessuto, l’attivazione di specifiche vie di segnalazione e l’espressione di biomarcatori. A seconda dei fluorofori utilizzati e del tipo di microscopio disponibile per l’analisi, è possibile utilizzare più colori, il che consente l’analisi multiplexata dei bersagli.

Il seguente protocollo delinea i passaggi di base coinvolti nella colorazione immunofluorescenza delle sezioni di tessuto incorporato di paraffina. È importante notare che questo protocollo non includerà alcun dettaglio sulla fissazione del tessuto, sul processo di incorporamento della paraffina o sul sezionamento dei tessuti. Una volta che i tessuti sono stati sezionati e posizionati su vetrini, vengono reidratati attraverso una serie di incubazioni di etanolo graduato (EtOH). Le sezioni vengono incubate con un reagente bloccante per ridurre il legame non specifico dell’anticorpo alla sezione tissutale. Le sezioni vengono quindi incubate con un anticorpo primario che può o non può essere etichettato direttamente con un fluoroforo. Se l’anticorpo primario non è etichettato direttamente, le sezioni vengono quindi incubate con un anticorpo secondario etichettato con un fluoroforo. Anticorpi diversi possono richiedere condizioni di colorazione diverse, quindi sono inclusi suggerimenti per l’ottimizzazione degli anticorpi. Dopo il lavaggio per rimuovere tutti gli anticorpi non legati, i vetrini sono montati con supporti contenenti DAPI per etichettare fluorescentemente il nucleo. Una volta che il supporto di montaggio si è asciugato, i vetrini possono essere ripresi utilizzando un microscopio con laser in grado di rilevare i diversi fluorofori.

Procedure

1. Configurazione

Il tipico protocollo di colorazione prevede i seguenti passaggi:
1. Reidratare le sezioni di tessuto sui vetrini utilizzando una serie di etanolo graduati.
2. Incubazione delle sezioni tissutali con un tampone bloccante, che aiuterà a bloccare il legame non specifico degli anticorpi al tessuto e ridurre la fluorescenza di fondo.
3. Rimozione del tampone bloccante e incubazione della sezione nell’anticorpo primario, momento in cui l’anticorpo legherà il suo bersaglio peptidico.
4. Rimozione dell’anticorpo primario e lavaggio estensivo delle sezioni nel tampone di lavaggio.
5. Incubazione delle sezioni con anticorpo secondario per consentire il legame con l’anticorpo primario, se l’anticorpo primario non è direttamente etichettato con un fluoroforo ed è richiesto un anticorpo secondario.
6. Lavare l’anticorpo secondario dai vetrini.
7. Montare i vetrini nel supporto di montaggio e consentirgli di asciugarsi prima della visualizzazione su un microscopio fluorescente.
Sono necessari i seguenti elementi: portascivolo (vetro o plastica), barattoli, pipette, pap pen, camera umida, coperchi e supporti di montaggio con DAPI.
Lo xilene viene utilizzato per la reidratazione dei vetrini. Lo xilene è pericoloso e deve essere utilizzato in una cappa aspirante insieme a DPI appropriati, compresi guanti e un camice da laboratorio.
Ricette per tamponi, soluzioni e reagenti
1. Etanolo graduato
  Etanolo – 160 mL 200 proof EtOH e 40mL ddH₂O
  Etanolo – 140 mL 200 proof EtOH e 60mL ddH₂O
2. Soluzione di recupero dell’antigene
  10 mM citrato di sodio, pH 6,0
3. Buffer di blocco
  100 μL di siero dall’animale ospite da cui è stato prodotto l’anticorpo secondario
  900 μL 1X PBS
  Nota: Questo è il volume per 10 sezioni; regolare il volume per circa 100 μL di buffer per sezione, se necessario.
4. Tampone di lavaggio (1X PBS)

