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Saggio per la morte cellulare: saggio di rilascio di cromo della capacità citotossica

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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11:48 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Una delle funzioni principali delle cellule del sistema immunitario è quella di rimuovere le cellule bersaglio che sono state infettate da virus o hanno subito la trasformazione in una cellula tumorale. I saggi in vitro per misurare la capacità citotossica delle cellule immunitarie sono stati un punto fermo nei laboratori per molti anni. Questi saggi sono stati utilizzati per determinare la capacità delle cellule T, delle cellule NK o di qualsiasi altra cellula immunitaria di uccidere le cellule bersaglio in modo antigene-specifico o non specifico. I ligandi di morte (ad esempio, ligando fas o TRAIL), le citochine (ad esempio, IFNg o TNF) o i granuli citotossici (ad esempio, perforina / granzima B) espressi dalle cellule emotrici sono alcuni modi in cui la morte delle cellule bersaglio può essere indotta. Con l’esplosione della ricerca sull’immunoterapia tumorale negli ultimi anni, c’è un crescente interesse nella ricerca di agenti per aumentare l’attività citotossica delle cellule immunitarie per migliorare i risultati dei pazienti. Al contrario, alcune malattie sono caratterizzate dall’attività esuberante dell’attività citotossica delle cellule immunitarie, con conseguenti sforzi per identificare gli agenti per temperare queste risposte. Pertanto, avere un test in cui l’utente può facilmente integrare qualsiasi numero di diverse cellule emotrici, cellule bersaglio e / o modificatori di risposta nel progetto sperimentale può servire come mezzo prezioso per valutare rapidamente la capacità citotossica delle cellule emotrici e / o la reattività della cellula bersaglio.

Questi saggi in vitro comportano la miscelazione di diverse popolazioni cellulari, oltre a utilizzare un numero relativamente basso di cellule emotrici e bersaglio. Pertanto, una necessità del test è quella di etichettare le cellule bersaglio in un modo che possa essere facilmente rilevato e quantizzato, consentendo all’utente di determinare quindi la “lisi specifica percentuale” mediata dalle cellule emotrici. La radioattività – in particolare, il cromo 51 (⁵¹Cr) sotto forma di Na₂⁵¹CrO₄– è un modo economico per etichettare rapidamente e in modo non specifico le proteine cellulari all’interno delle cellule bersaglio (1). La breve etichettatura e i tempi totali del test riducono il potenziale di cambiamenti significativi nel numero e/o nel fenotipo delle cellule bersaglio, che potrebbero influenzare l’esito del test. Dopo la perdita dell’integrità della membrana delle cellule bersaglio a causa dell’attività citotossica delle cellule emotrici, le ⁵¹proteine cellulari marcate con Cr all’interno delle cellule bersaglio vengono rilasciate nel surnatante di coltura, diventando disponibili per la quantificazione. Come con qualsiasi test che esamina la funzione delle cellule immunitarie in vitro, ci sono una serie di considerazioni importanti da considerare per migliorare le prestazioni dell’esperimento. Una delle caratteristiche più critiche è quella di utilizzare cellule emocromatrici sane (per la massima attività citotossica) e target (per la massima reattività e la minima morte spontanea /^{rilascio di 51}Cr). È necessario il contatto tra effettore e cellula bersaglio (che porta all’uso comune di piastre a 96 pozzi a fondo tondo per incoraggiare il contatto cellula-cellula) (2). Infine, l’analisi dei dati dipende dall’inclusione di popolazioni di cellule bersaglio di controllo positive e negative.

Il seguente protocollo delineerà i passaggi per l’esecuzione di un test standard di rilascio ^{di 51}Cr per misurare la capacità citotossica di una popolazione di cellule emotrici, sebbene sia stata recentemente sviluppata una versione non radiativa che utilizza Europium. ^{51 anni} Cr è un potente emettitore di radiazioni γ. Di conseguenza, l’uso di questo test richiede un’adeguata formazione sulla sicurezza delle radiazioni, uno spazio di laboratorio dedicato, un contatore gamma e lo smaltimento di campioni radioattivi.

