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Microscopia e colorazioni: la colorazione di Gram, delle endospore e del capside

Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

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Microbiology

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Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

6.7: Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

6.9: Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

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11:33 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹e Victor J. DiRita¹
¹ Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Stati Uniti d’America

I batteri sono diversi microrganismi che si trovano quasi ovunque sulla Terra. Molte proprietà aiutano a distinguerli l’uno dall’altro, incluso ma non limitato al tipo di colorazione di Gram, alla forma e alla disposizione, alla produzione di capsule e alla formazione di spore. Per osservare queste proprietà, si può usare la microscopia ottica; tuttavia, alcune caratteristiche batteriche (ad esempio dimensioni, mancanza di colorazione e proprietà di rifrazione) rendono difficile distinguere i batteri esclusivamente con un microscopio ottico (1, 2). La colorazione dei batteri è necessaria quando si distinguono i tipi batterici con la microscopia ottica. I due principali tipi di microscopi otscopici sono semplici e composti. La principale differenza tra loro è il numero di lenti utilizzate per ingrandire l’oggetto. I microscopi semplici (ad esempio una lente d’ingrandimento) hanno una sola lente per ingrandire un oggetto, mentre i microscopi composti hanno diverse lenti per migliorare l’ingrandimento (Figura 1). I microscopi composti hanno una lente obiettiva vicino all’oggetto che raccoglie la luce per creare un’immagine dell’oggetto. Questo viene poi ingrandito dall’oculare (lente oculare) che ingrandisce l’immagine. La combinazione dell’obiettivo e dell’oculare consente un ingrandimento maggiore rispetto all’utilizzo di una singola lente da sola. Tipicamente, i microscopi composti hanno più lenti obiettivo di varie potenze per consentire un ingrandimento diverso (1, 2). Qui, discuteremo la visualizzazione dei batteri con macchie di Gram, macchie di capsule e macchie di endospore.

Figura 1: Un tipico microscopio composto. Le parti più importanti del microscopio sono etichettate.

La macchia di Gram, sviluppata nel 1884 dal batteriologo danese Hans Christian Gram (1), differenzia i batteri in base alla composizione della parete cellulare (1, 2, 3, 4). In breve, uno striscio batterico viene posto su un vetrino per microscopio e quindi fissato a calore per far aderire le cellule al vetrino e renderle più facilmente accettabili delle macchie (1). Il campione fissato a caldo viene colorato con Crystal Violet, trasformando le cellule in viola. Il vetrino viene lavato con una soluzione di iodio, che fissa il Crystal Violet alla parete cellulare, seguito da un decolorante (un alcool) per lavare via qualsiasi Crystal Violet non fisso. Nella fase finale, una controcolore, Safranin, viene aggiunta alle celle colorate di rosso (Figura 2). I batteri Gram-positivi si colorano di viola a causa dello spesso strato di peptidoglicano che non è facilmente penetrato dal decolorante; I batteri Gram-negativi, con il loro strato peptidoglicano più sottile e il più alto contenuto lipidico, si dissacrono con il decolorante e sono controcolorati di rosso quando viene aggiunta Safranina (Figura 3). La colorazione di Gram viene utilizzata per differenziare le cellule in due tipi (Gram-positivo e Gram-negativo) ed è anche utile per distinguere la forma delle cellule (sfere o cocchi, aste, aste curve e spirali) e la disposizione (celle singole, coppie, catene, gruppi e cluster) (1, 3).

Figura 2: Schema del protocollo di colorazione di Gram. La colonna di sinistra mostra come reagiscono i batteri Gram-negativi in ogni fase del protocollo. La colonna di destra mostra come reagiscono i batteri Gram-positivi. Inoltre, sono mostrate due tipiche forme di cellule batteriche: i bacilli (o bastoncelli) e i cocchi (o sfere).

Figura 3: Risultati della colorazione di Gram. Una macchia di Gram di una miscela di Staphylococcus aureus (cocchi viola Gram-positivi) ed Escherichia coli (barre rosse Gram-negative).

