Trasferimento di cellule adottive: introduzione degli splenociti di topo donatore a un topo ospite e valutazione del successo tramite FACS

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugare accuratamente.
3. Preparare 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale per vitelli (FCS).

2. Dissezione

1. Utilizzando un sistema di rilascio di anidride carbonica, eutanasizzare il topo per ipossia. Fissare il topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina ed eseguire una laparotomia longitudinale usando forbici e pinza.
2. Usando la pinza muovi l'intestino e lo stomaco sul lato destro dell'addome per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco.
3. Usando una pinza staccare accuratamente la milza dallo stomaco e posizionarla sulla capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

1. Posizionare la milza su un colino cellulare da 40 μm sopra la capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla.
2. Recuperare le cellule aderenti risciacquando lo stantuffo e il filtro con 1 mL di HBSS 2% FCS.
3. Trasferire la milza dissociata e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
4. Lavare la capsula di Petri con 5 millilitri di HBSS 2% FCS e trasferire il fluido nel tubo da 15 ml.
5. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
6. Risuscisci il pellet in 2 mL di pipetto di cloruro di ammonio di potassio su e giù per ricaspendare il pellet e lisi gli eritrociti.
7. Attendere 2 min e aggiungere HBSS 2% FCS al pellet riaspenso per ottenere il volume fino a 14 mL.
8. Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare il surnatante e ricasospenare il pellet in 5 ml di HBSS 2% FCS tubando su e giù.
9. Contare le cellule utilizzando il test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a^{10 7} cellule / mL utilizzando il volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Trasferimento adottivo

1. Trasferire 2 mL di sospensione cellulare ottenuta in un tubo di raccolta da 5 mL.
2. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C e poi scartare il surnatante.
3. Spese di sospensione del pellet in 2 mL di PBS e centrifugazione del tubo a 370 x g per 7 min a 10°C.
4. Scartare il pellet surnatante e spese in 200 μL di PBS.
5. Utilizzando una siringa da 0,5 mL con un ago da 29G iniettare 200 μL di sospensione cellulare nel topo sperimentale per via endovenosa nel seno sanguigno retro-orbitale.
6. Come controllo, iniettare un secondo topo nello stesso seno sanguigno con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato.

5. Raccolta e colorazione delle cellule

1. Quattro giorni dopo il trasferimento adottivo, eutanasizzare i topi e rimuovere la milza.
2. Raccogliere gli splenociti come descritto nel paragrafo 3.
3. Trasferire 100 μL di sospensioni cellulari da ciascun topo in due tubi FACS, etichettati come "controllo" e "trasferiti".
4. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C e poi scartare i supernatanti.
5. Preparare una miscela contenente i quattro anticorpi alle diluizioni elencate nella Tabella 1.

Anticorpi	Fluorocromo	Diluizione
CD45,1	BV711 ·	1/200
CD45,2	APCCy7 ·	1/400
CD4	BV786 ·	1/1600
CD3	BV421 ·	1/200

Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Preparazione di cocktail a quattro anticorpi utilizzando coniugati fluorescenti anticorpali concentrati e HBSS.

6. Aggiungere 100 μL della miscela a ciascun tubo, quindi incubare per 20 minuti sul ghiaccio al buio.
7. Aggiungere 1 mL di HBSS 2%FCS e quindi centrifugare i tubi a 370 x g per 3 minuti a 10°C.
8. Scartare i supernatanti e ricasospenare i pellet in 200 μL di HBSS 2% FCS.
9. Trasferire le celle riconsepense in nuovi tubi FACS etichettati.
10. Utilizzando la citometria a flusso, come mostrato nel protocollo FACS, valutare la presenza di linfociti CD45.2 positivi.

6. Analisi dei dati

1. Aprire il software "FlowJo" e trascinare i file per ogni tubo nella finestra " Tutti icampioni".
2. Fare doppio clic sul file "trasferito" per visualizzare le celle registrate da quel campione su un dot plot che visualizza la dispersione in avanti "SSC-A" sull'asse Y e la dispersione laterale "FSC-A" sull'asse X.
3. Fare clic su "poligono" e creare una strategia di gating per selezionare i linfociti, quindi distinguere le cellule donatrici e ospiti utilizzando marcatori di superficie cellulare (CD45.1, CD45.2) e quindi caratterizzare la popolazione cellulare CD45.2⁺ (CD3, CD4).
4. Ripetere i passaggi di analisi con il file "control mouse".
5. Per visualizzare una popolazione di celle, fare clic su "Editor di layout".
6. Trascinare le "celle trasferite" e la popolazione di "celle CD4 trasferite" dai file "trasferiti" e "di controllo" nella scheda "Editor layout".
7. Apparirà un dot plot che rappresenta le cellule CD45.2⁺ e i linfociti CD4.
8. Le celle trasferite CD45.2 dovrebbero apparire solo nel dot plot "trasferito dal mouse".