La sequenza generale degli eventi in questo test sono: 1) preparare ⁵¹bersagli etichettati con Cr; 2) preparare le cellule emotrici e aggiungerle alla piastra mentre le cellule bersaglio sono etichettate; 3) aggiungere bersagli etichettati alla piastra; 4) piastra di incubazione; 5) raccogliere supernatanti; e 6) analizzare i dati dopo aver eseguito i campioni sul contatore. I campioni sono comunemente preparati in triplice copia e quindi mediati per tenere conto di eventuali sottili differenze di pipettaggio.

Un DPI adeguato è importante per questo test. In particolare, l’utente deve indossare un camice da laboratorio e guanti. Gli occhiali di sicurezza possono essere richiesti in base al laboratorio o all’istituzione. Ci dovrebbe essere un’ampia schermatura al piombo per la conservazione sicura e l’uso del ⁵¹Cr durante tutte le fasi. Infine, ci dovrebbero essere spazi di laboratorio dedicati e attrezzature riservate all’utilizzo di ⁵¹Cr, compresa tutta la segnaletica appropriata per indicare dove vengono conservati i campioni con ⁵¹Cr e un contatore Geiger dotato di sonda gamma per esaminare lo spazio per possibili contaminazioni.

In questo esercizio di laboratorio, determineremo la capacità delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) (CpG stimolate vs. non stimolate) di uccidere le cellule di melanoma, utilizzando la linea cellulare del melanoma umano WM793 come modello e il test di rilascio del cromo.

Procedure

Panoramica della procedura

Il tipico test ⁵¹Cr-release per misurare la morte cellulare prevede i seguenti passaggi:

Innanzitutto, le cellule bersaglio sono etichettate con Na₂[⁵¹Cr]O₄. Questo li distingue dalle cellule emotrici nel test.
Mentre le cellule bersaglio vengono etichettate, le cellule emotrici vengono raccolte e, utilizzando la tecnica di diluizione seriale, viene generata una titolazione decrescente delle cellule emotrici in una piastra di saggio a fondo rotondo da 96 pozzetti.
Alla fine dell’etichettatura della cellula bersaglio, le cellule vengono prima lavate e quindi un numero fisso di cellule viene aggiunto alla piastra di dosaggio che contiene già una serie di diluizioni di cellule emotrici.
Successivamente, la miscela cellulare bersaglio-effettore viene incubata per un periodo di tempo definito per consentire una sufficiente interazione cellulare con le cellule bersaglio, per mediare la lisi cellulare.
Infine, i supernatanti di coltura vengono raccolti e raccolti in tubi. La quantità di ⁵¹Cr viene quantificata utilizzando un contatore gamma.
Alla fine, i dati vengono raccolti e utilizzati per calcolare la “percentuale specifica di lisi cellulare” delle cellule bersaglio.

1. Etichettatura delle cellule target con ⁵¹Cr

Per iniziare, preparare le cellule bersaglio, (qui- linea cellulare di melanoma umano WM793), in una sospensione a singola cellula.
Per fare ciò, rimuovere prima il mezzo dal pallone di coltura del tessuto.
Quindi, lavare le cellule con 5 ml di 1X PBS.
Tripsinizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina alla piastra per ~ 2 min.
Picchiettare delicatamente il matraccio per allentare le celle dalla superficie del pallone.
Aggiungere 5 mL di supporti RPMI al pallone e pipettare il supporto su e giù per staccare le celle.
Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 1200 giri/min. Decantare il surnatante.
Aggiungere 10 ml di media al pellet e pipettare delicatamente il supporto su e giù per portare le celle in sospensione.
Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
Trasferire 1×10⁶ celle in un nuovo tubo conico da 15 mL.
Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1200 giri/min e decantare il surnatante.
Vortice brevemente il tubo per risusciere il pellet cellulare nel piccolo volume di mezzo lasciato indietro.
Aggiungere 100 μCi di ⁵¹Cr direttamente alla sospensione della cella target WM793.
Nota: Ci dovrebbe essere uno spazio di laboratorio dedicato allestito per la particolare radioattività. Inoltre, ci dovrebbe essere un’ampia schermatura al piombo per la conservazione e l’uso sicuri del ⁵¹Cr durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con ⁵¹Cr. È inoltre necessario un contatore Geiger dotato di una sonda per pancake, per sorvegliare lo spazio per possibili contaminazioni.
Aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo al tubo per indicare che il tubo è ora radioattivo.
Posizionare il tubo in un incubatore a 37°C con uno scudo di piombo e incubare per 1 ora. Far scorrere il tubo ogni 15-20 minuti per aumentare l’assorbimento del cromo da parte delle cellule bersaglio.
Dopo il periodo di incubazione, lavare le cellule bersaglio con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali ⁵¹Cr in eccesso.
Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min. Decantare FBS radioattivo lavare in un contenitore di rifiuti appropriato.
Risuspenare il pellet e lavare una seconda volta con FBS. Controllare la radioattività incorporata nel pellet utilizzando un contatore Geiger.
Ripresa del pellet in 10 mL di terreno completo, ottenendo una concentrazione cellulare di 10⁵ celle/mL.
Nota: La fase di conteggio delle celle dopo l’etichettatura ⁵¹Cr viene omessa qui in gran parte per motivi di sicurezza. Si può presumere che la concentrazione cellulare WM793 sia la stessa che era prima dell’etichettatura ⁵¹Cr.

