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Advanced Biology

Analisi del ciclo cellulare: valutazione della proliferazione delle cellule T CD8 e CD4 in seguito a stimolazione tramite colorazione CFSE e citometria a flusso

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

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Immunology

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Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

5.9: Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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10:57 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unità di Linfopoiesi, Dipartimento di Immunologia, Istituto Pasteur, Parigi, Francia
² INSERM U1223, Parigi, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Parigi, Francia
⁴ Platfrom, Citometria a flusso e biomarcatori UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Parigi, Francia

Il ciclo cellulare è un processo universale di vita. Durante il ciclo cellulare, una cellula subisce diverse modifiche per dividersi in due cellule figlie. Questo meccanismo si verifica per tutta la vita di un organismo in risposta ai suoi bisogni. Le divisioni cellulari e lo sviluppo embrionale producono un organismo completo da uno zigote unicellulare. Durante l’età adulta, il ciclo cellulare è centrale in molti processi biologici critici, come le riparazioni dei tessuti.

I meccanismi di divisione cellulare sono eventi strettamente controllati in cui la cellula subisce modifiche graduali prima della divisione finale. Le cellule che non sono ancora nel ciclo sono descritte come nella fase Gap 0 (G₀). Durante questa fase la cellula è considerata quiescente. Quando la cellula inizia a pedalare, vengono riconosciute quattro fasi distinte: Gap 1 (G_1),Sintesi (S), Gap 2 (G₂) e Mitosi (M). La fase G₁ è un punto di controllo per le risorse necessarie alla cellula per la sintesi del DNA. Quindi, si verifica la fase S e inizia la replicazione del DNA, seguita dall’interfase G_2, un altro checkpoint che controlla tutti gli elementi necessari per la divisione della cellula. Infine, la cellula entra nella mitosi e si divide in due cellule figlie.

La divisione cellulare è un parametro altamente informativo in molti sistemi biologici diversi. Nel campo dell’immunologia, l’analisi della proliferazione leucocitaria può indicare il meccanismo della risposta immunitaria. Altri domini di indagine si basano anche sull’analisi del ciclo cellulare. Ad esempio, l’analisi del ciclo cellulare durante lo sviluppo del tumore ha migliorato la nostra comprensione del cancro.

Molti coloranti fluorescenti sono ora disponibili per il monitoraggio della proliferazione cellulare. Questi coloranti differiscono nelle loro proprietà chimiche e spettrali. Esistono due diverse classi di coloranti: i coloranti proteici si combinano permanentemente con le proteine formando un legame covalente e i coloranti di membrana si intercalano stabilmente all’interno delle membrane cellulari attraverso forti associazioni idrofobiche. Studi in vitro e in vivo sulla proliferazione delle cellule immunitarie mediante citometria a flusso sono tra le applicazioni più comuni di entrambe le classi di coloranti a tracciamento cellulare (1, 2).

CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) è un colorante fluorescente che segna le cellule in divisione. Inizialmente, tutte le cellule ricevono la stessa quantità di colorante; le cellule che si dividono uniformemente dividono il colorante che hanno ricevuto tra le loro due cellule figlie. Di conseguenza, il ciclo cellulare può essere seguito dalla progressiva diminuzione dell’intensità del colorante nelle cellule. La colorazione CFSE è seguita dalla citometria a flusso multiparametrica convenzionale, una tecnologia ad alto rendimento basata sulla fluorescenza che consente la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule in base al loro grado di colorazione CFSE (3).

Nel seguente esperimento, valutiamo la proliferazione delle cellule T CD4⁺ e CD8⁺ in vitro, dopo stimolazione CD3, utilizzando la colorazione CFSE e la citometria a flusso.

Procedure

1. Preparazione

Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati.
Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugarli accuratamente.
Preparare 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale per vitelli (FCS).

2. Dissezione

Utilizzando un sistema di rilascio di anidride carbonica, eutanasizzare il topo per ipossia. Fissare il topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina ed eseguire una laparotomia longitudinale usando forbici e pinza.
Usando la pinza, spostare l’intestino e lo stomaco sul lato destro dell’addome per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco.
Usando la pinza staccare accuratamente la milza dallo stomaco e metterla nella capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

Posizionare la milza su un colino cellulare da 40 μm sulla stessa capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla.
Trasferire la milza dissociata e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
Ricaspendare il pellet in 2 ml di acetato di potassio per lisire gli eritrociti. Attendere 2 minuti e quindi portare il volume fino a 15 ml utilizzando HBSS 2% FCS.
Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare il surnatante e ricaspenare il pellet in 5 ml di HBSS 2% FCS.
Contare le cellule utilizzando un test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a 10⁷ cellule / mL utilizzando un volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Colorazione CFSE e stimolazione delle cellule T

