What is a fluorophore and how does it work in immunofluorescence microscopy?

A fluorophore is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength through excitation, then immediately releases the energy at a different wavelength through emission. Fluorophores are conjugated to antibodies and introduced into tissue samples through immunostaining. When the antibody binds to the target protein, the fluorophore labels it, allowing visualization under a fluorescence microscope.

How does a fluorescence microscope separate excitation and emission light?

A fluorescence microscope uses specialized optical components to separate wavelengths. Excitation light passes through an excitation filter, then reflects off a dichroic mirror toward the objective lens, which focuses it on the sample. Emitted light from excited fluorophores returns through the objective and dichroic mirror, which allows only emission wavelengths to pass. An emission filter removes unwanted wavelengths before the image reaches the eyepiece or camera.

Why is rehydration necessary before immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue?

Tissue sections are dehydrated during the paraffin embedding process. Before staining, sections must be rehydrated through graded ethanol incubations and PBS washes to restore tissue hydration and prepare it for antibody binding. This step ensures proper antibody penetration and reduces non-specific binding during the immunostaining procedure.

What is the purpose of a blocking buffer in immunofluorescence staining?

Blocking buffer reduces non-specific binding of antibodies to the tissue section. The tissue is incubated with blocking buffer for one hour at room temperature before primary antibody application. This step prevents the antibody from binding to sites other than the target protein, improving staining specificity and reducing background fluorescence in the final image.

Why is a control slide included in immunofluorescence staining procedures?

A control slide is treated identically to experimental slides but receives only blocking buffer instead of primary antibody. This control helps identify any non-specific binding of the secondary antibody to the tissue. By comparing the control to experimental slides, researchers can distinguish true target protein localization from background fluorescence caused by non-specific antibody interactions.

How can multiple proteins be visualized simultaneously in a single tissue sample?

Multiple different fluorophores with distinct excitation and emission wavelengths can be used to label different proteins within the same sample. DNA binding fluorescent dyes like DAPI label nuclei as a reference point. By using multiple fluorophores, researchers can compare the localization of different proteins and analyze their spatial relationships within the tissue section.

What information can immunofluorescence imaging provide about tissue samples?

Immunofluorescence imaging provides data on protein intensity and localization within tissue sections, revealing cell type heterogeneity, activation of signaling pathways, and biomarker expression. Researchers can quantify the frequency of specific cell populations by counting positively stained cells and comparing them to the total cell population, calculated using a simple ratio equation.

Microscopia a immunofluorescenza: colorazione a immunofluorescenza di sezioni di tessuto incorporato in paraffina

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1. Configurazione

Il tipico protocollo di colorazione prevede i seguenti passaggi:
1. Reidratare le sezioni di tessuto sui vetrini utilizzando una serie di etanolo graduati.
2. Incubazione delle sezioni tissutali con un tampone bloccante, che aiuterà a bloccare il legame non specifico degli anticorpi al tessuto e ridurre la fluorescenza di fondo.
3. Rimozione del tampone bloccante e incubazione della sezione nell'anticorpo primario, momento in cui l'anticorpo legherà il suo bersaglio peptidico.
4. Rimozione dell'anticorpo primario e lavaggio estensivo delle sezioni nel tampone di lavaggio.
5. Incubazione delle sezioni con anticorpo secondario per consentire il legame con l'anticorpo primario, se l'anticorpo primario non è direttamente etichettato con un fluoroforo ed è richiesto un anticorpo secondario.
6. Lavare l'anticorpo secondario dai vetrini.
7. Montare i vetrini nel supporto di montaggio e consentirgli di asciugarsi prima della visualizzazione su un microscopio fluorescente.
Sono necessari i seguenti elementi: portascivolo (vetro o plastica), barattoli, pipette, pap pen, camera umida, coperchi e supporti di montaggio con DAPI.
Lo xilene viene utilizzato per la reidratazione dei vetrini. Lo xilene è pericoloso e deve essere utilizzato in una cappa aspirante insieme a DPI appropriati, compresi guanti e un camice da laboratorio.
Ricette per tamponi, soluzioni e reagenti
1. Etanolo graduato
  Etanolo - 160 mL 200 proof EtOH e 40mL ddH₂O
  Etanolo - 140 mL 200 proof EtOH e 60mL ddH₂O
2. Soluzione di recupero dell'antigene
  10 mM citrato di sodio, pH 6,0
3. Buffer di blocco
  100 μL di siero dall'animale ospite da cui è stato prodotto l'anticorpo secondario
  900 μL 1X PBS
  Nota: Questo è il volume per 10 sezioni; regolare il volume per circa 100 μL di buffer per sezione, se necessario.
4. Tampone di lavaggio (1X PBS)

