Microscopia e colorazioni: la colorazione di Gram, delle endospore e del capside

I batteri sono organismi viventi microscopici che hanno molte caratteristiche distintive come la forma, la disposizione delle cellule, se producono o meno capsule e se formano spore. Queste caratteristiche possono essere visualizzate mediante colorazione e aiutano nell'identificazione e nella classificazione di diverse specie batteriche.

Per esaminare le prime due caratteristiche della forma e della disposizione delle cellule, possiamo utilizzare una semplice tecnica chiamata colorazione di Gram. Qui, il cristallovioletto viene applicato ai batteri, che sono stati fissati a caldo su un vetrino. Successivamente, la soluzione di iodio di Gram viene aggiunta al vetrino, con conseguente formazione di un complesso insolubile tra il cristallovioletto e la soluzione di iodio di Gram. Viene quindi applicato un decolorante e tutti i batteri con uno spesso strato di peptidoglicano si colorano di viola, poiché questo strato non è facilmente penetrabile dal decolorante. Questi batteri sono indicati come Gram-positivi.

I batteri Gram-negativi hanno uno strato di peptidoglicano più sottile e decolorano il decolorante, perdendo il colore viola. Tuttavia, si colorano di rosa-rossastro quando viene aggiunto un controcolorante di safranina, che si lega a uno strato di lipopolisaccaride all'esterno. Una volta colorate, le cellule possono essere osservate per morfologia, dimensioni e disposizione, ad esempio in catene o grappoli, il che aiuta ulteriormente nella classificazione e nell'identificazione.

Un'altra tecnica utile nel kit di strumenti del microbiologo è la colorazione della capsula, utilizzata per visualizzare le capsule esterne che circondano alcuni tipi di cellule batteriche. A causa della composizione non ionica della capsula e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzioneranno. Invece, viene utilizzata una tecnica di colorazione negativa, che prima colora lo sfondo con un colorante acido, come il rosso Congo, prima che le cellule batteriche vengano colorate con cristallovioletto. Questo lascia qualsiasi capsula presente come un alone chiaro intorno alle cellule.

L'ultima tecnica di colorazione principale qui trattata può aiutare a determinare se i batteri studiati formano spore. In condizioni avverse, alcuni batteri producono endospore, strutture dormienti, dure e non riproduttive la cui funzione primaria è quella di garantire la sopravvivenza dei batteri durante periodi di stress ambientale, come temperature estreme o disidratazione. Tuttavia, non tutte le specie batteriche producono endospore e sono difficili da colorare con le tecniche standard perché sono impermeabili a molti coloranti. Il metodo Schaeffer-Fulton utilizza la colorazione verde malachite, che viene applicata ai batteri fissati a un vetrino. Il vetrino viene quindi lavato con acqua prima di essere controcolorato con Safranin. Le cellule vegetative appariranno rosso-rosate, mentre le eventuali endospore presenti appariranno verdi. In questo video imparerai come eseguire queste comuni tecniche di colorazione batterica e quindi esaminerai i campioni di colorazione utilizzando la microscopia ottica.

Per iniziare la procedura, lega i capelli lunghi e indossa i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui camice da laboratorio e guanti.

Quindi, pulire un vetrino da microscopio nuovo con una salvietta da laboratorio. Quindi, pipettare 10 microlitri di soluzione fisiologica tamponata con fosfato 1X sul primo vetrino. Quindi, utilizzare una punta per pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare la colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Posizionare lo scivolo sul piano di lavoro e lasciarlo asciugare completamente all'aria.

Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per fissare i batteri a caldo. Utilizzando le pinze, passare più volte il vetrino attraverso la fiamma del bruciatore, con i batteri rivolti verso l'alto, facendo attenzione a non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo, che potrebbe distorcere le celle.

Ora, lavorando sopra il lavandino, tenere il vetrino in piano e applicare diverse gocce di cristallovioletto di Gram per coprire completamente lo striscio batterico, quindi posizionare il vetrino sul banco in posa per 45 secondi. Quindi, tieni il vetrino inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore del vetrino, facendo attenzione a non spruzzare direttamente lo striscio batterico. Ora, tenendo di nuovo il vetrino in piano, applicare la soluzione di iodio di Gram per coprire completamente i batteri macchiati e poi lasciarla riposare per altri 45 secondi. Successivamente, sciacquare accuratamente lo iodio dal vetrino, come mostrato in precedenza. Tenendo il vetrino inclinato, aggiungere alcune gocce di decolorante di Gram al vetrino, lasciandolo scorrere sui batteri macchiati, fino a quando il deflusso non è chiaro, per circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come mostrato in precedenza. Ciò limiterà l'eccessiva decolorazione dello striscio. Quindi, tenendo nuovamente il vetrino a livello, applicare il colorante di contrasto alla safranina di Gram per coprire completamente i batteri macchiati. Dopo 45 secondi, sciacquare delicatamente la safranina dallo scivolo con acqua, come mostrato in precedenza, e poi asciugare con carta assorbente.

Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con una lente obiettivo a olio 100X.

Per iniziare questo protocollo di colorazione, indossare prima i dispositivi di protezione individuale corretti e poi assicurarsi che i vetrini che verranno utilizzati siano puliti.

Quindi, prepara le soluzioni. Per ottenere una soluzione di cristallovioletto all'1%, mescolare 0,25 grammi di polvere di cristallovioletto con 25 millilitri di acqua distillata e agitare fino a dissoluzione. Quindi, preparare una soluzione di rosso Congo all'1% mescolando 0,25 grammi di polvere rossa del Congo con 25 millilitri di acqua distillata e agitare fino a quando non si sarà sciolto. Ora, pipettare 10 microlitri di soluzione di rosso Congo sul vetrino. Utilizzando un puntale per pipetta pulito e sterile, selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Quindi, spalmare la colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme. Asciugare completamente all'aria il vetrino batterico per 5-7 minuti. Una volta che il vetrino è asciutto, inondare lo striscio con una quantità sufficiente di cristallovioletto all'1% per coprire lo striscio e lasciarlo riposare per 1 minuto. Ora, tieni lo scivolo inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente i batteri. Continuare a tenere il vetrino a un angolo di 45 gradi fino a completa asciugatura all'aria. Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a olio 100X.

Per eseguire la colorazione con endospore, preparare innanzitutto una soluzione di verde malachite allo 0,5% mescolando 0. 125 grammi di polvere verde di malachite con 25 millilitri di acqua distillata, quindi agitare la soluzione fino a quando non si scioglie. Quindi, pipettare 10 microlitri di 1X PBS al centro del vetrino. Quindi, utilizzare una punta per pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare i batteri nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Ora, posiziona lo scivolo sul piano di lavoro e lascialo asciugare completamente all'aria. Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per fissare i batteri a caldo. Passare più volte il vetrino attraverso la fiamma blu del bruciatore, con il lato dei batteri rivolto verso l'alto. Quindi, una volta che il vetrino si è raffreddato, posizionare un pezzo di carta per lenti pretagliata sopra la macchia fissata a caldo. Quindi, accendi una piastra al massimo e porta a ebollizione un bicchiere d'acqua.

Saturare la carta per lenti con la soluzione di verde malachite e, utilizzando una pinza, posizionare il vetrino sopra il bicchiere di acqua bollente a cuocere a vapore per 5 minuti. Mantieni umida la carta per lenti aggiungendo altro colorante, una goccia alla volta, se necessario. Quindi, sempre usando le pinze, prelevare il vetrino dal becher e rimuovere e gettare la carta per lenti. Lasciare raffreddare il vetrino per 2 minuti. Lavorando sopra il lavandino, tieni lo scivolo inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo. Ora, tieni premuto il vetrino a livello e applica Safranin per coprire completamente il vetrino. Quindi, lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, tenere il carrello inclinato e risciacquare come mostrato in precedenza. Lasciare asciugare lo scivolo all'aria sul piano di lavoro. Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino con un microscopio ottico, con un obiettivo a olio 100X.

Nel protocollo di colorazione di Gram, possono risultare due macchie di colore diverso. La colorazione viola scuro indica che i batteri sono Gram-positivi e che hanno mantenuto la colorazione cristallovioletta. Al contrario, la colorazione rosa-rossastra è una caratteristica dei batteri Gram-negativi, che invece saranno colorati dalla controcolorazione Safranina. Inoltre, dopo la colorazione di Gram è possibile visualizzare diverse forme e disposizioni dei batteri. Ad esempio, è possibile differenziare i Cocchi, o batteri rotondi, dai Bacillus a forma di bastoncello, o identificare i batteri, che formano filamenti, rispetto a quelli che tipicamente si aggregano come grumi o si verificano singolarmente.

In un'immagine al microscopio colorata con capsula, le cellule batteriche saranno tipicamente colorate di viola e lo sfondo del vetrino dovrebbe essere colorato in modo scuro. Su questo sfondo scuro, le capsule dei batteri, se presenti, appariranno come un chiaro alone attorno alle cellule.

Infine, nella colorazione con endospore, le cellule vegetative saranno colorate di rosso dalla controcolorazione safranina. Se nel campione sono presenti endospore, queste manterranno la macchia verde malachite e appariranno di colore verde-bluastro.