Alcuni batteri producono uno strato esterno viscoso extracellulare chiamato capsula (3, 5). Le capsule sono strutture protettive con varie funzioni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l’aderenza a superfici e altri batteri, la protezione dall’essiccazione e la protezione dalla fagocitosi. Le capsule sono tipicamente composte da polisaccaridi contenenti più del 95% di acqua, ma alcune possono contenere polialcoli e poliammine (5). A causa della loro composizione per lo più non ionica e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzionano con la capsula; invece, la colorazione della capsula utilizza una tecnica di colorazione negativa che macchia le cellule e lo sfondo, lasciando la capsula come un alone chiaro intorno alle cellule (1, 3) (Figura 4). La colorazione della capsula comporta la spalma di un campione batterico in una macchia acida su un vetrino per microscopio. A differenza della colorazione di Gram, lo striscio batterico non viene fissato termicamente durante una colorazione della capsula. Il fissaggio del calore può interrompere o disidratare la capsula, portando a falsi negativi (5). Inoltre, il fissaggio termico può ridurre le celle con conseguente pulizia intorno alla cellula che può essere scambiata per una capsula, portando a falsi positivi (3). La macchia acida colora lo sfondo della diapositiva; mentre segue con una macchia di base, Crystal Violet, colora le cellule batteriche stesse, lasciando la capsula incontaminata e apparendo come un alone chiaro tra le cellule e lo sfondo del vetrino (Figura 5). Tradizionalmente, l’inchiostro indiano è stato usato come macchia acida perché queste particelle non possono penetrare nella capsula. Pertanto, né la capsula né la cellula sono macchiate dall’inchiostro dell’India; invece, lo sfondo è macchiato. Congo Red, Nigrosin o Eosin possono essere utilizzati al posto dell’inchiostro indiano. La colorazione della capsula può aiutare i medici a diagnosticare le infezioni batteriche quando si guardano le colture dai campioni dei pazienti e guidare il trattamento appropriato del paziente. Le malattie comuni causate da batteri incapsulati includono polmonite, meningite e salmonellosi.

Figura 4: Schema del protocollo di colorazione della capsula. Il pannello superiore mostra lo striscio di scorrimento prima di qualsiasi applicazione di macchia. Il pannello centrale mostra come la diapositiva e i batteri si occupano della macchia primaria, Congo Red. Il pannello finale mostra come il vetrino e i batteri si occupano della controcolorazione, Crystal Violet.

Figura 5: Risultati della colorazione della capsula. Colorazione della capsula di Acinetobacter baumannii incapsulato (indicato con frecce nere) e Escherichia coli non incapsulato (indicato con frecce bianche). Si noti che lo sfondo è scuro e le cellule di A. baumannii sono macchiate di viola. La capsula intorno alle cellule di A. baumannii è evidente come un alone, mentre E. coli non ha alone.

In condizioni avverse (ad esempio limitazione dei nutrienti, temperature estreme o disidratazione), alcuni batteri producono endospore, strutture metabolicamente inattive resistenti ai danni fisici e chimici (1, 2, 8, 9). Le endospore consentono al batterio di sopravvivere a condizioni difficili proteggendo il materiale genetico delle cellule; una volta che le condizioni sono favorevoli alla crescita, le spore germinano e la crescita batterica continua. Le endospore sono difficili da macchiare con le tecniche di colorazione standard perché sono impermeabili ai coloranti tipicamente utilizzati per la colorazione (1, 9). La tecnica abitualmente utilizzata per macchiare le endospore è il Metodo Schaeffer-Fulton (Figura 6),che utilizza la macchia primaria Malachite Green, una macchia solubile in acqua che si lega relativamente debolmente al materiale cellulare, e il calore, per consentire alla macchia di sfondare la corteccia della spora (Figura 7). Questi passaggi colorano le cellule in crescita (denominate cellule vegetative nel contesto della biologia delle endospore), così come le endospore e le eventuali spore libere (quelle che non sono più all’interno del precedente involucro cellulare). Le cellule vegetative vengono lavate con acqua per rimuovere Malachite Green; le endospore trattengono la macchia a causa del riscaldamento del verde malachite all’interno della spora. Infine, le cellule vegetative sono controbattete con Safranin per visualizzare (Figura 8). La colorazione per le endospore aiuta a differenziare i batteri in formatori di spore e formatori non sporici, oltre a determinare se le spore sono presenti in un campione che, se presente, potrebbe portare a contaminazione batterica al momento della germinazione.