2. Protocollo

Reidratazione con xileni ed etanolo
1. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive e quindi immergere le diapositive nella soluzione di isomeri 100% xilene, assicurandosi che le diapositive siano interamente coperte di soluzione.
2. Incubare i vetrini negli isomeri 100% Xilene per 3 min. Ripetere due volte per un totale di 3 incubazioni separate. Assicurarsi di pulire il portaslievi con un tovagliolo di carta prima di passare a una nuova soluzione per ridurre al minimo la contaminazione.
  Nota: Si raccomanda che queste incubazioni vengano eseguite in tre contenitori separati.
3. Incubare i vetrini in 100% EtOH per 2 min. Ripetere due volte per un totale di 3 incubazioni separate.
  Nota: Si raccomanda che queste incubazioni vengano eseguite in tre contenitori separati.
4. Incubare i vetrini in EtOH al 95% per 2 min.
5. Incubare i vetrini in 80% EtOH per 2 min.
6. Incubare i vetrini in 70% EtOH per 2 min.
7. Incubare i vetrini in 1X PBS per 5 min.
(Facoltativo) Recupero dell’antigene per smascherare gli epitopi riconosciuti dall’anticorpo primario
Nota 1: Questa procedura dipende fortemente dall’anticorpo utilizzato e si raccomanda di eseguire procedure di ottimizzazione iniziali per determinare il requisito per il recupero dell’antigene.
Nota 2: Questa procedura non è stata eseguita con la colorazione F4/80 mostrata di seguito. Il requisito per il recupero dell’antigene deve essere ottimizzato con ogni nuovo anticorpo.
1. Posizionare le diapositive in un supporto per vetrine in plastica o vetro resistente al calore e assicurarsi che il rack sia riempito con vetrini per garantire una distribuzione uniforme del calore. Le diapositive vuote possono essere utilizzate se ci sono meno campioni rispetto agli slot nel rack.
2. Posizionare il rack in 1000 mL di soluzione di smascheramento dell’antigene in un becher da 2 L – 10 mL di antigene smascherando lo stock a 990 ml di acqua.
3. Microonde in alto per 20 minuti totali, assicurarsi che i vetrini rimangano coperti d’acqua.
4. Raffreddare le diapositive per 20 minuti in becher.
5. Lavare il portaslievi in portasciovi contenenti ddH₂O per 5 minuti ciascuno. Ripetere due volte per un totale di 3 incubazioni separate utilizzando ddH_{fresco 2}O ogni volta. Le diapositive possono essere lavate nello stesso portasciole durante ogni lavaggio.
6. Incubare i vetrini in 1X PBS per 5 min.
Sezioni circolari con una penna pap. Ciò consentirà l’uso di un volume minimo di tamponi necessari per coprire le sezioni di tessuto. Non lasciare asciugare le sezioni di tessuto.
Aggiungere il buffer di blocco a ogni sezione. La quantità di buffer necessaria per coprire la sezione varia a seconda delle dimensioni della sezione, ma può variare da 25 a 500 μL. È necessario utilizzare un buffer sufficiente per formare un perla che copra l’intera superficie della sezione, compresi i bordi.
Nota: La scelta del tampone bloccante può variare a seconda dell’anticorpo utilizzato. Ad esempio, il siero al 10% dell’animale ospite in cui è stato allevato l’anticorpo secondario può essere utilizzato per ridurre il legame non specifico dell’anticorpo secondario (ad esempio, il siero di capra normale può essere utilizzato se l’anticorpo secondario è stato allevato in capra). L’ottimizzazione del tampone di blocco deve essere eseguita per ciascun anticorpo primario. Per macchiare le sezioni tumorali mammarie con F4/80, sono stati utilizzati 0,1 ml di siero di capra normale al 10% in PBS.
Incubare le sezioni in tampone di blocco in una camera umidificata per 1 ora a temperatura ambiente o 4°C fino a 24 ore. La camera umidificata assicura che le sezioni non si asciughino.
Rimuovere il tampone di blocco scaricandolo dalla diapositiva. In alternativa, il buffer di blocco può essere rimosso utilizzando una pipetta, anche se fare attenzione a non toccare la sezione con la punta della pipetta.
Diluire l’anticorpo primario nel tampone bloccante.
Nota: La diluizione corretta dovrà essere determinata per ciascun tipo di anticorpo e campione. L’ottimizzazione includerebbe l’esecuzione di una serie di diluizioni per identificare la colorazione ottimale. Per macchiare le sezioni tumorali mammarie con F4/80, le sezioni di tessuto sono state incubate durante la notte a 4 ° C in 0,1 mL di anticorpi anti-F4/80 di ratto diluiti 1:100 in siero di capra normale all’1% in PBS.
Aggiungere l’anticorpo primario a ciascuna sezione e incubare in una camera umidificata per un massimo di 16 ore (durante la notte) a 4°C. Lasciare almeno una sezione nel tampone di blocco senza anticorpo primario per fungere da controllo, che aiuterà a identificare il legame non specifico da parte dell’anticorpo secondario.
Scaricare l’anticorpo primario o il tampone di blocco dalla sezione e lavare le sezioni con PBS posizionando le diapositive nel rack di scorrimento e posizionandole in un supporto per vetrini con 1x PBS. Lavare 3 volte per 10 minuti ogni volta.
Diluire l’anticorpo secondario 1:200 nel tampone bloccante. La diluizione può essere ottimizzata a seconda dell’anticorpo secondario.
Aggiungere l’anticorpo secondario a tutte le sezioni, compreso il controllo, e incubare per 1 ora in una camera umidificata protetta dalla luce.
Drenare l’anticorpo secondario dalle sezioni e lavare 3 volte in PBS per 10 minuti ogni volta.
Aggiungere 2-3 gocce di supporti di montaggio contenenti DAPI alle diapositive e posizionare un coperchio sui campioni. Se il supporto di montaggio non è un tipo di supporto ad asciugatura rapida, potrebbe essere necessario sigillare i bordi del vetrino con cera di paraffina fusa o smalto per unghie per evitare perdite e mantenere i campioni a lungo termine.
Lasciare asciugare i vetrini durante la notte al buio e immaginare le sezioni usando un microscopio fluorescente.