2. Preparazione delle cellule emotrici

È possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici, come le cellule T umane o di topo e le cellule NK. In questo esempio, sono stati utilizzati PBMC, isolati dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard (fino a una concentrazione di 5×10^6).
Per iniziare, aggiungere 100 μL di terreno di coltura tissutale a ciascun pozzetti di una delle file (qui riga A, vedi Tabella 1) di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Qui, non vengono aggiunte cellule emotrici e serviranno come “vuoto” per determinare il “rilascio minimo / spontaneo ^{di 51}Cr” dalle cellule bersaglio.

Tabella 1: ⁵¹Layout del saggio di rilascio Cr: riga A- Cellule bersaglio (10⁴ celle / 100 μL) incubate solo con supporti (genera “vuoto” per determinare il “rilascio minimo/spontaneo ^{di 51}Cr”). Righe da B a C- pozzi contenenti diversi rapporti effettore:cellule bersaglio (E:T), che vanno da 50:1 a 1,5:1. Riga H- cellule bersaglio (10⁴ cellule/100 μL) incubate con l’1% np-40 (NP-40 lisi le cellule bersaglio, generando “rilascio massimo o totale ^{di 51}Cr”). Ogni rapporto E:T viene testato in triplice copia per ogni condizione sperimentale. Colonna 1-3- PBMC non stimolati e COLONNA 4-6- PBMC stimolati da CpG.

Successivamente, generare una diluizione seriale di cellule 2X dei PBMC (in triplice copia per ogni condizione sperimentale), per ottenere una concentrazione di cellule emotrici che va da 5×10⁵ a 15.625 celle / 100 μL di media (qui righe da B a G).
Nota: In questo esempio, il rapporto effettore iniziale: cella target (E: T) è 50:1. Tuttavia, questo rapporto può essere regolato in base alle specifiche sperimentali.
Lasciare vuota l’ultima riga (qui riga H) non aggiungendo alcuna celle effettore a questi pozzi. (Questa riga verrà utilizzata per generare il “conteggio totale/min, o (c. p.m)” o il “massimo ⁵¹Cr release”).
Posizionare la piastra in un’incubatrice a 37°C fino a quando le cellule bersaglio non sono pronte per essere aggiunte.

3. Aggiunta di ⁵¹cellule bersaglio WM793 etichettate Cr al test

Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall’incubatrice e lavare con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali ⁵¹Cr in eccesso.
Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min, utilizzando una centrifuga designata.
Rimuovere il lavaggio FBS (surnatante radioattivo) in un contenitore di rifiuti appropriato.
Ripetere la fase di lavaggio risussoso il pellet in un fresco 5 ml di FBS.
Centrifugare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 min.
Infine, risusedipere il pellet in 10 ml di mezzo completo.
Versare la sospensione di celle WM793 marcata ⁵¹Cr (10⁵ celle/ml) in un serbatoio di reagente monouso.
Quindi, aggiungere 100 μL di queste cellule bersaglio etichettate, a ciascun pozzetti della piastra cellulare effettore a 96 pozzetti, usando una pipetta multicanale.
Quindi, aggiungere 100 μL di NP-40 all’1% (in acqua) alla fila di pozzi privi di cellule emotrici (qui riga H). L’1% np-40 solcherà le cellule bersaglio, e quindi questi pozzi serviranno come controlli per determinare il “conteggio totale / min, o (c. p.m)” o il rilascio massimo di ⁵¹Cr.
Fissare il coperchio alla piastra aggiungendo un piccolo pezzo di nastro permeabile al gas su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene ⁵¹Cr.
In breve, centrifugare la piastra a 1200 giri / min. Se viene utilizzata una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga.
Nota: È importante utilizzare una centrifuga contrassegnata per gestire campioni radioattivi.
Rimuovere la piastra dalla centrifuga.
Posizionare la piastra in un’incubatrice a 37 ° C con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sulla piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire la lisi delle cellule bersaglio.
Nota: Il periodo di incubazione può variare da 4 a 18 ore a seconda delle cellule emotrici utilizzate e del potenziale meccanismo di uccisione impiegato.

