5.12: Saggio per la morte cellulare: saggio di rilascio di cromo della capacità citotossica

Panoramica della procedura

Il tipico test ⁵¹Cr-release per misurare la morte cellulare prevede i seguenti passaggi:

1. Innanzitutto, le cellule bersaglio sono etichettate con Na₂[⁵¹Cr]O₄. Questo li distingue dalle cellule emotrici nel test.
2. Mentre le cellule bersaglio vengono etichettate, le cellule emotrici vengono raccolte e, utilizzando la tecnica di diluizione seriale, viene generata una titolazione decrescente delle cellule emotrici in una piastra di saggio a fondo rotondo da 96 pozzetti.
3. Alla fine dell'etichettatura della cellula bersaglio, le cellule vengono prima lavate e quindi un numero fisso di cellule viene aggiunto alla piastra di dosaggio che contiene già una serie di diluizioni di cellule emotrici.
4. Successivamente, la miscela cellulare bersaglio-effettore viene incubata per un periodo di tempo definito per consentire una sufficiente interazione cellulare con le cellule bersaglio, per mediare la lisi cellulare.
5. Infine, i supernatanti di coltura vengono raccolti e raccolti in tubi. La quantità di ⁵¹Cr viene quantificata utilizzando un contatore gamma.
6. Alla fine, i dati vengono raccolti e utilizzati per calcolare la "percentuale specifica di lisi cellulare" delle cellule bersaglio.

1. Etichettatura delle cellule target con ⁵¹Cr

1. Per iniziare, preparare le cellule bersaglio, (qui- linea cellulare di melanoma umano WM793), in una sospensione a singola cellula.
2. Per fare ciò, rimuovere prima il mezzo dal pallone di coltura del tessuto.
3. Quindi, lavare le cellule con 5 ml di 1X PBS.
4. Tripsinizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina alla piastra per ~ 2 min.
5. Picchiettare delicatamente il matraccio per allentare le celle dalla superficie del pallone.
6. Aggiungere 5 mL di supporti RPMI al pallone e pipettare il supporto su e giù per staccare le celle.
7. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 1200 giri/min. Decantare il surnatante.
8. Aggiungere 10 ml di media al pellet e pipettare delicatamente il supporto su e giù per portare le celle in sospensione.
9. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
10. Trasferire 1x10⁶ celle in un nuovo tubo conico da 15 mL.
11. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1200 giri/min e decantare il surnatante.
12. Vortice brevemente il tubo per risusciere il pellet cellulare nel piccolo volume di mezzo lasciato indietro.
13. Aggiungere 100 μCi di ⁵¹Cr direttamente alla sospensione della cella target WM793.
    Nota: Ci dovrebbe essere uno spazio di laboratorio dedicato allestito per la particolare radioattività. Inoltre, ci dovrebbe essere un'ampia schermatura al piombo per la conservazione e l'uso sicuri del ⁵¹Cr durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con ⁵¹Cr. È inoltre necessario un contatore Geiger dotato di una sonda per pancake, per sorvegliare lo spazio per possibili contaminazioni.
14. Aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo al tubo per indicare che il tubo è ora radioattivo.
15. Posizionare il tubo in un incubatore a 37°C con uno scudo di piombo e incubare per 1 ora. Far scorrere il tubo ogni 15-20 minuti per aumentare l'assorbimento del cromo da parte delle cellule bersaglio.
16. Dopo il periodo di incubazione, lavare le cellule bersaglio con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali ⁵¹Cr in eccesso.
17. Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min. Decantare FBS radioattivo lavare in un contenitore di rifiuti appropriato.
18. Risuspenare il pellet e lavare una seconda volta con FBS. Controllare la radioattività incorporata nel pellet utilizzando un contatore Geiger.
19. Ripresa del pellet in 10 mL di terreno completo, ottenendo una concentrazione cellulare di 10⁵ celle/mL.
    Nota: La fase di conteggio delle celle dopo l'etichettatura ⁵¹Cr viene omessa qui in gran parte per motivi di sicurezza. Si può presumere che la concentrazione cellulare WM793 sia la stessa che era prima dell'etichettatura ⁵¹Cr.

2. Preparazione delle cellule emotrici

1. È possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici, come le cellule T umane o di topo e le cellule NK. In questo esempio, sono stati utilizzati PBMC, isolati dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard (fino a una concentrazione di 5x10^6).
2. Per iniziare, aggiungere 100 μL di terreno di coltura tissutale a ciascun pozzetti di una delle file (qui riga A, vedi Tabella 1) di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Qui, non vengono aggiunte cellule emotrici e serviranno come "vuoto" per determinare il "rilascio minimo / spontaneo ^{di 51}Cr" dalle cellule bersaglio.

