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Il trasferimento cellulare adottivo è un metodo per introdurre cellule di interesse in un organismo. È una tecnica potente per studiare vari meccanismi biologici, tra cui l'azione di specifiche classi di cellule immunitarie. Inoltre, il trasferimento adottivo è un nuovo trattamento promettente per numerose condizioni, come quelle che richiedono trapianti di midollo osseo o trattamenti antitumorali in cui le cellule T di un paziente possono essere estratte, modificate per riconoscere e distruggere le cellule cancerose e quindi restituite al corpo per combattere i tumori.
In laboratorio, i modelli animali sono spesso utilizzati per studiare il trasferimento adottivo. Ad esempio, i topi knockout CD45.1 Rag gamma-c mancano di recettori fondamentali per molte citochine, che sono essenziali per la normale differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche in linfociti. Di conseguenza, i topi knockout hanno uno sviluppo linfocitario compromesso e non hanno cellule natural killer, o NK, cellule T o cellule B.
Il trasferimento adottivo può essere utilizzato per introdurre le cellule immunitarie mancanti in questi topi compromessi, raccogliendo prima il tessuto del topo donatore contenente alte concentrazioni di cellule immunitarie, come la milza. Il tessuto viene quindi dissociato e una varietà di cellule della milza, comprese le cellule immunitarie, vengono isolate. Successivamente, gli eritrociti indesiderati, o globuli rossi, possono essere lisati tramite l'aggiunta di tampone lisanti di potassio cloruro di ammonio e i globuli bianchi rimanenti, o splenociti, vengono quindi separati dai detriti cellulari mediante centrifugazione.
Infine, gli splenociti purificati vengono iniettati nei topi immunocompromessi, facilitando studi dettagliati delle funzioni di queste cellule. Diversi giorni dopo, il successo del trasferimento delle cellule immunitarie adottive può essere confermato isolando e preparando prima gli splenonciti dell'ospite allo stesso modo del tessuto del donatore. Quindi, queste cellule vengono colorate utilizzando anticorpi marcati contro i marcatori delle cellule immunitarie del donatore in modo che possano essere verificate e ordinate utilizzando FACS.
Per iniziare, indossa i guanti da laboratorio e i dispositivi di protezione adeguati. Successivamente, lava un paio di pinze e forbici da dissezione prima con un detersivo e poi con etanolo al 70% e poi asciugali con un tovagliolo di carta pulito. Preparare 50 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank, o HBSS, con il 2% di siero fetale di vitello, o FCS, combinando un millilitro di FCS con 49 millilitri di HBSS in una provetta da 50 millilitri. Mescolare pipettando delicatamente la soluzione su e giù per circa 10 volte.
Sezionare il topo soppresso e rimuovere la milza come dimostrato nel protocollo video JoVE Tecnologia FACS per la separazione dei linfociti B splenici. Per isolare le cellule immunitarie, posizionare prima la milza su un colino cellulare da 40 micrometri in una capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla nel piatto. Recuperare le cellule aderenti sciacquando lo stantuffo e il colino con 1 millilitro di HBSS 2% FCS. Quindi, pipettare la milza dissociata e il fluido dalla capsula di Petri in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Lavare la capsula di Petri con 5 millilitri di HBSS 2% FCS e trasferire il fluido nella provetta da 15 millilitri.
Centrifugare la provetta a 370 volte g per sette minuti a 10 gradi Celsius e poi recuperare la provetta con attenzione per non disturbare il pellet. A questo punto, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e gettare il liquido in un apposito contenitore per rifiuti. Quindi, aggiungere due millilitri di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio alla provetta da centrifuga e pipettare su e giù per risospendere il pellet e lisare gli eritrociti. Attendere due minuti e poi aggiungere HBSS 2% FCS al pellet risospeso per ottenere un valore totale di 14 millilitri. Ripetere la centrifugazione. Recuperare il tubo con cautela e gettare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet in 5 millilitri di HBSS 2% FCS pipettandolo su e giù. Quindi, conta le cellule in sospensione. Aggiungere cinque microlitri di blu di tripano a cinque microlitri di sospensione cellulare e mescolare bene pipettando. Quindi, depositare delicatamente una goccia di cinque microlitri di sospensione cellulare diluita tra il vetro di copertura e il vetrino Malassez. Con il microscopio impostato su un ingrandimento di 40X, contare il numero di cellule. Regolare la concentrazione delle cellule da 10 a sette cellule per millilitro aggiungendo il volume appropriato di HBSS 2% FCS.