Figura 6: Schema del protocollo di colorazione delle endospore. La colonna di sinistra mostra come reagiscono i batteri che formano spore in ogni fase del protocollo. La colonna di destra mostra come reagiscono i batteri che non formano spore.

Figura 7: Diagramma della struttura delle endospore. Cellula batterica contenente un’endospora con le varie strutture sporiche etichettate.

Figura 8: Risultati della colorazione delle endospore. Una colorazione tipica delle endospore di Bacillus subtilis. Le cellule vegetative (indicate con le frecce bianche) sono macchiate di rosso, mentre le endospore (denotate con le frecce nere) sono macchiate di verde.

Procedure

1. Colorazione del grammo

Configurazione
1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio non infiammabile, poiché i coloranti macchiano mani e vestiti.
2. Un bruciatore Bunsen viene utilizzato per riscaldare i batteri. Usare attenzione quando si lavora con la fiamma; legare i capelli lunghi.
3. Verranno utilizzati reagenti per macchie di Gram disponibili in commercio.
4. Pulire i vetrini del microscopio con salviette da laboratorio.
Protocollo
1. Pipet 10 μL fosfato tamponato soluzione salina o brodo di coltura su vetrino.
2. Spalmare una colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme.
  Nota: Non utilizzare colture più vecchie di 24 ore, poiché i batteri troppo vecchi potrebbero avere cambiamenti nella loro parete cellulare che influenzeranno i risultati della macchia di Gram (1, 4).
3. Scivolo completamente asciutto all’aria.
4. Una volta asciugati, il calore fissa i batteri facendo scorrere attraverso la fiamma (i batteri si trovano verso l’alto) 4-5 volte.
  Nota: Non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo o si possono distorcere le cellule batteriche (1).
5. Lavorando sopra il lavandino, tenere premuto il livello di scorrimento e applicare Gram’s Crystal Violet per coprire completamente i batteri termo-fissati, lasciare riposare 45 secondi.
6. Risciacquare crystal violet in eccesso tenendo il vetrino ad angolo e spruzzando un flusso d’acqua delicato e indiretto sullo scivolo e lasciandolo scorrere sui batteri macchiati. Non spruzzare acqua direttamente sui batteri.
7. Tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare gram’s Iodine Solution per coprire completamente i batteri macchiati, lasciare riposare 45 secondi.
8. Risciacquare lo iodio in eccesso come nel passaggio 1.2.6 sopra.
9. Tenendo la diapositiva ad angolo, aggiungere alcune gocce di Decolorizer sulla diapositiva, lasciandola gocciolare sui batteri macchiati solo fino a quando il deflusso è chiaro; in genere, circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come indicato al punto 1.2.6 di cui sopra.
  Nota: Questo è un passaggio critico nel protocollo. Lasciare che Decolorizer rivolo troppo a lungo o non abbastanza a lungo si tradurrà in una falsa colorazione di Gram (4).
10. Tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare la safranina di Gram per coprire completamente i batteri, lasciare riposare 45 secondi.
11. Risciacquare la safranina in eccesso come al punto 1.2.6 di cui sopra.
12. Macchia, non strofinare, acqua in eccesso dallo scivolo usando asciugamani di carta.
13. Esaminare il vetrino al microscopio utilizzando l’immersione in olio con un obiettivo 100X.
Risultati e analisi dei dati
1. I batteri Gram-positivi macchieranno di viola.
2. I batteri Gram-negativi si macchiano di rosso.
3. La forma (cocchi, bacilli, aste curve, spirali) dei batteri sarà visibile.
4. Sarà visibile la disposizione delle cellule batteriche (cellule singole, cellule accoppiate, catene di cellule, cluster, raggruppamenti).