Tabella 1: ⁵¹Layout del saggio di rilascio Cr: riga A- Cellule bersaglio (10⁴ celle / 100 μL) incubate solo con supporti (genera "vuoto" per determinare il "rilascio minimo/spontaneo ^{di 51}Cr"). Righe da B a C- pozzi contenenti diversi rapporti effettore:cellule bersaglio (E:T), che vanno da 50:1 a 1,5:1. Riga H- cellule bersaglio (10⁴ cellule/100 μL) incubate con l'1% np-40 (NP-40 lisi le cellule bersaglio, generando "rilascio massimo o totale ^{di 51}Cr"). Ogni rapporto E:T viene testato in triplice copia per ogni condizione sperimentale. Colonna 1-3- PBMC non stimolati e COLONNA 4-6- PBMC stimolati da CpG.

3. Successivamente, generare una diluizione seriale di cellule 2X dei PBMC (in triplice copia per ogni condizione sperimentale), per ottenere una concentrazione di cellule emotrici che va da 5x10⁵ a 15.625 celle / 100 μL di media (qui righe da B a G).
   Nota: In questo esempio, il rapporto effettore iniziale: cella target (E: T) è 50:1. Tuttavia, questo rapporto può essere regolato in base alle specifiche sperimentali.
4. Lasciare vuota l'ultima riga (qui riga H) non aggiungendo alcuna celle effettore a questi pozzi. (Questa riga verrà utilizzata per generare il "conteggio totale/min, o (c. p.m)" o il "massimo ⁵¹Cr release").
5. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37°C fino a quando le cellule bersaglio non sono pronte per essere aggiunte.

3. Aggiunta di ⁵¹cellule bersaglio WM793 etichettate Cr al test

1. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall'incubatrice e lavare con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali ⁵¹Cr in eccesso.
2. Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min, utilizzando una centrifuga designata.
3. Rimuovere il lavaggio FBS (surnatante radioattivo) in un contenitore di rifiuti appropriato.
4. Ripetere la fase di lavaggio risussoso il pellet in un fresco 5 ml di FBS.
5. Centrifugare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 min.
6. Infine, risusedipere il pellet in 10 ml di mezzo completo.
7. Versare la sospensione di celle WM793 marcata ⁵¹Cr (10⁵ celle/ml) in un serbatoio di reagente monouso.
8. Quindi, aggiungere 100 μL di queste cellule bersaglio etichettate, a ciascun pozzetti della piastra cellulare effettore a 96 pozzetti, usando una pipetta multicanale.
9. Quindi, aggiungere 100 μL di NP-40 all'1% (in acqua) alla fila di pozzi privi di cellule emotrici (qui riga H). L'1% np-40 solcherà le cellule bersaglio, e quindi questi pozzi serviranno come controlli per determinare il "conteggio totale / min, o (c. p.m)" o il rilascio massimo di ⁵¹Cr.
10. Fissare il coperchio alla piastra aggiungendo un piccolo pezzo di nastro permeabile al gas su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene ⁵¹Cr.
11. In breve, centrifugare la piastra a 1200 giri / min. Se viene utilizzata una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga.
    Nota: È importante utilizzare una centrifuga contrassegnata per gestire campioni radioattivi.
12. Rimuovere la piastra dalla centrifuga.
13. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 ° C con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sulla piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire la lisi delle cellule bersaglio.
    Nota: Il periodo di incubazione può variare da 4 a 18 ore a seconda delle cellule emotrici utilizzate e del potenziale meccanismo di uccisione impiegato.

4. Raccolta dei Supernatanti

1. Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere con attenzione il nastro attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio.
2. Quindi, posizionare il telaio di raccolta sul piatto, assicurandosi di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ciò garantirà la raccolta di un surnatante privo di cellule.
3. Ora, premere lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzi.
4. Dopo circa 10 secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone e quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo.
5. Posizionare ciascuno di questi tubi in un tubo FACS secondario.
6. Infine, caricare i tubi FACS sul contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di ⁵¹Cr rilasciati in ciascuna condizione. I campioni vengono in genere misurati per 1 minuto, consentendo una facile determinazione dei "conteggi / minuto".
7. Registrare con attenzione l'ordine in cui i tubi sono stati caricati nel contatore.

5. Analisi dei dati

1. Qui, i PBMC non stimolati sono stati aggiunti alle prime tre colonne e i PBMC stimolati da CpG (CpG ODN, (1 μg / mL) per 24 h) sono stati aggiunti alle colonne 4-6. Cfr. tabella 2.

Tabella 2: ⁵¹Dati del saggio di rilascio cr: Valori dei dati 'Counts per minute' / 'c. p.m', valori medi c. p.m e valori di lisi specifici della percentuale calcolata.