4. Raccolta dei Supernatanti

Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere con attenzione il nastro attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio.
Quindi, posizionare il telaio di raccolta sul piatto, assicurandosi di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ciò garantirà la raccolta di un surnatante privo di cellule.
Ora, premere lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzi.
Dopo circa 10 secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone e quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo.
Posizionare ciascuno di questi tubi in un tubo FACS secondario.
Infine, caricare i tubi FACS sul contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di ⁵¹Cr rilasciati in ciascuna condizione. I campioni vengono in genere misurati per 1 minuto, consentendo una facile determinazione dei “conteggi / minuto”.
Registrare con attenzione l’ordine in cui i tubi sono stati caricati nel contatore.

5. Analisi dei dati

Qui, i PBMC non stimolati sono stati aggiunti alle prime tre colonne e i PBMC stimolati da CpG (CpG ODN, (1 μg / mL) per 24 h) sono stati aggiunti alle colonne 4-6. Cfr. tabella 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
Un	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Io	Media di A1,A2,A3 ->		1164.67	C.p.m spontaneo		1058.33
J	Media di B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
Okay	Media di C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Media di D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Media di E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Media di F1,F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Media di G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Media di H1,H2,H3 ->		8884.67	Massimo c.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Rapporto E:T

Tabella 2: ⁵¹Dati del saggio di rilascio cr: Valori dei dati ‘Counts per minute’ / ‘c. p.m’, valori medi c. p.m e valori di lisi specifici della percentuale calcolata.

I dati raccolti (conteggi al minuto, cioè .c.p.m) sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale.
In primo luogo, sono state calcolate le medie dei triplicati. Tabella 2 – cellule da I3 a P3, per PBMC non stimolati e cellule da I6 a P6, per PBMC stimolati da CpG.
Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione è stata calcolata utilizzando la seguente formula:
La percentuale di lisi specifica è stata calcolata per ogni condizione (Tabella 2 – cellule da J4 a O4, per PBMC non stimolati e da J7 a O7, per PBMC non stimolati).

In questo video osserverai come eseguire il test di rilascio del cromo e determinare il potenziale citotossico delle cellule emotrici.

Le cellule immunitarie sono responsabili dell’identificazione e della rimozione di cellule potenzialmente dannose, come il cancro o le cellule infette da virus, dal corpo, che è parte integrante della risposta immunitaria. Diverse cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK, possiedono una proprietà nota come potenziale citotossico, che è la capacità di identificare le cellule bersaglio e secernere proteine che inducono la degradazione delle proteine, la lisi e la morte di quelle cellule bersaglio. Quantificare il potenziale citotossico è fondamentale per misurare l’attivazione e la potenza delle cellule immunitarie e il test di rilascio di cromo è comunemente usato per questo scopo.

Questo metodo consente agli utenti di confrontare la citossicità indotta da specifici tipi di cellule immunitarie in condizioni diverse, che è preziosa per lo studio dell’immunoterapia del cancro e delle malattie correlate all’immunità. Per iniziare, le cellule bersaglio, come le cellule tumorali, vengono incubate con un isotopo radioattivo, il cromo 51, che viene assorbito dalle cellule. Successivamente, queste cellule radio-etichettate vengono co-coltivate con le cellule immunitarie isolate di interesse, chiamate anche cellule emotrici, in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti per facilitare l’interazione tra i due tipi di cellule.

