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Per la maggior parte degli studi immunologici, la misurazione della proliferazione delle cellule immunitarie è un passaggio fondamentale e il metodo basato sul colorante fluorescente CFSE è comunemente usato. Una corretta divisione cellulare è importante per le cellule immunitarie poiché regola sia i livelli che la specificità di una risposta immunitaria. Ad esempio, le cellule T proliferano per identificare e uccidere le cellule tumorali e le cellule B subiscono la divisione cellulare per produrre anticorpi specifici. La premessa generale del test CSFE prevede la colorazione delle cellule con il colorante fluorescente verde CFSE, che entra nelle cellule vive e si lega stabilmente alle proteine all'interno, con conseguente marcatura permanente. Di conseguenza, quando la cellula madre contenente il colorante si divide, ogni cellula figlia riceve metà della fluorescenza dalla cellula madre.
Questo processo continua nelle divisioni successive con l'intensità del colorante che diminuisce progressivamente ad ogni divisione. All'endpoint desiderato, l'intensità di fluorescenza di ciascuna cellula viene misurata mediante citometria a flusso. Questi dati vengono quindi utilizzati per quantificare il numero e il modello di divisioni che le cellule hanno attraversato. Come mostrato qui, la popolazione cellulare con la più alta fluorescenza proviene dalla generazione madre. Il secondo più alto appartiene alla seconda generazione e così via. Il numero di picchi determina il numero di divisioni cellulari.
Inoltre, se vengono utilizzate cellule immunitarie primarie, popolazioni cellulari specifiche, come ad esempio le cellule T, possono essere etichettate con un colorante a fluorescenza di colore diverso insieme a CFSE e contemporaneamente identificate utilizzando la citometria a flusso multicolore. I nuovi dati possono essere tracciati sullo stesso grafico, che ora mostra la sottopopolazione di cellule T con diverse intensità di colorazione CFSE, con la quale il tasso di proliferazione delle cellule T può essere analizzato in modo specifico. Questo video mostra il protocollo per la colorazione CFSE degli splenociti di topo, che vengono stimolati con un anticorpo anti-CD3. Segue la colorazione per marcare le cellule T e la citometria a flusso per monitorare la loro proliferazione cellulare.
Per iniziare, indossare indumenti protettivi adeguati e guanti da laboratorio. Successivamente, lava un paio di pinze e forbici da dissezione prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugali con un tovagliolo di carta pulito. Preparare 50 millilitri di Hank's Balanced Salt Solution, o HBSS, con una concentrazione del 2% di siero fetale di vitello, o FCS, combinando un millilitro di FCS con 49 millilitri di HBSS in una provetta da 50 millilitri. Mescolare pipettando delicatamente la soluzione su e giù per circa 10 volte. Quindi, isolare le cellule della milza di topo come dimostrato nel protocollo video per l'isolamento FACS dei linfociti B splenici.
Etichettare quattro provette da 15 millilitri da una a quattro e aggiungere una volta 10 alla settima cellula isolata della milza. Quindi, aggiungere tre millilitri di HBSS 2% FCS a ciascun tubo. Quindi, pipettare un microlitro di cinque micromolari carbossifluoresceina succinimidil estere, o CFSE, in ciascuna provetta. Incubare le provette a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica per 10 minuti. Le cellule nelle provette uno e due non saranno stimolate. Saranno utilizzati per rivelare il livello basale di proliferazione delle cellule T spleniche CD4 e CD8.
Pipettare 10 millilitri di HBSS 2% FCS in queste provette. Le provette tre e quattro saranno stimolate da anticorpi anti-CD3 per osservare gli effetti sul ciclo cellulare. Aggiungere 10 millilitri di HBSS 2% FCS e anticorpi anti-CD3 a una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro alle provette tre e quattro. Quindi, centrifugare tutte le provette a 370 x g per sette minuti a 10 gradi Celsius. Scartare i surnatanti. Risospendere i pellet in due millilitri di HBSS 2% FCS e pipettare le soluzioni risultanti in pozzetti separati su una piastra a sei pozzetti. Etichettare attentamente la lastra da uno a quattro per tenere traccia delle identità dei campioni. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per tre giorni.