3. Analisi dei dati e risultati

Le sezioni macchiate vengono analizzate utilizzando un microscopio fluorescente. I dettagli specifici dell’acquisizione e dell’analisi delle immagini dipenderanno dalle specifiche del microscopio e dal software utilizzato per eseguire l’analisi. In genere, le immagini possono essere scattate come immagini a colore singolo e sovrapposte per generare immagini multicolore. La percentuale di cellule positive può essere quantificata contando il numero di cellule macchiate positivamente e dividendo per il numero totale di cellule colorate con DAPI all’interno di una sezione. Per la colorazione F4/80 delle sezioni tumorali mammarie, utilizzando il software Leica Application Suite, versione 3.8, nella scheda Acquisisci e in modalità di acquisizione Image Overlay, DAPI e RFP sono stati entrambi abilitati. Esposizione, guadagno e gamma sono stati regolati (20,0 ms, 1,0x e 1,53 rispettivamente per DAPI e 944,2 ms, 1,0x e 1,08 rispettivamente per RFP), anche se questo varia tra gli esperimenti. Il pulsante Acquisisci sovrapposizione è stato utilizzato per creare immagini sovrapposte delle esposizioni DAPI e RFP.
L’immagine qui sotto (Figura 1) mostra un’immagine di immunofluorescenza di esempio di una sezione tumorale macchiata con F4/80, che rileva un antigene su macrofagi e altre cellule mieloidi. La sezione è stata montata utilizzando supporti di montaggio contenenti DAPI e i nuclei sono mostrati in blu.

La funzione di una proteina in una cellula dipende in gran parte dalla sua corretta localizzazione all’interno della cellula. La microscopia a immunofluorescenza è un metodo con cui una proteina può essere visualizzata all’interno delle cellule utilizzando coloranti fluorescenti. Un colorante fluorescente è un fluoroforo, cioè una molecola che assorbe l’energia luminosa a una specifica lunghezza d’onda mediante un processo chiamato eccitazione, e quindi rilascia immediatamente l’energia a una lunghezza d’onda diversa, nota come emissione.