2. Protocollo

Reidratazione con xileni ed etanolo
1. Posizionare le diapositive in un supporto per diapositive e quindi immergere le diapositive nella soluzione di isomeri 100% xilene, assicurandosi che le diapositive siano interamente coperte di soluzione.
2. Incubare i vetrini negli isomeri 100% Xilene per 3 min. Ripetere due volte per un totale di 3 incubazioni separate. Assicurarsi di pulire il portaslievi con un tovagliolo di carta prima di passare a una nuova soluzione per ridurre al minimo la contaminazione.
  Nota: Si raccomanda che queste incubazioni vengano eseguite in tre contenitori separati.
3. Incubare i vetrini in 100% EtOH per 2 min. Ripetere due volte per un totale di 3 incubazioni separate.
  Nota: Si raccomanda che queste incubazioni vengano eseguite in tre contenitori separati.
4. Incubare i vetrini in EtOH al 95% per 2 min.
5. Incubare i vetrini in 80% EtOH per 2 min.
6. Incubare i vetrini in 70% EtOH per 2 min.
7. Incubare i vetrini in 1X PBS per 5 min.
(Facoltativo) Recupero dell'antigene per smascherare gli epitopi riconosciuti dall'anticorpo primario
Nota 1: Questa procedura dipende fortemente dall'anticorpo utilizzato e si raccomanda di eseguire procedure di ottimizzazione iniziali per determinare il requisito per il recupero dell'antigene.
Nota 2: Questa procedura non è stata eseguita con la colorazione F4/80 mostrata di seguito. Il requisito per il recupero dell'antigene deve essere ottimizzato con ogni nuovo anticorpo.
1. Posizionare le diapositive in un supporto per vetrine in plastica o vetro resistente al calore e assicurarsi che il rack sia riempito con vetrini per garantire una distribuzione uniforme del calore. Le diapositive vuote possono essere utilizzate se ci sono meno campioni rispetto agli slot nel rack.
2. Posizionare il rack in 1000 mL di soluzione di smascheramento dell'antigene in un becher da 2 L - 10 mL di antigene smascherando lo stock a 990 ml di acqua.
3. Microonde in alto per 20 minuti totali, assicurarsi che i vetrini rimangano coperti d'acqua.
4. Raffreddare le diapositive per 20 minuti in becher.
5. Lavare il portaslievi in portasciovi contenenti ddH₂O per 5 minuti ciascuno. Ripetere due volte per un totale di 3 incubazioni separate utilizzando ddH_{fresco 2}O ogni volta. Le diapositive possono essere lavate nello stesso portasciole durante ogni lavaggio.
6. Incubare i vetrini in 1X PBS per 5 min.
Sezioni circolari con una penna pap. Ciò consentirà l'uso di un volume minimo di tamponi necessari per coprire le sezioni di tessuto. Non lasciare asciugare le sezioni di tessuto.
Aggiungere il buffer di blocco a ogni sezione. La quantità di buffer necessaria per coprire la sezione varia a seconda delle dimensioni della sezione, ma può variare da 25 a 500 μL. È necessario utilizzare un buffer sufficiente per formare un perla che copra l'intera superficie della sezione, compresi i bordi.
Nota: La scelta del tampone bloccante può variare a seconda dell'anticorpo utilizzato. Ad esempio, il siero al 10% dell'animale ospite in cui è stato allevato l'anticorpo secondario può essere utilizzato per ridurre il legame non specifico dell'anticorpo secondario (ad esempio, il siero di capra normale può essere utilizzato se l'anticorpo secondario è stato allevato in capra). L'ottimizzazione del tampone di blocco deve essere eseguita per ciascun anticorpo primario. Per macchiare le sezioni tumorali mammarie con F4/80, sono stati utilizzati 0,1 ml di siero di capra normale al 10% in PBS.
Incubare le sezioni in tampone di blocco in una camera umidificata per 1 ora a temperatura ambiente o 4°C fino a 24 ore. La camera umidificata assicura che le sezioni non si asciughino.
Rimuovere il tampone di blocco scaricandolo dalla diapositiva. In alternativa, il buffer di blocco può essere rimosso utilizzando una pipetta, anche se fare attenzione a non toccare la sezione con la punta della pipetta.
Diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante.
Nota: La diluizione corretta dovrà essere determinata per ciascun tipo di anticorpo e campione. L'ottimizzazione includerebbe l'esecuzione di una serie di diluizioni per identificare la colorazione ottimale. Per macchiare le sezioni tumorali mammarie con F4/80, le sezioni di tessuto sono state incubate durante la notte a 4 ° C in 0,1 mL di anticorpi anti-F4/80 di ratto diluiti 1:100 in siero di capra normale all'1% in PBS.
Aggiungere l'anticorpo primario a ciascuna sezione e incubare in una camera umidificata per un massimo di 16 ore (durante la notte) a 4°C. Lasciare almeno una sezione nel tampone di blocco senza anticorpo primario per fungere da controllo, che aiuterà a identificare il legame non specifico da parte dell'anticorpo secondario.
Scaricare l'anticorpo primario o il tampone di blocco dalla sezione e lavare le sezioni con PBS posizionando le diapositive nel rack di scorrimento e posizionandole in un supporto per vetrini con 1x PBS. Lavare 3 volte per 10 minuti ogni volta.
Diluire l'anticorpo secondario 1:200 nel tampone bloccante. La diluizione può essere ottimizzata a seconda dell'anticorpo secondario.
Aggiungere l'anticorpo secondario a tutte le sezioni, compreso il controllo, e incubare per 1 ora in una camera umidificata protetta dalla luce.
Drenare l'anticorpo secondario dalle sezioni e lavare 3 volte in PBS per 10 minuti ogni volta.
Aggiungere 2-3 gocce di supporti di montaggio contenenti DAPI alle diapositive e posizionare un coperchio sui campioni. Se il supporto di montaggio non è un tipo di supporto ad asciugatura rapida, potrebbe essere necessario sigillare i bordi del vetrino con cera di paraffina fusa o smalto per unghie per evitare perdite e mantenere i campioni a lungo termine.
Lasciare asciugare i vetrini durante la notte al buio e immaginare le sezioni usando un microscopio fluorescente.