2. Colorazione della capsula

Configurazione
1. Indossare guanti e un cappotto da laboratorio come coloranti macchiare mani e vestiti.
2. Per preparare la soluzione di Crystal Violet all’1%, mescolare 0,25 grammi di Crystal Violet con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.
3. Per preparare la soluzione Congo Red all’1%, mescolare 0,25 grammi di Congo Red con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.
4. Pulire i vetrini con salviette da laboratorio.
Protocollo
1. Posizionare 10 μL Congo Red sulla diapositiva.
2. Usando una punta di pipetta, spalmare una colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme.
3. Vetrino completamente asciutto all’aria con miscela colorante/cellulare, 5-7 minuti.
  Nota: Non fissare il calore in quanto il riscaldamento può disidratare o distorcere la capsula.
4. Inondare lo striscio con l’1% di Crystal Violet per 1 minuto.
5. Risciacquare la macchia in eccesso tenendo la diapositiva ad angolo e spruzzando un flusso d’acqua delicato e indiretto sullo scivolo e lasciandolo scorrere sui batteri macchiati. Non spruzzare acqua direttamente sui batteri.
6. Tenere la diapositiva con un angolo di 45 gradi fino a completa asciugazione all’aria.
7. Esaminare lo striscio al microscopio sotto immersione in olio con un obiettivo 100X.
Risultati e analisi dei dati
1. Le cellule batteriche macchieranno di viola.
2. Lo sfondo della diapositiva si macchia di scuro.
3. Le capsule saranno un alone chiaro intorno alle cellule su uno sfondo scuro.

3. Colorazione delle endospore (metodo Schaeffer-Fulton)

Configurazione
1. Indossare guanti e camici da laboratorio non infiammabili per proteggere mani e indumenti da coloranti e fiamme.
2. Un bruciatore Bunsen viene utilizzato per riscaldare i batteri. Usare attenzione quando si lavora con la fiamma; legare i capelli lunghi.
3. Per preparare la soluzione verde di malachite allo 0,5%, mescolare 0,125 grammi di malachite verde con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.
4. Utilizzare la soluzione di reagente safranina di Gram disponibile in commercio.
5. Pulire i vetrini con salviette da laboratorio.
Protocollo
1. Pipetta 10 μl fosfato tamponato soluzione salina (PBS) o brodo di coltura su vetrino.
2. Usando la tecnica asettica, spalmare una colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme.
  Nota: Le endospore generalmente non si formano nelle cellule giovani, quindi si raccomanda che la coltura sia compresa tra 18 e 36 ore (9).
3. Scivolo completamente asciutto all’aria.
4. Correzione del calore facendo passare il vetrino (batteri lato verso l’alto) attraverso la fiamma 4-5 volte.
5. Per aiutare a contenere il colorante, posizionare un pezzo di carta per lenti (tagliato per adattarsi allo striscio batterico) sopra lo striscio fisso a caldo.
6. Saturare la carta per lenti con la soluzione Malachite Green.
7. Posizionare il vetrino sopra il becher di acqua bollente su una piastra calda e scorrere a vapore per 5 minuti, mantenendo la carta delle lenti umida aggiungendo più colorante una goccia alla volta, se necessario.
  Nota: Evitare il surriscaldamento e l’essiccazione della soluzione colorante.
8. Rimuovere il vetrino dal becher, rimuovere e scartare la carta per lenti, lasciare raffreddare la diapositiva per 2 minuti.
9. Tenendo il vetrino ad angolo, risciacquare abbondantemente spruzzando un flusso d’acqua delicato e indiretto sullo scivolo, permettendogli di drenare sopra lo striscio.
10. Tenendo il livello di scorrimento, allagare la macchia con Safranin, lasciare riposare 1 minuto.
11. Risciacquare la safranina in eccesso come nel passaggio 3.2.9 sopra.
12. Lasciare asciugare all’aria.
13. Esaminare il vetrino al microscopio sotto immersione in olio con un obiettivo 100X.
Risultati e analisi dei dati
1. Le spore si macchiano di verde.
2. Le cellule vegetative si macchiano di rosso.
3. Alcune cellule vegetative conterranno spore; le cellule si macchieranno di rosso, mentre le endospore si macchieranno di verde.

