Analisi del ciclo cellulare: valutazione della proliferazione delle cellule T CD8 e CD4 in seguito a stimolazione tramite colorazione CFSE e citometria a flusso

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugarli accuratamente.
3. Preparare 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale per vitelli (FCS).

2. Dissezione

1. Utilizzando un sistema di rilascio di anidride carbonica, eutanasizzare il topo per ipossia. Fissare il topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina ed eseguire una laparotomia longitudinale usando forbici e pinza.
2. Usando la pinza, spostare l'intestino e lo stomaco sul lato destro dell'addome per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco.
3. Usando la pinza staccare accuratamente la milza dallo stomaco e metterla nella capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

1. Posizionare la milza su un colino cellulare da 40 μm sulla stessa capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla.
2. Trasferire la milza dissociata e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
3. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
4. Ricaspendare il pellet in 2 ml di acetato di potassio per lisire gli eritrociti. Attendere 2 minuti e quindi portare il volume fino a 15 ml utilizzando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare il surnatante e ricaspenare il pellet in 5 ml di HBSS 2% FCS.
6. Contare le cellule utilizzando un test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a 10⁷ cellule / mL utilizzando un volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Colorazione CFSE e stimolazione delle cellule T

1. Distribuire 10⁷ cellule/tubo isolati della milza in 4 tubi (tubi da 15 mL, etichettati da 1 a 4)