Distribuire 10⁷ cellule/tubo isolati della milza in 4 tubi (tubi da 15 mL, etichettati da 1 a 4)
Aggiungere 3 mL HBSS 2%FCS a ciascun tubo.
Aggiungere 1 μL di CSFE in ogni tubo (concentrazione finale- 5 μM).
Incubare i tubi a 37°C in un incubatore a CO_{2 al 5%} per 10 min.
Nei tubi 3 e 4, aggiungere 12 mL di anticorpo HBSS 2% FCS + anti-CD3 ad una concentrazione finale di 2,5 μg/mL. I tubi 3 e 4 sono stimolati utilizzando anticorpi anti-CD3, per osservare l’effetto sul ciclo cellulare.
Nei tubi 1 e 2 aggiungere 12 mL di HBSS 2% FCS. Le cellule nei tubi 1 e 2 non saranno stimolate.
Centrifugare tutti i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare i supernatanti.
Spese di sospensione del pellet in 2 ml di HBSS 2%FCS.
Trasferire le soluzioni risultanti in pozzetti separati su una piastra a 6 pozzetti.
Incubare le cellule a 37°C, 5% CO₂ per 3 giorni.

5. Colorazione cellulare

Il giorno 3, aggiungere 2 ml HBSS 2% FCS in ben 1 e 3.
Pipettare vigorosamente e trasferire i campioni in tubi FACS da 5 ml.
Continuare l’incubazione delle cellule rimanenti dai pozzi 2-4 a 37°C, 5% CO₂. Saranno analizzati il giorno 5 per studiare gli effetti a lungo termine della stimolazione sul ciclo cellulare.
Centrifugare i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare i supernatanti.
Aggiungere 100 μL di miscela di anticorpi (vedere Tabella 1) a ciascun tubo.

Anticorpo	Fluorocromo	Diluizione
CD3	Blu Pacifico	1/100
CD4	BV786 ·	1/1600
CD8	PE	1/400
Thy1,2	BV605 ·	1/400

Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Quattro cocktail di anticorpi che utilizzano coniugati fluorescenti anticorpali concentrati e HBSS.

Incubare i tubi per 20 minuti sul ghiaccio al buio.
Aggiungere 1 mL di HBSS 2%FCS e centrifugare i tubi a 370 x g per 7 min a 10°C.
Scartare il surnatante e risuspenare il pellet in 200 μL di HBSS 2% FCS.
Trasferire i pellet riaspendati in nuovi tubi FACS etichettati.
Valutare la proliferazione delle cellule T utilizzando FACS.
Il giorno 5, ripetere il processo di colorazione cellulare con le cellule dai restanti due pozzi della piastra a 6 pozzi.

6. Analisi dei dati

Aprire il software “FlowJo” e trascinare i file nella finestra “Tutti di esempio“.
Fare doppio clic sul file per le celle non stimolate raccolte il giorno 3 per visualizzare un dot plot con dispersione in avanti sull’asse Y e dispersione laterale sull’asse X.
Clicca su“Polygon”e crea una strategia di gating per selezionare le cellule linfoidi, Thy1.2⁺ CD3⁺ cellule e distinguere le cellule CD4⁺ e CD8⁺ (vedi Figura 1).

Figura 1: Strategia di Gating. Le cellule vengono prima recintate in base alla loro morfologia (a sinistra: FSC-A, SSC-A). Le cellule T vengono quindi gated (al centro: CD3, Thy1.2) e ulteriormente divise su cellule CD4⁺ T (arancione) e cd8⁺ T (blu) (a destra: CD4, CD8). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ripetere i passaggi con altri file.
Per determinare le frequenze delle celle in divisione e non in divisione, visualizzare prima le popolazioni cellulari facendo clic su “Editor di layout“.
Trascinare le celle T CD4 e CD8 T da ciascuna delle quattro provette nella finestra “Tutti i campioni“
Appariranno grafici che rappresentano ogni popolazione.
Usa l’istogramma per visualizzare i risultati e seleziona “CFSE” come parametro per il confronto dei diversi tubi e delle diverse popolazioni.
Le cellule non in divisione mantengono livelli più elevati di CFSE, mentre le cellule proliferanti dividono il contenuto di CFSE in cellule in divisione
Create un cancello su celle non divisorie e applicatelo in tutti i tubi.
Create un cancello sulle celle divisorie e applicatelo in tutti i tubi.
Per esaminare la frequenza di divisione delle celle CD3+, fare clic su “Editor tabelle“.
Trascinare le popolazioni di interesse – dividendo le cellule T CD8 e dividendo le cellule T CD4 – in “Tabella“.
Nel menu“Statistiche”,seleziona“Frequenza delle cellule T”,quindi fai clic su“Crea tabella”per visualizzare la frequenza in una nuova tabella.
Clicca su“Crea tabella”. Per visualizzare i valori di frequenza, visualizzateli in una nuova tabella.