Per iniziare il trasferimento adottivo, trasferire due millilitri della sospensione cellulare in una provetta di raccolta da cinque millilitri. Centrifugare la provetta a 370 volte g per sette minuti a 10 gradi Celsius e poi scartare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet in due millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato e centrifugare la provetta a 370 volte g per sette minuti a 10 gradi Celsius. Scartare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzando una siringa da 0,5 millilitri con un ago calibro 29, iniettare 200 microlitri di sospensione cellulare nel topo sperimentale per via endovenosa nel seno sanguigno retro-orbitale.
Quattro giorni dopo il trasferimento adottivo, sopprimere i topi e rimuovere la milza. Quindi, raccogli le cellule immunitarie come descritto nella sezione tre. Successivamente, trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare da ciascun topo in due provette FACS etichettate per il controllo e trasferite. Centrifugare le provette a 370 volte g per sette minuti a 10 gradi Celsius e poi scartare i surnatanti. Ora, preparare una miscela contenente i quattro anticorpi alla diluizione elencata nella tabella uno. Aggiungere 100 microlitri di miscela in ogni provetta e poi incubare per 20 minuti su ghiaccio al buio. Quindi, aggiungere un millilitro di HBSS 2% FCS a ciascuna provetta e quindi centrifugare le provette a 370 volte g per tre minuti a 10 gradi Celsius. Scartare i surnatanti e poi risospendere i pellet in 200 microlitri di HBSS 2% FCS. Trasferire le cellule risospese in nuove provette FACS marcate. Ora, utilizzare la citometria a flusso come mostrato nel protocollo FACS per valutare la presenza di CD45. 2 linfociti positivi.
Ora, determineremo la presenza di linfociti CD45.2 che sono stati isolati dal CD45. 1 ostia milza. Per iniziare, fare doppio clic sull'icona FlowJo e trascinare i file per ogni tubo nella finestra di tutti i campioni. Quindi, fare doppio clic sul file trasferito per visualizzare le celle registrate da quel campione su un grafico a punti che visualizza la dispersione in avanti FSCA sull'asse x e la dispersione laterale SSCA sull'asse y. Fare clic sul poligono per cerchiare le popolazioni di linfociti. Viene visualizzata una nuova finestra di identificazione della sottopopolazione. Fare clic su OK. Ora, impostare l'asse y su FSC-W e l'asse x su FSC-A. Seleziona la popolazione di singole celle con lo strumento poligono come dimostrato in precedenza.
Quindi, fai doppio clic sulla popolazione cerchiata per creare una nuova finestra per le celle selezionate. Nella nuova finestra, selezionare CD45.2 sulla Y e CD45.1 sulla X. Fare clic sull'icona T e personalizzare l'asse per ingrandire il grafico. Quindi, fai clic sul poligono per cerchiare le celle positive CD45.2. Nella finestra di identificazione della sottopopolazione, assegnare un nome alla popolazione cellulare trasferita e fare clic su OK. Nella stessa finestra, fare clic sul rettangolo per selezionare le celle CD45.2 negative. Nella finestra di identificazione della sottopopolazione, assegnare un nome alla popolazione cellulare e fare clic su OK. Quindi, fare doppio clic sulla popolazione cerchiata CD45.2, popolazione trasferita, per creare una nuova finestra per le celle selezionate. Nella nuova finestra, selezionare CD3 sulla Y e CD4 sulla X.
Quindi, fare clic sul poligono per cerchiare le celle CD4 CD3 positive. In questa finestra di identificazione della sottopopolazione, assegna un nome alla popolazione cellulare CD4 trasferita. Quindi, ripetere i passaggi di analisi precedenti con il file del mouse di controllo. Infine, per visualizzare le tue popolazioni cellulari, fai clic su Editor di layout. Trascinare le celle trasferite e la popolazione di cellule CD4 trasferite dai file trasferiti e di controllo nella scheda Editor layout. Apparirà un grafico a punti che rappresenta le cellule CD45.2 positive e i linfociti CD4. CD45. 2 celle trasferite dovrebbero apparire solo nel grafico a punti del mouse trasferito.