2. I dati raccolti (conteggi al minuto, cioè .c.p.m) sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale.
3. In primo luogo, sono state calcolate le medie dei triplicati. Tabella 2 - cellule da I3 a P3, per PBMC non stimolati e cellule da I6 a P6, per PBMC stimolati da CpG.
4. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione è stata calcolata utilizzando la seguente formula:
   
   
5. La percentuale di lisi specifica è stata calcolata per ogni condizione (Tabella 2 - cellule da J4 a O4, per PBMC non stimolati e da J7 a O7, per PBMC non stimolati).

In questo video osserverai come eseguire il saggio di rilascio del cromo e determinare il potenziale citotossico delle cellule effettrici.

Le cellule immunitarie sono responsabili dell'identificazione e della rimozione di cellule potenzialmente dannose, come il cancro o le cellule infettate da virus, dal corpo, che è parte integrante della risposta immunitaria. Diverse cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK, possiedono una proprietà nota come potenziale citotossico, che è la capacità di identificare le cellule bersaglio e secernere proteine che inducono la degradazione, la lisi e la morte delle proteine di tali cellule bersaglio. La quantificazione del potenziale citotossico è fondamentale per misurare l'attivazione e la potenza delle cellule immunitarie e il test di rilascio del cromo è comunemente utilizzato per questo scopo.

Questo metodo consente agli utenti di confrontare la citossicità indotta da specifici tipi di cellule immunitarie in condizioni diverse, il che è prezioso per studiare l'immunoterapia del cancro e le malattie correlate all'immunità. Per cominciare, le cellule bersaglio, come le cellule tumorali, vengono incubate con un isotopo radioattivo, il cromo 51, che viene assorbito dalle cellule. Successivamente, queste cellule radiomarcate vengono co-coltivate con le cellule immunitarie isolate di interesse, chiamate anche cellule effettrici, in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti per facilitare l'interazione tra i due tipi di cellule.

La configurazione generale del test prevede l'incubazione di un numero specifico di cellule bersaglio con diverse concentrazioni di cellule immunitarie, insieme a controlli appropriati. La co-coltura consente alle cellule effettrici di indurre l'apoptosi e la lisi nelle cellule bersaglio, con conseguente rilascio del cromo 51 intracellulare nel surnatante. Quindi, in un momento pre-ottimizzato, il surnatante contenente il cromo rilasciato viene raccolto da tutti i pozzi. Il cromo 51, essendo radioattivo, subisce spontaneamente un decadimento radioattivo per emettere radiazioni gamma. I livelli di radiazione gamma nei surnatanti provenienti da tutti i pozzetti della piastra di saggio rappresentano un output quantificabile della lisi delle cellule bersaglio. Questo viene misurato utilizzando un contatore gamma, che viene poi utilizzato per determinare il potenziale citotossico delle cellule immunitarie.

Per iniziare, le cellule bersaglio, la linea cellulare di melanoma umano WM793 in questo esempio, vengono preparate in una sospensione di una singola cellula. Per fare ciò, rimuovere prima il terreno dal pallone di coltura tissutale e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS 1X. Decantare il PBS e poi aggiungere un millilitro di tripsina alla piastra per circa due minuti. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare le celle dalla superficie del pallone, quindi aggiungere cinque millilitri di terreno RPMI al pallone. Pipettare il terreno su e giù per raccogliere le cellule e aggiungere questa sospensione a una provetta conica da 15 millilitri.

Mettere la provetta nella centrifuga per cinque minuti a 1200 giri/min. Quindi, rimuovere il supporto dal tubo assicurandosi di non rompere il pellet della cella. Muovere delicatamente il fondo della provetta per rompere il pellet cellulare e aggiungere 10 millilitri di terreno alla provetta. Quindi, pipettare delicatamente il terreno su e giù per portare le cellule in sospensione. Successivamente, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire due millilitri della sospensione cellulare originale in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Mettere la provetta in una centrifuga e pellettare le celle a 12 cento giri/min per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, versare il terreno in eccesso dalla provetta in un contenitore per rifiuti. Agitare brevemente il tubo per risospendere il pellet di cella nel piccolo volume di terreno rimasto.

Successivamente, preparati a utilizzare il cromo 51 spostandoti in uno spazio di laboratorio dedicato a questa particolare radioattività. Dovrebbe esserci un'ampia schermatura in piombo per la conservazione e l'uso sicuri del cromo 51 durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con cromo 51. E' inoltre necessario un contatore Geiger dotato di sonda pancake per servire nello spazio per eventuali contaminazioni.

Una volta impostato per l'uso corretto della radioattività, aggiungere 100 microcurie di cromo 51 direttamente alla sospensione della cellula target. Quindi, aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo alla provetta per indicare che il campione e la provetta sono ora radioattivi. Posizionare la provetta in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con uno schermo di piombo e incubare per un'ora, muovendo la provetta ogni 15-20 minuti.

