Microscopia e colorazioni: la colorazione di Gram, delle endospore e del capside

1. Colorazione del grammo

1. Configurazione
   1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio non infiammabile, poiché i coloranti macchiano mani e vestiti.
   2. Un bruciatore Bunsen viene utilizzato per riscaldare i batteri. Usare attenzione quando si lavora con la fiamma; legare i capelli lunghi.
   3. Verranno utilizzati reagenti per macchie di Gram disponibili in commercio.
   4. Pulire i vetrini del microscopio con salviette da laboratorio.
2. Protocollo
   1. Pipet 10 μL fosfato tamponato soluzione salina o brodo di coltura su vetrino.
   2. Spalmare una colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme.
      Nota: Non utilizzare colture più vecchie di 24 ore, poiché i batteri troppo vecchi potrebbero avere cambiamenti nella loro parete cellulare che influenzeranno i risultati della macchia di Gram (1, 4).
   3. Scivolo completamente asciutto all'aria.
   4. Una volta asciugati, il calore fissa i batteri facendo scorrere attraverso la fiamma (i batteri si trovano verso l'alto) 4-5 volte.
      Nota: Non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo o si possono distorcere le cellule batteriche (1).
   5. Lavorando sopra il lavandino, tenere premuto il livello di scorrimento e applicare Gram's Crystal Violet per coprire completamente i batteri termo-fissati, lasciare riposare 45 secondi.
   6. Risciacquare crystal violet in eccesso tenendo il vetrino ad angolo e spruzzando un flusso d'acqua delicato e indiretto sullo scivolo e lasciandolo scorrere sui batteri macchiati. Non spruzzare acqua direttamente sui batteri.
   7. Tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare gram's Iodine Solution per coprire completamente i batteri macchiati, lasciare riposare 45 secondi.
   8. Risciacquare lo iodio in eccesso come nel passaggio 1.2.6 sopra.
   9. Tenendo la diapositiva ad angolo, aggiungere alcune gocce di Decolorizer sulla diapositiva, lasciandola gocciolare sui batteri macchiati solo fino a quando il deflusso è chiaro; in genere, circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come indicato al punto 1.2.6 di cui sopra.
      Nota: Questo è un passaggio critico nel protocollo. Lasciare che Decolorizer rivolo troppo a lungo o non abbastanza a lungo si tradurrà in una falsa colorazione di Gram (4).
   10. Tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare la safranina di Gram per coprire completamente i batteri, lasciare riposare 45 secondi.
   11. Risciacquare la safranina in eccesso come al punto 1.2.6 di cui sopra.
   12. Macchia, non strofinare, acqua in eccesso dallo scivolo usando asciugamani di carta.
   13. Esaminare il vetrino al microscopio utilizzando l'immersione in olio con un obiettivo 100X.
3. Risultati e analisi dei dati
   1. I batteri Gram-positivi macchieranno di viola.
   2. I batteri Gram-negativi si macchiano di rosso.
   3. La forma (cocchi, bacilli, aste curve, spirali) dei batteri sarà visibile.
   4. Sarà visibile la disposizione delle cellule batteriche (cellule singole, cellule accoppiate, catene di cellule, cluster, raggruppamenti).

2. Colorazione della capsula

1. Configurazione
   1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio come coloranti macchiare mani e vestiti.
   2. Per preparare la soluzione di Crystal Violet all'1%, mescolare 0,25 grammi di Crystal Violet con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.
   3. Per preparare la soluzione Congo Red all'1%, mescolare 0,25 grammi di Congo Red con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.
   4. Pulire i vetrini con salviette da laboratorio.
2. Protocollo
   1. Posizionare 10 μL Congo Red sulla diapositiva.
   2. Usando una punta di pipetta, spalmare una colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme.
   3. Vetrino completamente asciutto all'aria con miscela colorante/cellulare, 5-7 minuti.
      Nota: Non fissare il calore in quanto il riscaldamento può disidratare o distorcere la capsula.
   4. Inondare lo striscio con l'1% di Crystal Violet per 1 minuto.
   5. Risciacquare la macchia in eccesso tenendo la diapositiva ad angolo e spruzzando un flusso d'acqua delicato e indiretto sullo scivolo e lasciandolo scorrere sui batteri macchiati. Non spruzzare acqua direttamente sui batteri.
   6. Tenere la diapositiva con un angolo di 45 gradi fino a completa asciugazione all'aria.
   7. Esaminare lo striscio al microscopio sotto immersione in olio con un obiettivo 100X.
3. Risultati e analisi dei dati
   1. Le cellule batteriche macchieranno di viola.
   2. Lo sfondo della diapositiva si macchia di scuro.
   3. Le capsule saranno un alone chiaro intorno alle cellule su uno sfondo scuro.

3. Colorazione delle endospore (metodo Schaeffer-Fulton)

1. Configurazione
   1. Indossare guanti e camici da laboratorio non infiammabili per proteggere mani e indumenti da coloranti e fiamme.
   2. Un bruciatore Bunsen viene utilizzato per riscaldare i batteri. Usare attenzione quando si lavora con la fiamma; legare i capelli lunghi.
   3. Per preparare la soluzione verde di malachite allo 0,5%, mescolare 0,125 grammi di malachite verde con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.
   4. Utilizzare la soluzione di reagente safranina di Gram disponibile in commercio.
   5. Pulire i vetrini con salviette da laboratorio.
2. Protocollo
   1. Pipetta 10 μl fosfato tamponato soluzione salina (PBS) o brodo di coltura su vetrino.
   2. Usando la tecnica asettica, spalmare una colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme.
      Nota: Le endospore generalmente non si formano nelle cellule giovani, quindi si raccomanda che la coltura sia compresa tra 18 e 36 ore (9).
   3. Scivolo completamente asciutto all'aria.
   4. Correzione del calore facendo passare il vetrino (batteri lato verso l'alto) attraverso la fiamma 4-5 volte.
   5. Per aiutare a contenere il colorante, posizionare un pezzo di carta per lenti (tagliato per adattarsi allo striscio batterico) sopra lo striscio fisso a caldo.
   6. Saturare la carta per lenti con la soluzione Malachite Green.
   7. Posizionare il vetrino sopra il becher di acqua bollente su una piastra calda e scorrere a vapore per 5 minuti, mantenendo la carta delle lenti umida aggiungendo più colorante una goccia alla volta, se necessario.
      Nota: Evitare il surriscaldamento e l'essiccazione della soluzione colorante.
   8. Rimuovere il vetrino dal becher, rimuovere e scartare la carta per lenti, lasciare raffreddare la diapositiva per 2 minuti.
   9. Tenendo il vetrino ad angolo, risciacquare abbondantemente spruzzando un flusso d'acqua delicato e indiretto sullo scivolo, permettendogli di drenare sopra lo striscio.
   10. Tenendo il livello di scorrimento, allagare la macchia con Safranin, lasciare riposare 1 minuto.
   11. Risciacquare la safranina in eccesso come nel passaggio 3.2.9 sopra.
   12. Lasciare asciugare all'aria.
   13. Esaminare il vetrino al microscopio sotto immersione in olio con un obiettivo 100X.
3. Risultati e analisi dei dati
   1. Le spore si macchiano di verde.
   2. Le cellule vegetative si macchiano di rosso.
   3. Alcune cellule vegetative conterranno spore; le cellule si macchieranno di rosso, mentre le endospore si macchieranno di verde.