La configurazione complessiva del test prevede l’incubazione di un numero specifico di cellule bersaglio con diverse concentrazioni delle cellule immunitarie, insieme a controlli appropriati. La co-coltura consente alle cellule estatrici di indurre apoptosi e lisi nelle cellule bersaglio, con conseguente rilascio del cromo intracellulare 51 nel surnatante. Quindi, in un punto temporale preottimizzato, il surnatante contenente il cromo rilasciato viene raccolto da tutti i pozzi. Il cromo 51, essendo radioattivo, subisce spontaneamente un decadimento radioattivo per emettere radiazioni gamma. I livelli di radiazione gamma nei supernatanti di tutti i pozzetti nella piastra di analisi rappresentano un output quantificabile della lisi delle cellule bersaglio. Questo viene misurato utilizzando un contatore gamma, che viene quindi utilizzato per determinare il potenziale citotossico delle cellule immunitarie.

Per iniziare, le cellule bersaglio, la linea cellulare di melanoma umano WM793 in questo esempio, vengono preparate in una sospensione a singola cellula. Per fare questo, prima rimuovere il mezzo dal pallone di coltura tissutale e lavare le cellule con cinque millilitri di 1X PBS. Decantare il PBS e quindi aggiungere un millilitro di tripsina al piatto per circa due minuti. Picchiettare delicatamente il matraccio per allentare le celle dalla superficie del pallone e quindi aggiungere cinque millilitri di supporti RPMI al matraccio. Pipettare il supporto su e giù per raccogliere le celle e aggiungere questa sospensione a un tubo conico da 15 millilitro.

Posizionare il tubo nella centrifuga per cinque minuti a 1200 RPM. Quindi, rimuovere il supporto dal tubo assicurandosi di non interrompere il pellet della cella. Far scorrere delicatamente il fondo del tubo per interrompere il pellet della cella e aggiungere 10 millilitri di media al tubo. Quindi, pipettare delicatamente il supporto su e giù per portare le cellule in sospensione. Quindi, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire due millilitri della sospensione cellulare originale in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Posizionare il tubo in una centrifuga e pellet le celle a 12 cento rpm per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, versare il mezzo in eccesso fuori dal tubo in un contenitore per i rifiuti. Vortice brevemente il tubo per risusciere il pellet cellulare nel piccolo volume di mezzo lasciato indietro.

Quindi, preparati a utilizzare Chromium 51 spostandoti in uno spazio di laboratorio dedicato a questa particolare radioattività. Ci dovrebbe essere un’ampia schermatura al piombo per la conservazione e l’uso sicuri del cromo 51 durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con cromo 51. Un contatore Geiger dotato di una sonda per pancake è anche necessario per servire nello spazio per possibili contaminazioni.

Una volta impostato per l’uso corretto della radioattività, aggiungere 100 microcurie di Cromo 51 direttamente alla sospensione cellulare target. Quindi, aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo al tubo per indicare che il campione e il tubo sono ora radioattivi. Posizionare il tubo in un incubatore a 37 gradi Celsius con uno scudo di piombo e incubare per un’ora, facendo scorrere il tubo ogni 15-20 minuti.

Mentre le cellule bersaglio stanno etichettando, preparare una sospensione a singola cellula di cellule emotrici. In questo esempio, le monocellule mononucleari del sangue periferico umano, o PDMC, sono state isolate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard ad una concentrazione di 5 volte 10 al 6 °. Trasferire questa sospensione di cellule emotrici in un serbatoio di reagente monouso e quindi aggiungere 200 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzettino della fila B in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di RPMI a ciascun pozzo nella riga da C a G della piastra.

Ora, inizia a eseguire diluizioni seriali dei PBMC per avere una gamma di numeri di cellule emotrici rimuovendo prima 100 microlitri delle celle nei pozzeggi nella riga B e aggiungendo questo alla riga C. Quindi, diluire ulteriormente le cellule estruttrici trasferendo 100 microlitri di cellule dalla riga C alla riga D. Continuare la diluizione seriale. Una volta raggiunta la riga G, spostare 100 microlitri dai pozzedi per lasciare un volume finale di 100 microlitri in ogni pozzo di quella fila. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura tissutale ai pozzeli nella riga A per servire come controllo per il rilascio spontaneo di cromo 51 dalle cellule bersaglio, poiché nessuna cellule emotrici deve essere aggiunta a questa riga. Quindi, posizionare una piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule bersaglio sono pronte per essere aggiunte.

Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall’incubatrice e lavare con 5 millilitri di FBS per rimuovere l’eventuale eccesso di cromo 51. Quindi, posizionare il tubo in una centrifuga designata e girare a 1200 giri / min per 5 minuti. Rimuovere il lavaggio FBS radioattivo in un contenitore di rifiuti appropriato e ripetere la fase di lavaggio riconsegnando il pellet in un fresco 5 millilitri di FBS. Posizionare il tubo in una centrifuga designata e ruotare nuovamente le celle a 1200 giri / min per 5 minuti. Rimuovere il secondo lavaggio e controllare la radioattività incorporata nel pellet utilizzando un contatore Geiger. Infine, sospendare il pellet in 10 millilitri di mezzo completo e versare la sospensione di cellule bersaglio etichettata con cromo 51 in un serbatoio di reagente monouso. Quindi, aggiungere 100 microlitri di queste cellule bersaglio etichettate a ogni pozzo della piastra cellulare effettore a 96 pozzi. Quindi, aggiungere 100 microlitri dell’1% NP-40 in acqua ai pozzi nella riga H per lisire tutte le cellule bersaglio in ogni riga. Questi pozzedi verranno utilizzati come controllo per determinare i conteggi totali al minuto, o cpm.

Ora che la piastra è pronta, fissare il coperchio aggiungendo un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene cromo 51. Quindi, posizionare la piastra in una centrifuga contrassegnata per gestire campioni radioattivi. Se viene utilizzata una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga. Impostare la centrifuga a 1200 giri / min e portare la piastra alla velocità. Una volta alla velocità, arrestare la macchina. Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Quindi, posizionare la piastra in un’incubatrice a 37 gradi Celsius con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sopra la piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire alle cellule bersaglio di lisi.

Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere con attenzione il nastro attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio. Quindi, posizionare il telaio di raccolta sulla piastra assicurandosi di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ora, premere lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzi. Dopo circa dieci secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone, quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo. Posizionare ciascuno di questi tubi in un tubo FACS secondario. Infine, caricare i tubi FACS su un contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di cromo 51 rilasciata in ciascuna condizione. Registrare attentamente l’ordine in cui i tubi sono stati caricati nel contatore.

Qui, i PBMC non stimolati sono stati aggiunti alle prime 3 corsie e i PMBC stimolati CPG sono stati aggiunti alle corsie da 4 a 6. In questo esempio, i conteggi al minuto sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale e sono state calcolate le medie dei triplicati. Ad esempio, per la prima condizione, le celle A1, A2 e A3 sono state mediate nella cella I3. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ogni condizione può essere calcolata utilizzando questa formula. Ad esempio, per calcolare la percentuale di lisi specifica per le cellule non stimolate che avevano un rapporto di 50 a 1 cellule emotrici per le cellule bersaglio, il CPM spontaneo, che in questo esempio, è 1164,67, è stato sottratto dal CPM sperimentale, 1129. 67. Questo numero può quindi essere diviso per la differenza tra il CPM massimo e il CPM spontaneo, e quindi moltiplicato per 100 per dare la percentuale di lisi specifica. Questo viene quindi calcolato per ogni condizione. Questi dati possono quindi essere rappresentati graficamente per mostrare il confronto del rapporto E / T con la lisi specifica percentuale sia per i PBMC non stimolati che per i PBMC stimolati da CPG. In questo esempio, le cellule emotrici stimolate con CPG hanno ucciso più efficacemente le cellule bersaglio all’aumentare del rapporto tra cellule emotrici e cellule bersaglio. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate, indicando che la stimolazione CPG è necessaria per l’aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.

Results

In questo esempio, le cellule emotrici stimolate con CpG (Figura 1, cerchi neri)hanno ucciso le cellule bersaglio in modo più efficace, poiché il rapporto tra cellule emotrici e cellule bersaglio è aumentato. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate (cerchi bianchi), indicando che la stimolazione CpG è necessaria per l’aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.

Figura 1: Grafico a dispersione del saggio ^{Cr 51:} attività tumoricida da parte di PBMC umani, non stimolati(cerchi bianchi)e dopo stimolazione con CpG(cerchi neri),testata a diversi rapporti effettore:cellule bersaglio (E: T) (compresi tra 50:1 e 1,5:1).