Per la maggior parte degli studi di immunologia, la misurazione della proliferazione delle cellule immunitarie è un passo chiave e il metodo basato sul colorante fluorescente CFSE è comunemente usato. Una corretta divisione cellulare è importante per le cellule immunitarie poiché regola sia i livelli che la specificità di una risposta immunitaria. Ad esempio, le cellule T proliferano per identificare e uccidere le cellule tumorali e le cellule B subiscono la divisione cellulare per produrre anticorpi specifici. La premessa generale del test CSFE prevede la colorazione delle cellule con il colorante fluorescente verde CFSE, che entra nelle cellule vive e si lega stabilmente alle proteine all’interno, con conseguente etichettatura permanente. Di conseguenza, quando la cellula madre contenente colorante si divide, ogni cellula figlia ottiene metà della fluorescenza dalla cellula madre.

Questo processo continua nelle divisioni successive con l’intensità del colorante che diminuisce progressivamente con ogni divisione. All’endpoint desiderato, l’intensità di fluorescenza di ciascuna cellula viene misurata mediante citometria a flusso. Questi dati vengono quindi utilizzati per quantificare il numero e il modello di divisioni che le cellule hanno attraversato. Come mostrato qui, la popolazione cellulare con la più alta fluorescenza proviene dalla generazione madre. Il secondo più alto appartiene alla seconda generazione e così via. Il numero di picchi determina il numero di divisioni cellulari.

Inoltre, se vengono utilizzate cellule immunitarie primarie, specifiche popolazioni cellulari, come ad esempio le cellule T, possono essere etichettate con un colorante a fluorescenza di colore diverso insieme a CFSE e contemporaneamente identificate utilizzando la citometria a flusso multicolore. I nuovi dati possono essere tracciati sullo stesso grafico, ora mostrando la sotto-popolazione di cellule T con diverse intensità di colorazione CFSE, con cui il tasso di proliferazione delle cellule T può essere analizzato in modo specifico. Questo video mostra il protocollo per la colorazione CFSE degli splenociti di topo, che vengono stimolati con un anticorpo anti-CD3. Questo è seguito dalla colorazione per etichettare le cellule T e dalla citometria a flusso per tracciare la loro proliferazione cellulare.

Per iniziare, indossare indumenti protettivi appropriati e guanti da laboratorio. Quindi, lavare un paio di pinza e sezionare le forbici prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e quindi asciugarle con un tovagliolo di carta pulito. Preparare 50 millilitri di Hank’s Balanced Salt Solution, o HBSS, con una concentrazione del 2% di siero fetale per vitelli, o FCS, combinando un millilitro di FCS con 49 millilitri di HBSS in un tubo da 50 millilitri. Mescolare pipettando delicatamente la soluzione su e giù circa 10 volte. Quindi, isolare le cellule della milza di topo come dimostrato nel protocollo video per l’isolamento FACS dei linfociti B splenici.

Etichettare quattro tubi da 15 millilitro da uno a quattro e aggiungere una volta 10 alle sette cellule della milza isolate. Quindi, aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS a ciascun tubo. Quindi, pipettare un microlitro di cinque carbossifluoresceina micromolare estere succinimidyl, o CFSE, in ciascun tubo. Incubare i tubi a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% per 10 minuti. Le cellule nei tubi uno e due non saranno stimolate. Saranno utilizzati per rivelare il livello basale di proliferazione delle cellule T spleniche CD4 e CD8.

Pipettare 10 millilitri di HBSS 2% FCS in questi tubi. I tubi tre e quattro saranno stimolati dall’anticorpo anti-CD3 al fine di osservare gli effetti sul ciclo cellulare. Aggiungere 10 millilitri di HBSS 2% FCS e anticorpo anti-CD3 ad una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro ai tubi tre e quattro. Quindi, centrifugare tutti i tubi a 370 x g per sette minuti a 10 gradi Celsius. Scartare i supernatanti. Ricaspendare il pellet in due millilitri di HBSS 2% FCS e pipettare le soluzioni risultanti in pozzi separati su una piastra a sei pozzetti. Etichettare con attenzione la piastra da uno a quattro per tenere traccia delle identità del campione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per tre giorni.

