Saggio per la morte cellulare: saggio di rilascio di cromo della capacità citotossica

In questo video osserverai come eseguire il saggio di rilascio del cromo e determinare il potenziale citotossico delle cellule effettrici.

Le cellule immunitarie sono responsabili dell'identificazione e della rimozione di cellule potenzialmente dannose, come il cancro o le cellule infettate da virus, dal corpo, che è parte integrante della risposta immunitaria. Diverse cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK, possiedono una proprietà nota come potenziale citotossico, che è la capacità di identificare le cellule bersaglio e secernere proteine che inducono la degradazione, la lisi e la morte delle proteine di tali cellule bersaglio. La quantificazione del potenziale citotossico è fondamentale per misurare l'attivazione e la potenza delle cellule immunitarie e il test di rilascio del cromo è comunemente utilizzato per questo scopo.

Questo metodo consente agli utenti di confrontare la citossicità indotta da specifici tipi di cellule immunitarie in condizioni diverse, il che è prezioso per studiare l'immunoterapia del cancro e le malattie correlate all'immunità. Per cominciare, le cellule bersaglio, come le cellule tumorali, vengono incubate con un isotopo radioattivo, il cromo 51, che viene assorbito dalle cellule. Successivamente, queste cellule radiomarcate vengono co-coltivate con le cellule immunitarie isolate di interesse, chiamate anche cellule effettrici, in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti per facilitare l'interazione tra i due tipi di cellule.

La configurazione generale del test prevede l'incubazione di un numero specifico di cellule bersaglio con diverse concentrazioni di cellule immunitarie, insieme a controlli appropriati. La co-coltura consente alle cellule effettrici di indurre l'apoptosi e la lisi nelle cellule bersaglio, con conseguente rilascio del cromo 51 intracellulare nel surnatante. Quindi, in un momento pre-ottimizzato, il surnatante contenente il cromo rilasciato viene raccolto da tutti i pozzi. Il cromo 51, essendo radioattivo, subisce spontaneamente un decadimento radioattivo per emettere radiazioni gamma. I livelli di radiazione gamma nei surnatanti provenienti da tutti i pozzetti della piastra di saggio rappresentano un output quantificabile della lisi delle cellule bersaglio. Questo viene misurato utilizzando un contatore gamma, che viene poi utilizzato per determinare il potenziale citotossico delle cellule immunitarie.

Per iniziare, le cellule bersaglio, la linea cellulare di melanoma umano WM793 in questo esempio, vengono preparate in una sospensione di una singola cellula. Per fare ciò, rimuovere prima il terreno dal pallone di coltura tissutale e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS 1X. Decantare il PBS e poi aggiungere un millilitro di tripsina alla piastra per circa due minuti. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare le celle dalla superficie del pallone, quindi aggiungere cinque millilitri di terreno RPMI al pallone. Pipettare il terreno su e giù per raccogliere le cellule e aggiungere questa sospensione a una provetta conica da 15 millilitri.

Mettere la provetta nella centrifuga per cinque minuti a 1200 giri/min. Quindi, rimuovere il supporto dal tubo assicurandosi di non rompere il pellet della cella. Muovere delicatamente il fondo della provetta per rompere il pellet cellulare e aggiungere 10 millilitri di terreno alla provetta. Quindi, pipettare delicatamente il terreno su e giù per portare le cellule in sospensione. Successivamente, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire due millilitri della sospensione cellulare originale in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Mettere la provetta in una centrifuga e pellettare le celle a 12 cento giri/min per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, versare il terreno in eccesso dalla provetta in un contenitore per rifiuti. Agitare brevemente il tubo per risospendere il pellet di cella nel piccolo volume di terreno rimasto.

Successivamente, preparati a utilizzare il cromo 51 spostandoti in uno spazio di laboratorio dedicato a questa particolare radioattività. Dovrebbe esserci un'ampia schermatura in piombo per la conservazione e l'uso sicuri del cromo 51 durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con cromo 51. E' inoltre necessario un contatore Geiger dotato di sonda pancake per servire nello spazio per eventuali contaminazioni.

Una volta impostato per l'uso corretto della radioattività, aggiungere 100 microcurie di cromo 51 direttamente alla sospensione della cellula target. Quindi, aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo alla provetta per indicare che il campione e la provetta sono ora radioattivi. Posizionare la provetta in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con uno schermo di piombo e incubare per un'ora, muovendo la provetta ogni 15-20 minuti.