I batteri sono organismi viventi microscopici che hanno molte caratteristiche distintive come la forma, la disposizione delle cellule, se producono o meno capsule e se formano spore. Queste caratteristiche possono essere tutte visualizzate colorando e aiutando nell’identificazione e classificazione di diverse specie batteriche.

Per esaminare le prime due caratteristiche della forma e della disposizione cellulare, possiamo usare una semplice tecnica chiamata colorazione di Gram. Qui, il viola cristallino viene applicato ai batteri, che sono stati fissati a calore su un vetrino. Successivamente, la soluzione di iodio di Gram viene aggiunta al vetrino, con conseguente formazione di un complesso insolubile tra il viola cristallino e la soluzione di iodio di Gram. Viene quindi applicato un decolorante e qualsiasi batterio con uno spesso strato di peptidoglicano macchierà di viola, poiché questo strato non è facilmente penetrato dal decolorante. Questi batteri sono indicati come Gram positivi.

I batteri Gram negativi hanno uno strato di peptidoglicano più sottile e smacchiano il decolorante, perdendo il colore viola. Tuttavia, si macchiano di rosa rossastro quando viene aggiunta una macchia di contatore di safranina, che si lega a uno strato di lipopolisaccaride all’esterno. Una volta macchiate, le cellule possono essere osservate per morfologia, dimensioni e disposizione, ad esempio in catene o grappoli, che aiuta ulteriormente nella classificazione e nell’identificazione.

Un’altra tecnica utile nel toolkit del microbiologo è la colorazione della capsula, utilizzata per visualizzare le capsule esterne che circondano alcuni tipi di cellule batteriche. A causa della composizione non ionica delle capsule e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzioneranno. Invece, viene utilizzata una tecnica di colorazione negativa, che prima macchia lo sfondo con un colorante acido, come il rosso Congo, prima che le cellule batteriche siano macchiate di viola cristallino. Questo lascia qualsiasi capsula presente come un alone chiaro intorno alle cellule.

L’ultima importante tecnica di colorazione qui trattata può aiutare a determinare se i batteri studiati formano spore. In condizioni avverse, alcuni batteri producono endospore, strutture dormienti, dure, non riproduttive, la cui funzione primaria è quella di garantire la sopravvivenza dei batteri attraverso periodi di stress ambientale, come temperature estreme o disidratazione. Tuttavia, non tutte le specie batteriche producono endospore e sono difficili da macchiare con tecniche standard perché sono impermeabili a molti coloranti. Il metodo Schaeffer-Fulton utilizza la macchia verde malachite, che viene applicata ai batteri fissati a un vetrino. Lo scivolo viene quindi lavato con acqua prima di essere contromaccato con safranina. Le cellule vegetative appariranno rosso-rosate, mentre le eventuali endospore presenti appariranno verdi. In questo video, imparerai come eseguire queste comuni tecniche di colorazione batterica e quindi esaminare i campioni di colorazione utilizzando la microscopia ottica.

Per iniziare la procedura, legare i capelli lunghi e indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui un camice da laboratorio e guanti.

Quindi, pulire un vetrino per microscopio fresco con una salvietta di laboratorio. Successivamente, pipettare 10 microlitri di 1X fosfato tamponato soluzione salina sul primo vetrino. Quindi, utilizzare una punta di pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare la colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Impostare la diapositiva sul piano di lavoro e lasciarla asciugare completamente all’aria.

Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per riscaldare i batteri. Usando le pinze, passare la slitta attraverso la fiamma del bruciatore più volte, con i batteri a lato verso l’alto, facendo attenzione a non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo, il che potrebbe distorcere le cellule.