Il terzo giorno, aggiungere due millilitri di HBSS 2% FCS ai pozzetti uno e tre, che dovrebbero contenere le cellule delle provette uno e tre. Pipettare energicamente su e giù, quindi trasferire i campioni in provette FACS da cinque millilitri etichettate. Riposizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatore. Queste cellule rimanenti dai pozzetti due e quattro saranno analizzate il quinto giorno per studiare gli effetti a lungo termine della stimolazione sul ciclo cellulare. Centrifugare le provette a 370 x g per sette minuti a 10 gradi Celsius e poi scartare i surnatanti. Ora, aggiungi 100 microlitri di miscela di anticorpi a ciascuna provetta. Incubare le provette per 20 minuti su ghiaccio al buio. Quindi, aggiungere un millilitro di HBSS 2% FCS a ciascuna provetta e centrifugare le provette a 370 x g per sette minuti a 10 gradi Celsius. Scartare i surnatanti. Risospendere i pellet in 200 millilitri di HBSS 2% FCS e mescolare bene. Trasferire i pellet risospesi in nuovi tubi FACS etichettati.
Quindi, valutare la proliferazione delle cellule T utilizzando la citometria a flusso come mostrato nel protocollo FACS. Gate le cellule per selezionare le cellule linfoidi CD3-positive e per distinguere le cellule CD4-positive e CD8-positive, e registrare i dati per le provette uno e tre. Il quinto giorno, ripetere il processo di colorazione delle cellule con le cellule dei restanti due pozzetti della piastra a sei pozzetti.
Analizzeremo gli effetti della stimolazione CD3 sul ciclo cellulare delle cellule CD4 e CD8-positive a tre giorni e cinque giorni dopo la stimolazione. Per iniziare, fai clic sull'icona FlowJo e trascina i tuoi file nella finestra Tutti i campioni. Fare doppio clic sul file per le cellule non stimolate raccolte il terzo giorno per visualizzare un grafico a punti con dispersione diretta sull'asse y e dispersione laterale sull'asse x. Fare clic sul poligono per cerchiare le popolazioni di linfociti in base alla loro morfologia. Nella finestra di identificazione della sottopopolazione, assegnare un nome ai linfociti della popolazione e fare clic su OK. Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata e nella nuova finestra, seleziona Thy1.2 sull'asse y e CD3 sull'asse x. Quindi, fai clic sul poligono per cerchiare le celle doppie positive CD3 e Thy1.2. Nella finestra di identificazione della nuova sottopopolazione, assegnare alla popolazione il nome T-Cells e fare clic su OK. Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata. Nella nuova finestra, selezionare CD4 sull'asse y e CD8 sull'asse x. Quindi, fare clic sul poligono per cerchiare la popolazione CD4-positiva. Nella nuova finestra di identificazione della sottopopolazione, denominare la popolazione CD4 T-Cells e fare clic su OK. Ora, fai clic sul poligono per cerchiare la popolazione CD8-positiva. Nella nuova finestra di identificazione della sottopopolazione, assegnare alla popolazione il nome CD8 T-Cells e fare clic su OK. Ripetere questi passaggi con gli altri file.
Per determinare le frequenze delle cellule in divisione e non in divisione, in primo luogo, visualizzare le popolazioni cellulari facendo clic su Editor layout. Quindi, trascinare le cellule T CD4 e le cellule T CD8 da ciascuna delle quattro provette alla finestra Tutti i campioni. Appariranno grafici che rappresentano le tue popolazioni. Per ogni provetta, fare doppio clic sul grafico a punti per le cellule T CD8 e selezionare Istogramma in Definizione grafico per visualizzare i risultati. Selezionare CFSE come parametro per confrontare le popolazioni cellulari stimolate con quelle non stimolate in ogni momento. Le cellule non in divisione mantengono livelli più elevati di CFSE, mentre le cellule proliferanti dividono il contenuto di CFSE in cellule in divisione.
Ora, tenendo premuto il tasto Maiusc, fai doppio clic sull'istogramma. Nella nuova finestra, fare clic su intervallo e selezionare l'intervallo di CFSE corrispondente al picco più alto. Nella finestra di identificazione della sottopopolazione, denominare la popolazione Cellule T CD8 non in divisione ed etichettare la popolazione in cellule CD8 in divisione. Ora, ripeti per selezionare le cellule T CD4 che si dividono e non si dividono in ciascuna provetta. Per esaminare la frequenza di divisione delle cellule CD3-positive, fare clic su Editor di tabelle. Quindi, trascina le popolazioni di interesse, Cellule T CD8 in divisione e Cellule T T CD4 in divisione, nella tabella. Nel menu Statistica, selezionare Frequenza delle cellule T. Quindi, fai clic su Crea tabella per visualizzare la frequenza in una nuova tabella.