I coloranti fluorescenti sono coniugati a un anticorpo target-specifico e introdotti nelle cellule o nei tessuti in coltura mediante immuno colorazione. Quando questo anticorpo primario si lega alla proteina di interesse, la proteina viene etichettata con il colorante fluorescente. In alternativa, il colorante fluorescente può essere coniugato a un anticorpo secondario, invece dell’anticorpo primario, e l’anticorpo secondario si lega al complesso anticorpale primario della proteina per etichettare il bersaglio. Successivamente, il campione viene sigillato in un mezzo di montaggio antifase per preservare l’etichettatura a fluorescenza ed è quindi pronto per l’imaging su un microscopio a fluorescenza.

Un microscopio a fluorescenza è dotato di una potente fonte di luce. Il fascio di luce passa prima attraverso un filtro di eccitazione, che consente solo alla luce alla lunghezza d’onda di eccitazione di passare. La luce di eccitazione raggiunge quindi uno specchio specializzato, chiamato specchio dicroico o beam splitter, che è progettato per riflettere selettivamente la lunghezza d’onda di eccitazione verso una lente obiettivo. L’obiettivo focalizza quindi la luce su una piccola regione nel campione. Una volta raggiunto il campione, la luce eccita i fluorofori, che quindi emettono l’energia luminosa a una lunghezza d’onda diversa. Questa luce viene trasmessa attraverso la lente dell’obiettivo allo specchio dicroico. Poiché la lunghezza d’onda di emissione è diversa dalla lunghezza d’onda di eccitazione, lo specchio dicroico consente il passaggio della luce di emissione. Quindi, passa attraverso un secondo filtro, chiamato filtro di emissione, che elimina la luce da qualsiasi altra lunghezza d’onda che possa essere presente. Successivamente, i raggi di luce ora raggiungono l’oculare o la fotocamera, dove presentano un’immagine ingrandita creata dalla luce emessa dai fluorofori specifici. Questa immagine rappresenta la posizione della proteina di interesse all’interno della cellula.

I coloranti fluorescenti che legano il DNA sono spesso usati insieme all’immuno colorazione per etichettare i nuclei come punto di riferimento all’interno delle cellule. Più fluorofori diversi, con diverse lunghezze d’onda di emissione di eccitazione, possono essere utilizzati per diverse proteine all’interno dello stesso campione per confrontare la localizzazione delle proteine.

Questo video mostra la procedura per la colorazione immunofluorescente di una proteina di interesse in un campione di tessuto seguita dall’imaging del campione su un microscopio a fluorescenza.

Prima di iniziare il processo di colorazione, le sezioni, che sono state disidratate durante il processo di incorporamento, devono essere reidratate. Per fare ciò, in primo luogo, posizionare le diapositive in un porta diapositive e quindi immergere completamente le diapositive in isomeri 100% Xlene. Lasciare incubare le diapositive per tre minuti. Quindi, rimuovere i vetrini dal contenitore, pulire l’eccesso di xilene con un tovagliolo di carta e metterli in un nuovo bagno di xilene in un contenitore fresco, per altri tre minuti. Ripetere questa incubazione ogni volta in un nuovo contenitore con Xilene fresco e pulire i vetrini con carta assorbente prima di trasferirli nel nuovo contenitore, per un totale di tre incubazioni. Quindi, incubare le sezioni in una serie di soluzioni di etanolo graduato, iniziando con etanolo al 100% per due minuti. Pulire il portaslievi con un tovagliolo di carta e trasferire i vetrini in un nuovo contenitore di etanolo al 100% per altri due minuti. Continuare il ciclo di lavaggio, pulendo l’etanolo in eccesso con un tovagliolo di carta e trasferendo i vetrini in un nuovo bagno, seguendo le concentrazioni indicate di etanolo per il tempo specificato. Dopo l’ultimo lavaggio con etanolo, scuotere la soluzione in eccesso e incubare i vetrini in 1X PBS per cinque minuti.