Ora, lavorando sopra il lavandino, tenere premuto il livello della diapositiva e applicare diverse gocce di viola cristallo di Gram per coprire completamente lo striscio batterico e quindi, posizionare lo scivolo sulla panca per riposare per 45 secondi. Quindi, tenere la diapositiva ad angolo e spruzzare delicatamente un getto d’acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente lo striscio batterico. Ora, tenendo di nuovo il livello del vetrino, applicare la soluzione di iodio di Gram per coprire completamente i batteri macchiati e quindi lasciarlo riposare per altri 45 secondi. Quindi, risciacquare accuratamente lo iodio dal vetrino, come mostrato in precedenza. Tenendo la diapositiva ad angolo, aggiungere alcune gocce di decolorante di Gram alla diapositiva, permettendole di scorrere sui batteri macchiati, solo fino a quando il deflusso è chiaro, per circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come mostrato in precedenza. Ciò limiterà l’eccessiva decolorazione dello striscio. Quindi, tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare la contromacchia di safranina di Gram per coprire completamente i batteri macchiati. Dopo 45 secondi, sciacquare delicatamente la safranina dalla diapositiva con acqua, come mostrato in precedenza, e quindi asciugare con carta assorbente.

Infine, aggiungere una goccia di olio di immersione direttamente al vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con una lente ad olio 100X.

Per iniziare questo protocollo di colorazione, prima indossare il corretto dispositivo di protezione individuale e quindi assicurarsi che i vetrini che verranno utilizzati siano puliti.

Quindi, preparare le soluzioni. Per produrre una soluzione viola cristallina all’1%, mescolare 0,25 grammi di polvere viola cristallina con 25 millilitri di acqua distillata e vortice fino a quando non si scioglie. Quindi, preparare la soluzione rossa congolese all’1% mescolando 0,25 grammi di polvere rossa congolese con 25 millilitri di acqua distillata e vortice fino a quando non si scioglie. Ora, pipettare 10 microlitri della soluzione rossa del Congo sulla diapositiva. Utilizzando una punta della pipetta pulita e sterile, selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Quindi, spalmare la colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme. Asciugare completamente all’aria il vetrino batterico per 5-7 minuti. Una volta che la diapositiva è asciutta, inondare lo striscio con abbastanza 1% di cristallo viola per coprire lo striscio e lasciarlo riposare per 1 minuto. Ora, tieni la diapositiva ad angolo e spruzza delicatamente un getto d’acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente i batteri. Continuare a tenere la diapositiva con un angolo di 45 gradi fino a completa asciugazione all’aria. Infine, aggiungere una goccia di olio per immersione direttamente al vetrino e quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a olio 100X.

Per eseguire la colorazione delle endospore, in primo luogo, preparare una soluzione verde di malachite allo 0,5% mescolando 0. 125 grammi di polvere verde malachite con 25 millilitri di acqua distillata, quindi vortice la soluzione fino a quando non si scioglie. Successivamente, pipettare 10 microlitri di 1X PBS sul centro della diapositiva. Quindi, utilizzare una punta di pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare i batteri nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Ora, imposta la diapositiva sul piano di lavoro e lasciala asciugare completamente all’aria. Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per riscaldare i batteri. Passare la diapositiva attraverso la fiamma del bruciatore blu più volte, con il lato dei batteri rivolto verso l’alto. Quindi, una volta che la diapositiva si è raffreddata, posizionare un pezzo di carta per lenti pretagliata sopra lo striscio fissato a caldo. Quindi, accendere una piastra riscaldatrice fino all’impostazione più alta e portare a ebollizione un becher d’acqua.

Saturare la carta della lente con la soluzione verde malachite e, usando le pinze, posizionare il vetrino sopra il becher di acqua bollente a vapore per 5 minuti. Mantenere la carta delle lenti umida aggiungendo più colorante, una goccia alla volta, se necessario. Quindi, di nuovo usando le pinze, prendi la diapositiva dal becher e rimuovi e scarta la carta per lenti. Lasciare raffreddare la diapositiva per 2 minuti. Lavorando sopra il lavandino, tenere la diapositiva ad angolo e spruzzare delicatamente un flusso d’acqua sulla parte superiore dello scivolo. Ora, tenere premuto il livello del vetrino e applicare la safranina per coprire completamente la diapositiva. Quindi, lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, tenere la diapositiva ad angolo e risciacquare come mostrato in precedenza. Lasciare asciugare all’aria la diapositiva sul piano di lavoro. Infine, aggiungere una goccia di olio per immersione direttamente al vetrino, quindi esaminare il vetrino con un microscopio ottico, con un obiettivo olio 100X.