Il terzo giorno, aggiungere due millilitri di HBSS 2% FCS ai pozzetti uno e tre, che dovrebbero contenere le cellule dei tubi uno e tre. Pipettare su e giù vigorosamente e quindi trasferire i campioni in tubi FACS da cinque millilitori etichettati. Rimettere la piastra a sei pozzi nell’incubatrice. Queste cellule rimanenti dai pozzi due e quattro saranno analizzate il quinto giorno per studiare gli effetti a lungo termine della stimolazione sul ciclo cellulare. Centrifugare i tubi a 370 x g per sette minuti a 10 gradi Celsius e quindi scartare i supernatanti. Ora, aggiungi 100 microlitri di miscela di anticorpi a ciascun tubo. Incubare i tubi per 20 minuti sul ghiaccio al buio. Quindi, aggiungere un millilitro di HBSS 2% FCS a ciascun tubo e centrifugare i tubi a 370 x g per sette minuti a 10 gradi Celsius. Scartare i supernatanti. Sospendere di ricandidare il pellet in 200 millilitri di HBSS 2% FCS e mescolare bene. Trasferire i pellet riconsoditi in nuovi tubi FACS etichettati.

Quindi, valutare la proliferazione delle cellule T utilizzando la citometria a flusso come mostrato nel protocollo FACS. Gate le cellule per selezionare le cellule linfoidi CD3-positive e per distinguere le cellule CD4-positive e CD8-positive, e registrare i dati per i tubi uno e tre. Il quinto giorno, ripetere il processo di colorazione cellulare con le cellule dai restanti due pozzi della piastra a sei pozzi.

Analizzeremo gli effetti della stimolazione CD3 sul ciclo cellulare delle cellule CD4 e CD8-positive a tre giorni e cinque giorni dopo la stimolazione. Per iniziare, fai clic sull’icona FlowJo e trascina i tuoi file nella finestra Tutti i campioni. Fare doppio clic sul file per le celle non stimolate raccolte il terzo giorno per visualizzare un dot plot con dispersione in avanti sull’asse y e scatter laterale sull’asse x. Clicca sul poligono per cerchiare le popolazioni di linfociti in base alla loro morfologia. Nella finestra di identificazione della sottosociazione, denominare i linfociti della popolazione e fare clic su OK. Quindi, fare doppio clic sulla popolazione cerchiata e nella nuova finestra selezionare Thy1.2 sull’asse y e CD3 sull’asse x. Quindi, fare clic su poligono per circondare le celle CD3 e Thy1.2 double positive. Nella nuova finestra di identificazione della sottosopecie, denominare le cellule T della popolazione e fare clic su OK. Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata. Nella nuova finestra, selezionate CD4 sull’asse y e CD8 sull’asse x. Quindi, fare clic su poligono per cerchiare la popolazione CD4-positiva. Nella nuova finestra di identificazione della sottosopecie, denominare le cellule T CD4 della popolazione e fare clic su OK. Ora, fai clic su poligono per cerchiare la popolazione CD8-positiva. Nella nuova finestra di identificazione della sottoso popolazione, denominare le cellule T CD8 della popolazione e fare clic su OK. Ripetere questi passaggi con gli altri file.

Per determinare le frequenze delle celle in divisione e non in divisione, in primo luogo, visualizzare le popolazioni di celle facendo clic su Editor layout. Quindi, trascinare le cellule T CD4 e le celle T CD8 da ciascuna delle quattro provette alla finestra Tutti i campioni. Appariranno grafici che rappresentano le tue popolazioni. Per ogni tubo, fare doppio clic sul dot plot per le cellule T CD8 e selezionare Istogramma in Definizione grafico per visualizzare i risultati. Selezionare CFSE come parametro per confrontare le popolazioni cellulari stimolate rispetto a quelle non stimolate in ogni punto temporale. Le cellule che non si dividono mantengono livelli più elevati di CFSE mentre le cellule proliferanti dividono il contenuto di CFSE in cellule in divisione.