Per iniziare il processo di colorazione, in primo luogo, cerchiare le sezioni con una penna PAP per identificare l’area minima che i buffer devono coprire. Una volta che le sezioni sono chiaramente contrassegnate sulla diapositiva, aggiungere 100 microlitri di buffer di blocco a ciascuna diapositiva, assicurandosi di coprire l’intera superficie della sezione. Dopo che i tessuti sono stati coperti da un tampone bloccante, posizionare i vetrini in una camera umidificata. Lasciare incubare le diapositive per un’ora a temperatura ambiente.

Dopo il tempo di incubazione desiderato, rimuovere il tampone di blocco drenandolo dal vetrino. Quindi, diluire l’anticorpo primario nel tampone di blocco. Per una diluizione 1:100, aggiungere 990 microlitri di tampone di blocco a un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, seguito da 10 microlitri dell’anticorpo primario allo stesso tubo. Etichettare una diapositiva come controllo e quindi aggiungere 100 microlitri di buffer di blocco. Questo controllo aiuterà a identificare qualsiasi legame non specifico dell’anticorpo secondario. Ora, aggiungi 100 microlitri di tampone anticorpale primario alle diapositive rimanenti. Incubare le sezioni durante la notte in una camera umidificata a quattro gradi Celsius, al buio.

Dopo l’incubazione notturna, rimuovere le sezioni dalla camera e drenare l’anticorpo primario da ogni vetrino e il tampone di blocco dal controllo. Posizionare le diapositive in una griglia e quindi lavarle tre volte in 1X PBS per dieci minuti ciascuna. Mentre i vetrini vengono lavati in 1X PBS, diluire l’anticorpo secondario nel tampone di blocco. Per una diluizione di 1:200, aggiungere 995 microlitri di tampone di blocco a un tubo da 1,5 millilitri, seguito da cinque microlitri dell’anticorpo secondario allo stesso tubo. Aggiungere l’anticorpo secondario a tutte le sezioni, incluso il controllo, e incubarle per un’ora in una camera umidificata protetta dalla luce. Quando il timer suona, rimuovi le diapositive dall’incubatore. Drenare l’anticorpo secondario dalle sezioni. Una volta rimosso l’anticorpo secondario, posizionare i vetrini in un portascivole e quindi immergere completamente i vetrini in 1X PBS per 10 minuti, al riparo dalla luce. Ripetere questo lavaggio tre volte, utilizzando 1X PBS fresco per ogni lavaggio. Dopo i lavaggi, aggiungere due o tre gocce di supporto di montaggio contenente DAPI a ciascun vetrino e posizionare una copertura di vetro sui campioni. Lasciare asciugare le diapositive durante la notte in un luogo buio prima di immaginare le sezioni utilizzando un cannocchiale fluorescente.

Durante l’imaging, i dettagli dell’acquisizione dell’immagine dipenderanno dal microscopio specifico e dal software disponibili. Tuttavia, in questo particolare esempio, il software Leica Application Suite, versione 3. 8, viene utilizzato per eseguire l’analisi. Utilizzando questo programma, fare clic sulla scheda Acquisisci e in modalità Acquisizione sovrapposizione immagine, abilitare sia DAPI che RFP. Successivamente, regolare l’esposizione, il guadagno e la gamma sia per DAPI che per RFP, prendendo un’iniziale utilizzando le impostazioni predefinite definite dal software e quindi ottimizzando la luminosità modificando il tempo di esposizione e il guadagno, tenendo presente che sono desiderabili impostazioni ottimali minime per evitare la saturazione dell’immagine e il fotoscilazione dei campioni. La gamma può essere modificata per ottimizzare le aree più scure di un’immagine.

Una volta regolate le impostazioni, premere il pulsante Acquisisci sovrapposizione per creare immagini sovrapposte delle esposizioni DAPI e RFP. Questa immagine di esempio, catturata utilizzando la tecnica dimostrata, mostra una sezione di tumore mammario di topo, macchiata con l’anticorpo F4/80, che rileva un antigene, raffigurato in rosso, su macrofagi e altre cellule mieloidi. Poiché è stato utilizzato un supporto di montaggio contenente DAPI, i nuclei sono mostrati in blu. I dati dell’imaging forniranno informazioni riguardanti l’intensità e la localizzazione della proteina all’interno della sezione tissutale.