Nel protocollo di colorazione Gram, possono risultare due diverse macchie colorate. La colorazione viola scuro indica che i batteri sono Gram-positivi e che hanno mantenuto la macchia viola cristallina. Al contrario, la colorazione rosa-rossastra è una caratteristica dei batteri Gram-negativi, che invece saranno colorati dalla macchia del contatore di safranin. Inoltre, diverse forme e disposizioni dei batteri possono essere visualizzate dopo la colorazione di Gram. Ad esempio, è possibile differenziare i Cocchi, o batteri rotondi, dai Bacillus a forma di bastoncello, o identificare i batteri che formano fili, rispetto a quelli che tipicamente si aggregano come grumi o si verificano da solo.

In un’immagine al microscopio macchiata di capsula, le cellule batteriche saranno in genere macchiate di viola e lo sfondo del vetrino dovrebbe essere macchiato di scuro. Su questo sfondo scuro, le capsule dei batteri, se presenti, appariranno come un alone chiaro intorno alle cellule.

Infine, nella colorazione delle endospore, le cellule vegetative saranno macchiate di rosso dalla macchia del contatore di safranina. Se le endospore sono presenti nel campione, queste manterranno la macchia verde malachite e appariranno di colore verde-bluastro.

Applications and Summary

I batteri hanno caratteristiche distintive che possono aiutare nella loro identificazione. Alcune di queste caratteristiche possono essere osservate mediante colorazione e microscopia ottica. Tre tecniche di colorazione utili per osservare queste caratteristiche sono la colorazione di Gram, la colorazione della capsula e la colorazione delle endospore. Ogni tecnica identifica diverse caratteristiche dei batteri e può essere utilizzata per aiutare i medici a raccomandare trattamenti per i pazienti, identificare potenziali contaminanti in campioni o prodotti alimentari e verificare la sterilità del campione.

References

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Transcript

Bacteria are microscopic living organisms that have many distinguishing characteristics such as shape, arrangement of cells, whether or not they produce capsules, and if they form spores. These features can all be visualized by staining and aid in the identification and classification of different bacterial species.

To examine the first two characteristics of cell shape and arrangement, we can use a simple technique called Gram staining. Here, crystal violet is applied to bacteria, which have been heat-fixed onto a slide. Next, Gram’s iodine solution is added to the slide, resulting in the formation of an insoluble complex between the crystal violet and the Gram’s iodine solution. A decolorizer is then applied and any bacteria with a thick peptidoglycan layer will stain purple, as this layer is not easily penetrated by the decolorizer. These bacteria are referred to as Gram-positive.

Gram-negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and will de-stain the decolorizer, losing the purple color. However, they will stain reddish-pink when a safranin counterstain is added, which binds to a lipopolysaccharide layer on their outside. Once stained, the cells can be observed for morphology, size, and arrangement, such as in chains or clusters, which further aids in classification and identification.

Another useful technique in the microbiologist’s toolkit is the capsule stain, used to visualize external capsules that surround some types of bacterial cells. Due to the capsule’s non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods won’t work. Instead, a negative staining technique is used, which first stains the background with an acidic colorant, such as Congo red, before the bacterial cells are stained with crystal violet. This leaves any capsule present as a clear halo around the cells.

The final major staining technique covered here can help determine if the bacteria being studied forms spores. In adverse conditions, some bacteria produce endospores, dormant, tough, non-reproductive structures whose primary function is to ensure the survival of bacteria through periods of environmental stress, like extreme temperatures or dehydration. However, not all bacterial species make endospores, and they are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to many dyes. The Schaeffer-Fulton method uses malachite green stain, which is applied to the bacteria fixed to a slide. The slide is then washed with water before being counterstained with Safranin. Vegetative cells will appear pinkish-red, while any endospores present will appear green. In this video, you will learn how to perform these common bacterial staining techniques and then examine the staining samples using light microscopy.