Applications and Summary

Il test qui descritto ha una notevole flessibilità, in quanto è possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici e bersaglio a seconda della domanda posta. Ad esempio, la specificità delle cellule emotrici può essere determinata utilizzando diverse cellule bersaglio o il meccanismo di uccisione delle cellule emotrici può essere determinato utilizzando cellule carenti di proteine specifiche o utilizzando inibitori specifici della proteina. Un problema importante con il test di rilascio ^{di 51}Cr è il potenziale per un alto numero di rilascio spontaneo da parte delle cellule bersaglio. Se coltivato da solo (senza cellule emotrici), il rilascio spontaneo di ⁵¹Cr da parte delle cellule bersaglio dovrebbe idealmente essere non superiore al 30% del rilascio totale (“massimo”) da parte delle cellule bersaglio immediatamente lisi. Tassi di rilascio spontaneo più elevati possono essere dovuti all’uso di cellule bersaglio malsane, a causa di cattive condizioni di salute (ad esempio, coltura estesa di una linea cellulare) o di un periodo di etichettatura eccessivamente lungo.

References

Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

Transcript

In this video you will observe how to perform the chromium release assay and determine the cytotoxic potential of the effector cells.

Immune cells are responsible for identifying and removing potentially harmful cells, like cancer or virus-infected cells, from the body, which is an integral part of the immune response. Several immune cells, like T-cells and NK cells, possess a property known as cytotoxic potential, which is the ability to identify target cells and secrete proteins that induce protein degradation, lysis, and death of those target cells. Quantifying cytotoxic potential is critical for measuring immune cell activation and potency, and the chromium release assay is commonly used for this purpose.

This method enables users to compare cytoxicity induced by specific types of immune cells under different conditions, which is valuable for studying cancer immunotherapy and immunity related diseases. To begin, the target cells, like cancer cells, are incubated with a radioactive isotope, chromium 51, which is taken up by the cells. Next, these radio labeled cells are co-cultured with the isolated immune cells of interest, also called the effector cells, in a round bottom, 96- well plate to facilitate interaction between the two cell types.

The overall setup of the assay involves incubating a specific number of target cells with different concentrations of the immune cells, along with appropriate controls. The co-culture allows the effector cells to induce apoptosis and lysis in the target cells, resulting in the release of the intracellular chromium 51 into the supernatant. Then, at a preoptimized time point, the supernatant containing the released chromium is harvested from all the wells. The chromium 51, being radioactive, spontaneously undergoes radioactive decay to emit gamma radiation. The gamma radiation levels in the supernatants from all the wells in the assay plate represent a quantifiable output of the lysis of the target cells. This is measured using a gamma counter, which is then used to determine the cytotoxic potential of the immune cells.

To begin, the target cells, human melanoma cell line WM793 in this example, are prepared into a single cell suspension. To do this, first remove the media from the tissue culture flask and wash the cells with five milliliters of 1X PBS. Decant the PBS and then add one milliliter of trypsin to the plate for approximately two minutes. Gently tap the flask to loosen the cells from the flask surface and then add five milliliters of RPMI media to the flask. Pipette the media up and down to collect the cells and add this suspension to a 15 milliliter conical tube.

Place the tube in the centrifuge for five minutes at 1200 RPM. Next, remove the media from the tube making sure not to disrupt the cell pellet. Gently flick the bottom of the tube to disrupt the cell pellet and add 10 milliliters of media to the tube. Then, gently pipette the media up and down to bring the cells into suspension. Next, determine the cell concentration using a hemocytometer and transfer two milliliters of the original cell suspension to a new 15 milliliter conical tube. Place the tube into a centrifuge and pellet the cells at 12 hundred RPM for five minutes. After centrifugation, pour the excess media out of the tube into a waste container. Briefly vortex the tube to resuspend the cell pellet in the small volume of medium left behind.

Next, prepare to use Chromium 51 by moving to a lab space dedicated for this particular radioactivity. There should be ample lead shielding for safe storage and use of the Chromium 51 during all steps, as well as proper signage to indicate where samples with Chromium 51 are being kept. A Geiger counter equipped with a pancake probe is also necessary to serve in the space for possible contamination.

Once set up for the proper use of radioactivity, add 100 microcuries of Chromium 51 directly to the target cell suspension. Then, add a small piece of radioactive tape to the tube to indicate that the sample and tube are now radioactive. Place the tube in a 37 degree celsius incubator with a lead shield and incubate for an hour, flicking the tube every 15 to 20 minutes.