Ad esempio, nell’immagine del tumore colorato con F4/80, si osserva la colorazione della superficie cellulare di questo antigene. Questi dati possono anche fornire informazioni sulla frequenza di specifiche popolazioni cellulari all’interno della sezione tissutale. Questo può essere quantificato contando il numero di cellule macchiate positivamente, qui mostrate in rosso, e confrontandolo con la popolazione cellulare totale, mostrata in blu, e calcolando la frequenza usando la seguente equazione.

Results

Figura 1: Colorazione F4/80 di una sezione di tumore mammario. Dopo la fissazione, un tumore mammario di topo è stato sezionato e macchiato con anti-F4/80 e montato utilizzando un supporto di montaggio contenente DAPI. La colorazione è mostrata dalla colorazione della superficie cellulare F4/80 in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I dati ottenuti dall’imaging forniranno informazioni riguardanti l’intensità e la localizzazione dell’espressione della proteina di interesse all’interno della sezione tissutale. A seconda della proteina esaminata, questi dati potrebbero anche fornire informazioni sulla frequenza di specifiche popolazioni cellulari all’interno della sezione tissutale. Questo può essere quantificato contando il numero di cellule macchiate positivamente e confrontando con la popolazione cellulare totale.

Applications and Summary

L’immunofluorescenza consente lo studio dell’espressione e della localizzazione proteica nel contesto di una sezione tissutale. Questa tecnica può essere utilizzata per capire come i tessuti cambiano nel contesto della malattia esaminando la localizzazione delle proteine o il numero di cellule nei tessuti normali e malati. Le modifiche nella localizzazione o nei modelli di espressione possono essere determinate e collegate ad attributi specifici degli esempi.

References

Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

Transcript

The function of a protein in a cell is largely dependent on its proper localization within the cell. Immunofluorescence microscopy is a method by which a protein can be visualized inside cells using fluorescent dyes. A fluorescent dye is a fluorophore, that is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength by a process called excitation, and then immediately releases the energy at a different wavelength, known as emission.

Fluorescent dyes are conjugated to a target-specific antibody and introduced into cultured cells or tissue by immunostaining. When this primary antibody binds to the protein of interest, the protein gets labeled with the fluorescent dye. Alternatively, the fluorescent dye can be conjugated to a secondary antibody, instead of the primary antibody, and the secondary antibody binds to the protein primary antibody complex to label the target. After that, the sample is sealed in an antifade mounting medium to preserve the fluorescence labeling and is then ready for imaging on a fluorescence microscope.

A fluorescence microscope is equipped with a powerful light source. The light beam first passes through an excitation filter, which allows only the light at the excitation wavelength to pass through. The excitation light then reaches a specialized mirror, called a dichroic mirror or a beam splitter, which is designed to selectively reflect the excitation wavelength towards an objective lens. The lens then focuses the light onto a small region in the sample. Upon reaching the sample, the light excites the fluorophores, which then emit the light energy at a different wavelength. This light is transmitted back through the objective lens to the dichroic mirror. Since the emission wavelength is different from the excitation wavelength, the dichroic mirror allows the emission light to pass through. Then, it goes through a second filter, called the emission filter, which eliminates light from any other wavelengths that may be present. After that, the light rays now reach the eyepiece or camera, where they present a magnified image created from the emitted light from the specific fluorophores. This image represents the location of the protein of interest within the cell.

DNA binding fluorescent dyes are often used along with immunostaining to label nuclei as a point of reference within the cells. Multiple different fluorophores, with different excitation emission wavelengths, can be used for different proteins within the same sample to compare localization of the proteins.

This video demonstrates the procedure for immunofluorescent staining of a protein of interest in a tissue sample followed by imaging the sample on a fluorescence microscope.