Mentre le cellule bersaglio stanno etichettando, preparare una sospensione a cellula singola di cellule effettrici. In questo esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico umano, o PDMC, sono state isolate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard a una concentrazione di 5 volte 10 alla 6a. Trasferire questa sospensione di cellule effettrici in un serbatoio di reagenti monouso e quindi aggiungere 200 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto della fila B in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di RPMI a ciascun pozzetto nella fila da C a G della piastra.

Ora, inizia a eseguire diluizioni seriali delle PBMC per avere un intervallo di numeri di cellule effettrici rimuovendo prima 100 microlitri di cellule nei pozzetti nella riga B e aggiungendoli alla riga C. Quindi, diluire ulteriormente le cellule effettrici trasferendo 100 microlitri di cellule dalla fila C alla fila D. Continuare la diluizione seriale. Una volta raggiunta la fila G, spostare 100 microlitri dai pozzetti per lasciare un volume finale di 100 microlitri in ogni pozzetto di quella fila. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura tissutale ai pozzetti della fila A per fungere da controllo per il rilascio spontaneo di cromo 51 dalle cellule bersaglio, poiché non devono essere aggiunte cellule effettrici a questa fila. Quindi, posizionare una piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule target non sono pronte per essere aggiunte.

Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall'incubatrice e lavare con 5 millilitri di FBS per rimuovere l'eccesso di Cromo 51. Quindi, posizionare la provetta in una centrifuga designata e centrifugare a 1200 giri/min per 5 minuti. Rimuovere il lavaggio FBS radioattivo in un contenitore di rifiuti appropriato e ripetere la fase di lavaggio rimettendo il pellet in 5 millilitri di FBS freschi. Posizionare la provetta in una centrifuga designata e far girare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 minuti. Rimuovere il secondo lavaggio e controllare la radioattività incorporata del pellet utilizzando un contatore Geiger. Infine, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno completo e versare la sospensione di cellule bersaglio marcata con cromo 51 in un serbatoio di reagenti monouso. Quindi, aggiungere 100 microlitri di queste cellule bersaglio marcate a ogni pozzetto della piastra cellulare effettrice a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di NP-40 all'1% in acqua ai pozzetti della fila H per lisare tutte le cellule bersaglio in ogni fila. Questi pozzetti verranno utilizzati come controllo per determinare i conteggi totali al minuto, o cpm.

Ora che la piastra è pronta, fissare il coperchio aggiungendo un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene cromo 51. Quindi, posizionare la piastra in una centrifuga contrassegnata per la manipolazione di campioni radioattivi. Se si utilizza una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga. Impostare la centrifuga a 1200 giri/min e portare la piastra alla velocità. Una volta raggiunta la velocità, arrestare la macchina. Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Quindi, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sopra la piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire alle cellule bersaglio di lisarsi.

Al termine del periodo di incubazione, rimuovere con cautela il nastro adesivo attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio. Quindi, posiziona il telaio di raccolta sulla piastra assicurandoti di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ora, premi lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzetti. Dopo circa dieci secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone, quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo. Posizionare ciascuna di queste provette in una provetta FACS secondaria. Infine, caricare le provette FACS su un contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di cromo 51 rilasciata in ciascuna condizione. Registrare attentamente l'ordine in cui i tubi sono stati caricati nel bancone.

Qui, le PBMC non stimolate sono state aggiunte alle prime 3 corsie e le PMBC stimolate CPG sono state aggiunte alle corsie da 4 a 6. In questo esempio, i conteggi al minuto sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale e sono state calcolate le medie dei triplicati. Ad esempio, per la prima condizione, le celle A1, A2 e A3 sono state mediate nella cella I3. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione può essere calcolata utilizzando questa formula. Ad esempio, per calcolare la percentuale di lisi specifica per le cellule non stimolate che avevano un rapporto di 50 a 1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio, il CPM spontaneo, che in questo esempio è 1164,67, è stato sottratto dal CPM sperimentale, 1129. 67. Questo numero può quindi essere diviso per la differenza tra il CPM massimo e il CPM spontaneo, e quindi moltiplicato per 100 per ottenere la percentuale di lisi specifica. Questo viene quindi calcolato per ogni condizione. Questi dati possono quindi essere rappresentati graficamente per mostrare il confronto del rapporto E/T con la percentuale di lisi specifica sia per le PBMC non stimolate che per le PBMC stimolate CPG. In questo esempio, le cellule effettrici stimolate con CPG hanno ucciso più efficacemente le cellule bersaglio all'aumentare del rapporto tra cellule effettrici e cellule bersaglio. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate, indicando che la stimolazione CPG è necessaria per l'aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.