While the target cells are labeling, prepare a single cell suspension of effector cells. In this example, human peripheral blood mono nuclear cells, or PDMCs, were isolated from whole blood by standard density gradient centrifugation to a concentration of 5 times 10 to the 6th. Transfer this effector cell suspension into a disposable reagent reservoir and then add 200 microliters of this suspension into each well of row B in a 96-well round-bottom plate. Next, add 100 microliters of RPMI to each well in row C through G of the plate.

Now, begin performing serial dilutions of the PBMCs to have a range of effector cell numbers by first removing 100 microliters of the cells in the wells in row B and adding this to row C. Then, further dilute the effector cells by transferring 100 microliters of cells from row C to row D. Continue the serial dilution. Once row G is reached, move 100 microliters from the wells to leave a final volume of 100 microliters in each well in that row. Next, add 100 microliters of tissue culture medium to the wells in row A to serve as a control for the spontaneous release of Chromium 51 from the target cells, as no effector cells should be added to this row. Then, place a plate into a 37 degree celsius incubator until the target cells are ready to be added.

After the incubation period, remove the target cells from the incubator and wash with 5 milliliters of FBS to remove any excess Chromium 51. Then, place the tube in a designated centrifuge and spin at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the radioactive FBS wash into an appropriate waste container and repeat the wash step by resuspending the pellet in a fresh 5 milliliters of FBS. Place the tube in a designated centrifuge and spin the cells again at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the second wash and check the pellet for incorporated radioactivity using a Geiger counter. Finally, Resuspend the pellet in 10 milliliters of complete medium and pour the Chromium 51 labeled, target cell suspension into a disposable reagent reservoir. Then, add 100 microliters of these labeled target cells to every well of the 96-well effector cell plate. Next, add 100 microliters of 1% NP-40 in water to the wells in row H to lyse all the target cells this each row. These wells will be used as a control to determine the total counts per minute, or cpm.

Now that the plate is prepared, secure the lid by adding a small piece of tape to the each side of the plate and place a piece of radioactive tape on the lid to indicate it contains chromium 51. Then, place the plate in a centrifuge marked to handle radioactive samples. If only one experimental plate is being used, add a balance plate to the centrifuge. Set the centrifuge to 1200 rpm, and bring the plate up to speed. Once at the speed, stop the machine. Remove the plate from the centrifuge. Then, place the plate in a 37 degree celsius incubator with a small piece of lead shielding over the plate for additional safety. Incubate for 16 hours to allow the target cells to lyse.

At the end of the incubation period, carefully remove the tape around the edge of the plate, and remove the lid. Next, place the harvesting frame on the plate making sure to confirm the small filter discs are in place for each of the cotton plugs. Now, slowly and gently press the cotton plugs into the wells. After approximately ten seconds, release the pressure on the cotton plugs, and then transfer the cotton plugs to tube strips. Place each of these tubes into a secondary FACS tube. Finally, load the FACS tubes onto a gamma counter and run the samples to quantitate the amount of chromium 51 released in each condition. Carefully record the order in which the tubes were loaded into the counter.

Here, unstimulated PBMCs were added to the first 3 lanes and CPG stimulated PMBCs were added to lanes 4 through 6. In this example, the counts per minute were entered into the cells of a spreadsheet in the same manner as the samples were laid out in the original plate and the averages of the triplicates were calculated. For example, for the first condition, cells A1, A2, and A3 were averaged in cell I3. Once the averages are determined, the percent of specific lysis for each condition can be calculated using this formula. For example, to calculate the percent specific lysis for the unstimulated cells that had a ratio of 50 to 1 effector cells to target cells the spontaneous CPM, which in this example, is 1164.67, was subtracted from the experimental CPM, 1129. 67. This number can then be divided by the difference between the maximum CPM and the spontaneous CPM, and then multiplied by 100 to give the percent specific lysis. This is then calculated for each condition. These data can then be graphed to show comparison of the E to T ratio with the percent specific lysis for both the unstimulated PBMCs, and the CPG stimulated PBMCs. In this example, effector cells stimulated with CPG more effectively killed target cells as the ratio of effector cells to target cells increased. This increase was not observed in the unstimulated PBMCs, indicating that CPG stimulation is necessary for the observed increase in target cell lysis.

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