Before beginning the staining process, the sections, which were dehydrated during the embedding process, need to be rehydrated. To do this, first, place the slides into a slide holder and then completely submerge the slides in 100% Xlene isomers. Allow the slides to incubate for three minutes. Then, remove the slides from the container, wipe off any excess Xylene with a paper towel, and place them into a new Xylene bath in a fresh container, for a further three minutes. Repeat this incubation each time in a new container with fresh Xylene and wiping down the slides with paper towels before transferring to the new container, for a total of three incubations. Next, incubate the sections in a series of graded ethanol solutions, starting with 100% ethanol for two minutes. Wipe off the slide rack with a paper towel, and transfer the slides to a new container of 100% ethanol for another two minutes. Continue the cycle of washing, wiping excess ethanol with a paper towel, and transferring the slides to a new bath, following the indicated concentrations of ethanol for the specified time. After the final ethanol wash, shake off the excess solution and incubate the slides in 1X PBS for five minutes.

To begin the staining process, first, circle the sections with a PAP pen to identify the minimal area that the buffers need to cover. Once the sections are clearly marked on the slide, add 100 microliters of blocking buffer to each slide, making sure to cover the entire section surface. After the tissues are covered in blocking buffer, place the slides in a humidified chamber. Leave the slides to incubate for one hour at room temperature.

Following the desired incubation time, remove the blocking buffer by draining it off the slide. Next, dilute the primary antibody in blocking buffer. For a 1:100 dilution, add 990 microliters of blocking buffer to a 1.5 milliliter centrifuge tube, followed by 10 microliters of the primary antibody to the same tube. Label one slide as a control and then add 100 microliters of blocking buffer. This control will help identify any non-specific binding of the secondary antibody. Now, add 100 microliters of primary antibody buffer to the remaining slides. Incubate the sections overnight in a humidified chamber at four degrees celsius, in the dark.

Following the overnight incubation, remove the sections from the chamber and drain the primary antibody off each slide and the blocking buffer from the control. Place the slides into a slide rack and then wash them three times in 1X PBS for ten minutes each. While the slides are washing in 1X PBS, dilute the secondary antibody in blocking buffer. For a 1:200 dilution, add 995 microliters of blocking buffer to a 1.5 milliliter tube, followed by five microliters of the secondary antibody to the same tube. Add the secondary antibody to all of the sections, including the control, and incubate them for one hour in a humidified chamber protected from light. When the timer sounds, remove the slides from the incubator. Drain the secondary antibody off the sections. Once the secondary antibody is removed, place the slides in a slide rack and then completely submerge the slides in 1X PBS for 10 minutes, protected from light. Repeat this wash three times, using fresh 1X PBS for each wash. Following the washes, add two to three drops of mounting media containing DAPI to each slide and place a glass coverslip on the samples. Allow the slides to dry overnight in a dark place before imaging the sections using a fluorescent scope.

During imaging, the details of image capture will depend upon the specific microscope and software available. However, in this particular example, the software Leica Application Suite, Version 3. 8, is used to perform the analysis. Using this program, click on the Acquire tab and in Image Overlay Acquisition mode, enable both DAPI and RFP. Next, adjust the Exposure, Gain, and Gamma for both DAPI and RFP, by taking an initial using the default settings defined by the software, and then optimizing for brightness by modifying the exposure time and the gain, keeping in mind that minimal optimal settings are desirable to avoid image saturation and photobleaching of the samples. Gamma can be modified to optimize darker areas of an image.

Once the settings are adjusted, press the Acquire Overlay button to create overlay images of the DAPI and RFP exposures. This example image, captured using the demonstrated technique, shows a mouse mammary tumor section, stained with the antibody F4/80, which detects an antigen, depicted in red, on macrophages and other myeloid cells. Since DAPI-containing mounting media was used, nuclei are shown in blue. The data from the imaging will provide information regarding the intensity and localization of the protein within the tissue section.

For example, in the image of the tumor stained with F4/80, cell surface staining of this antigen is observed. These data can also provide information regarding the frequency of specific cell populations within the tissue section. This can be quantified by counting the number of positively stained cells, here shown in red, and comparing that with the total cell population, shown in blue, and calculating the frequency using the following equation.

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