Mentre le cellule bersaglio stanno etichettando, preparare una sospensione a cellula singola di cellule effettrici. In questo esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico umano, o PDMC, sono state isolate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard a una concentrazione di 5 volte 10 alla 6a. Trasferire questa sospensione di cellule effettrici in un serbatoio di reagenti monouso e quindi aggiungere 200 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto della fila B in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di RPMI a ciascun pozzetto nella fila da C a G della piastra.

Ora, inizia a eseguire diluizioni seriali delle PBMC per avere un intervallo di numeri di cellule effettrici rimuovendo prima 100 microlitri di cellule nei pozzetti nella riga B e aggiungendoli alla riga C. Quindi, diluire ulteriormente le cellule effettrici trasferendo 100 microlitri di cellule dalla fila C alla fila D. Continuare la diluizione seriale. Una volta raggiunta la fila G, spostare 100 microlitri dai pozzetti per lasciare un volume finale di 100 microlitri in ogni pozzetto di quella fila. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura tissutale ai pozzetti della fila A per fungere da controllo per il rilascio spontaneo di cromo 51 dalle cellule bersaglio, poiché non devono essere aggiunte cellule effettrici a questa fila. Quindi, posizionare una piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule target non sono pronte per essere aggiunte.

Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall'incubatrice e lavare con 5 millilitri di FBS per rimuovere l'eccesso di Cromo 51. Quindi, posizionare la provetta in una centrifuga designata e centrifugare a 1200 giri/min per 5 minuti. Rimuovere il lavaggio FBS radioattivo in un contenitore di rifiuti appropriato e ripetere la fase di lavaggio rimettendo il pellet in 5 millilitri di FBS freschi. Posizionare la provetta in una centrifuga designata e far girare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 minuti. Rimuovere il secondo lavaggio e controllare la radioattività incorporata del pellet utilizzando un contatore Geiger. Infine, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno completo e versare la sospensione di cellule bersaglio marcata con cromo 51 in un serbatoio di reagenti monouso. Quindi, aggiungere 100 microlitri di queste cellule bersaglio marcate a ogni pozzetto della piastra cellulare effettrice a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di NP-40 all'1% in acqua ai pozzetti della fila H per lisare tutte le cellule bersaglio in ogni fila. Questi pozzetti verranno utilizzati come controllo per determinare i conteggi totali al minuto, o cpm.

Ora che la piastra è pronta, fissare il coperchio aggiungendo un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene cromo 51. Quindi, posizionare la piastra in una centrifuga contrassegnata per la manipolazione di campioni radioattivi. Se si utilizza una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga. Impostare la centrifuga a 1200 giri/min e portare la piastra alla velocità. Una volta raggiunta la velocità, arrestare la macchina. Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Quindi, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sopra la piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire alle cellule bersaglio di lisarsi.

Al termine del periodo di incubazione, rimuovere con cautela il nastro adesivo attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio. Quindi, posiziona il telaio di raccolta sulla piastra assicurandoti di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ora, premi lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzetti. Dopo circa dieci secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone, quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo. Posizionare ciascuna di queste provette in una provetta FACS secondaria. Infine, caricare le provette FACS su un contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di cromo 51 rilasciata in ciascuna condizione. Registrare attentamente l'ordine in cui i tubi sono stati caricati nel bancone.

Qui, le PBMC non stimolate sono state aggiunte alle prime 3 corsie e le PMBC stimolate CPG sono state aggiunte alle corsie da 4 a 6. In questo esempio, i conteggi al minuto sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale e sono state calcolate le medie dei triplicati. Ad esempio, per la prima condizione, le celle A1, A2 e A3 sono state mediate nella cella I3. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione può essere calcolata utilizzando questa formula. Ad esempio, per calcolare la percentuale di lisi specifica per le cellule non stimolate che avevano un rapporto di 50 a 1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio, il CPM spontaneo, che in questo esempio è 1164,67, è stato sottratto dal CPM sperimentale, 1129. 67. Questo numero può quindi essere diviso per la differenza tra il CPM massimo e il CPM spontaneo, e quindi moltiplicato per 100 per ottenere la percentuale di lisi specifica. Questo viene quindi calcolato per ogni condizione. Questi dati possono quindi essere rappresentati graficamente per mostrare il confronto del rapporto E/T con la percentuale di lisi specifica sia per le PBMC non stimolate che per le PBMC stimolate CPG. In questo esempio, le cellule effettrici stimolate con CPG hanno ucciso più efficacemente le cellule bersaglio all'aumentare del rapporto tra cellule effettrici e cellule bersaglio. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate, indicando che la stimolazione CPG è necessaria per l'aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.