3. Analisi dei dati e risultati

Le sezioni macchiate vengono analizzate utilizzando un microscopio fluorescente. I dettagli specifici dell'acquisizione e dell'analisi delle immagini dipenderanno dalle specifiche del microscopio e dal software utilizzato per eseguire l'analisi. In genere, le immagini possono essere scattate come immagini a colore singolo e sovrapposte per generare immagini multicolore. La percentuale di cellule positive può essere quantificata contando il numero di cellule macchiate positivamente e dividendo per il numero totale di cellule colorate con DAPI all'interno di una sezione. Per la colorazione F4/80 delle sezioni tumorali mammarie, utilizzando il software Leica Application Suite, versione 3.8, nella scheda Acquisisci e in modalità di acquisizione Image Overlay, DAPI e RFP sono stati entrambi abilitati. Esposizione, guadagno e gamma sono stati regolati (20,0 ms, 1,0x e 1,53 rispettivamente per DAPI e 944,2 ms, 1,0x e 1,08 rispettivamente per RFP), anche se questo varia tra gli esperimenti. Il pulsante Acquisisci sovrapposizione è stato utilizzato per creare immagini sovrapposte delle esposizioni DAPI e RFP.
L'immagine qui sotto (Figura 1) mostra un'immagine di immunofluorescenza di esempio di una sezione tumorale macchiata con F4/80, che rileva un antigene su macrofagi e altre cellule mieloidi. La sezione è stata montata utilizzando supporti di montaggio contenenti DAPI e i nuclei sono mostrati in blu.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4e Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Dipartimento di Medicina e Patologia di Laboratorio, Università del Min…