Ora, mentre si preme il tasto Maiusc, fare doppio clic sull’istogramma. Nella nuova finestra, fare clic su intervallo e selezionare l’intervallo di CFSE corrispondente al picco più alto. Nella finestra di identificazione della sottosopecificazione, denominare la popolazione Cellule T CD8 non divisorie ed etichettare la popolazione Cellule CD8 in divisione. Ora, ripeti per selezionare le cellule T CD4 che dividono e non dividono in ciascun tubo. Per esaminare la frequenza di divisione delle celle CD3-positive, fare clic su Editor tabella. Quindi, trascina le popolazioni di interesse, Dividendo le cellule T CD8 e Dividendo le cellule T CD4, nella tabella. Nel menu Statistiche, selezionare Frequenza delle cellule T. Quindi, fai clic su Crea tabella per visualizzare la frequenza in una nuova tabella.

Results

In questo esperimento, abbiamo seguito la proliferazione delle cellule T spleniche CD4⁺ e CD8⁺ in coltura in vitro. Dopo 3 giorni, non abbiamo visto una forte proliferazione in entrambe le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ con o senza stimolazione. Questo può essere visto nel pannello superiore della Figura 2 dove i picchi di CSFE non stanno diminuendo. Tuttavia, dopo 5 giorni, abbiamo iniziato a vedere la proliferazione in entrambe le popolazioni, il che è evidente dalla diminuzione dei picchi CSFE (pannelli inferiori, Figura 2). La colorazione CFSE dimostra chiaramente che entrambe le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ si dividevano di più dopo la stimolazione. Inoltre, le cellule T CD8⁺ sembravano essere leggermente più proliferative delle cellule CD4⁺ T dopo 5 giorni di stimolazione.

Figura 2: Proliferazione delle cellule T CD4 rispetto a CD8. Proliferazione delle cellule T al giorno 3 (pannello superiore) e al giorno 5 (pannello inferiore). Il ciclo cellulare viene confrontato tra le cellule T CD4 e CD8 con o senza stimolazione in due giorni diversi. Le cellule T CD4 e CD8 proliferano di più quando stimolate. Le cellule T stimolate CD8 proliferano più delle cellule T stimolate CD4 al giorno 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applications and Summary

I saggi di proliferazione sono spesso utilizzati in diversi campi come l’immunologia per determinare il grado di attivazione delle cellule. Viene anche eseguito nella diagnostica oncologica per determinare l’aggressività del tumore nei pazienti. La colorazione CFSE è una tecnica utile per seguire la proliferazione delle popolazioni di cellule immunitarie nel tempo. Altri metodi consentono la caratterizzazione del ciclo cellulare. BrdU, un equivalente di CFSE è incorporato solo nelle cellule in divisione. Il recente modello murino Fucci consente anche il rilevamento delle fasi del ciclo cellulare, senza ulteriori macchie.

References

Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).

Transcript

For most immunology studies, measuring proliferation of immune cells is a key step and the CFSE fluorescent dye-based method is commonly used. Proper cell division is important for immune cells since it regulates both levels and specificity of an immune response. For example, T-cells proliferate to identify and kill cancer cells and B-cells undergo cell division to produce specific antibodies. The overall premise of the CSFE assay involves staining the cells with the green fluorescent dye CFSE, which enters live cells and stably binds to the proteins inside, resulting in permanent labeling. As a result, when the dye-containing parent cell divides, each daughter cell gets half the fluorescence from the parent cell.

This process continues in the subsequent divisions with the dye intensity progressively decreasing with each division. At the desired endpoint, the fluorescence intensity of each cell is measured by flow cytometry. This data is then used to quantify the number and pattern of divisions the cells have gone through. As shown here, the cell population with the highest fluorescence are from the parent generation. The second highest belongs to the second generation and so on. The number of peaks determines the number of cell divisions.

In addition, if primary immune cells are used, specific cell populations, like the T-cells for example, can be labeled with a different colored fluorescence dye along with CFSE, and simultaneously identified using multicolor flow cytometry. The new data can be plotted on the same graph, now showing the T-cell sub-population with different CFSE staining intensities, by which the proliferation rate of the T-cells can be specifically analyzed. This video demonstrates the protocol for CFSE staining of mouse splenocytes, which are stimulated with an anti-CD3 antibody. This is followed by staining to label T-cells and flow cytometry to track their cell proliferation.

To begin, put on appropriate protective clothing and laboratory gloves. Next, wash a pair of forceps and dissecting scissors first with a detergent and then with 70% ethanol and then wipe them dry with a clean paper towel. Prepare 50 milliliters of Hank’s Balanced Salt Solution, or HBSS, with a 2% concentration of fetal calf serum, or FCS, by combining one milliliter of FCS with 49 milliliters of HBSS in a 50 milliliter tube. Mix by gently pipetting the solution up and down approximately 10 times. Then, isolate mouse spleen cells as demonstrated in the video protocol for FACS isolation of splenic B-lymphocytes.

Label four 15-milliliter tubes one through four and add one times 10 to the seventh isolated spleen cells. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to each tube. Then, pipette one microliter of five micromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester, or CFSE, into each tube. Incubate the tubes at 37 degrees Celsius in a 5% carbon dioxide incubator for 10 minutes. The cells in tubes one and two will not be stimulated. They will be used to reveal the basal level of proliferation of splenic CD4 and CD8 T-cells.

Pipette 10 milliliters of HBSS 2% FCS into these tubes. Tubes three and four will be stimulated by anti-CD3 antibody in order to observe the effects on the cell cycle. Add 10 milliliters of HBSS 2% FCS and anti-CD3 antibody at a final concentration of 2.5 micrograms per milliliter to tubes three and four. Next, centrifuge all of the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants. Resuspend the pellets in two milliliters of HBSS 2% FCS and pipette the resulting solutions into separate wells on a six-well plate. Carefully label the plate from one to four to keep track of sample identities. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for three days.

On day three, add two milliliters of HBSS 2% FCS to wells one and three, which should contain the cells from tubes one and three. Pipette up and down vigorously and then transfer the samples into labeled five-milliliter FACS tubes. Place the six-well plate back into the incubator. These remaining cells from wells two and four will be analyzed on day five to investigate long-term effects of stimulation on the cell cycle. Centrifuge the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatants. Now, add 100 microliters of antibody mix to each tube. Incubate the tubes for 20 minutes on ice in the dark. Next, add one milliliter of HBSS 2% FCS to each tube and centrifuge the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants. Re-suspend the pellets in 200 milliliters of HBSS 2% FCS and mix well. Transfer the resuspended pellets to new labeled FACS tubes.

Then, evaluate T-cell proliferation using flow cytometry as shown in the FACS protocol. Gate the cells to select lymphoid CD3-positive cells and to distinguish CD4-positive and CD8-positive cells, and record the data for tubes one and three. On day five, repeat the cell-staining process with the cells from the remaining two wells of the six-well plate.

We will analyze the effects of CD3 stimulation on the cell cycle of CD4 and CD8-positive cells at three days and five days post-stimulation. To begin, click on the FlowJo icon and drag your files into the All Sample window. Double-click on the file for the unstimulated cells collected on day three to display a dot plot with forward scatter on the y-axis and side scatter on the x-axis. Click on polygon to circle the lymphocyte populations based on their morphology. In the sub-population identification window, name the population lymphocytes and click OK. Next, double-click on the circled population and in the new window, select Thy1.2 on the y-axis and CD3 on the x-axis. Then, click on polygon to circle the CD3 and Thy1.2 double positive cells. In the new sub-population identification window, name the population T-Cells and click OK. Next, double-click on the circled population. In the new window, select CD4 on the y-axis and CD8 on the x-axis. Then, click on polygon to circle the CD4-positive population. In the new sub-population identification window, name the population CD4 T-Cells and click OK. Now, click on polygon to circle the CD8-positive population. In the new sub-population identification window, name the population CD8 T-Cells and click OK. Repeat these steps with the other files.

To determine the frequencies of dividing and non-dividing cells, first, visualize the cell populations by clicking on Layout Editor. Then, drag the CD4 T-cells and CD8 T-cells from each of the four tubes to the All Sample window. Graphs representing your populations will appear. For each tube, double-click on the dot plot for CD8 T-cells and select Histogram under Graph Definition to visualize the results. Select CFSE as the parameter to compare the stimulated versus unstimulated cell populations at each time point. Non-dividing cells maintain higher levels of CFSE whereas proliferating cells split the content of CFSE to dividing cells.

Now, while pressing the Shift key, double-click on the histogram. In the new window, click range and select the range of CFSE corresponding to the highest peak. In the sub-population identification window, name the population Non-Dividing CD8 T-Cells and label the population Dividing CD8 Cells. Now, repeat to select the dividing and non-dividing CD4 T-cells in each tube. To examine the frequency of dividing CD3-positive cells, click on Table Editor. Then, drag the populations of interest, Dividing CD8 T-Cells and Dividing CD4 T-Cells, into table. On the Statistic menu, select Frequency of T-cells. Then, click on Create Table to reveal the frequency in a new table.

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