To begin the procedure, tie back long hair and put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves.

Then, clean a fresh microscope slide with a laboratory wipe. Next, pipette 10 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto the first slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacterial colony in the liquid to produce a thin, even layer. Set the slide on the benchtop, and allow it to fully air dry.

Once dried, light a Bunsen burner to heat-fix the bacteria. Using tongs, pass the slide through the burner flame several times, with the bacteria side up, taking care not to hold the slide in the flame too long, which may distort the cells.

Now, working over the sink, hold the slide level and apply several drops of Gram’s crystal violet to completely cover the bacterial smear and then place the slide onto the bench to stand for 45 seconds. Next, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacterial smear directly. Now, holding the slide level again, apply Gram’s iodine solution to completely cover the stained bacteria and then allow it to stand for another 45 seconds. Next, carefully rinse the iodine from the slide, as shown previously. While holding the slide at an angle, add a few drops of Gram’s decolorizer to the slide, allowing it to run down over the stained bacteria, just until the run-off is clear, for approximately 5 seconds. Immediately, rinse with water as shown previously. This will limit over-decolorizing the smear. Next, holding the slide level again, apply Gram’s safranin counterstain to completely cover the stained bacteria. After 45 seconds, gently rinse the Safranin from the slide with water, as shown previously, and then blot dry with paper towels.

Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective lens.

To begin this staining protocol, first put on the correct personal protective equipment and then ensure that the glass slides that will be used are clean.

Next, prepare the solutions. To make 1% crystal violet solution, mix 0.25 grams of crystal violet powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Then, prepare 1% Congo red solution by mixing 0.25 grams of Congo red powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Now, pipette 10 microliters of the Congo red solution onto the slide. Using a clean, sterile pipette tip, select a single bacterial colony from the LB agar plate. Then, smear the bacterial colony into the dye to produce a thin, even layer. Completely air dry the bacterial slide for 5-7 minutes. Once the slide is dry, flood the smear with enough 1% crystal violet to cover the smear and let it sit for 1 minute. Now, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacteria directly. Continue holding the slide at a 45-degree angle until completely air-dried. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective.

To perform endospore staining, first, prepare a 0.5% malachite green solution by mixing 0. 125 grams of malachite green powder with 25 milliliters of distilled water, and then vortex the solution until dissolved. Next, pipette 10 microliters of 1X PBS onto the center of the slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacteria into the liquid to produce a thin, even layer. Now, set the slide on the benchtop, and allow it to fully air dry. Once dried, light a Bunsen burner to heat-fix the bacteria. Pass the slide through the blue burner flame several times, with the bacteria side facing up. Then, once the slide has cooled, place a piece of precut lens paper over the heat-fixed smear. Next, turn on a hotplate to the highest setting, and bring a beaker of water to a boil.

Saturate the lens paper with the malachite green solution and, using tongs, place the slide on top of the beaker of boiling water to steam for 5 minutes. Keep the lens paper moist by adding more dye, one drop at a time, as needed. Next, again using tongs, pick up the slide from the beaker and remove and discard the lens paper. Allow the slide to cool for 2 minutes. Working over the sink, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide. Now, hold the slide level and apply Safranin to completely cover the slide. Then, allow it to stand for 1 minute. Next, hold the slide at an angle and rinse as previously shown. Allow the slide to air dry on the benchtop. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then examine the slide with a light microscope, with a 100X oil objective.

In the Gram staining protocol, two different colored stains can result. Dark purple staining indicates that the bacteria are Gram-positive and that they have retained the crystal violet stain. In contrast, reddish-pink staining is a characteristic of Gram-negative bacteria, which instead will be colored by the Safranin counterstain. Additionally, different shapes and arrangements of bacteria can be visualized after Gram staining. For example, it is possible to differentiate Cocci, or round bacteria, from rod-shaped Bacillus, or identify bacteria, which forms strands, compared to those which typically aggregate as clumps or occur singly.

In a capsule stained microscope image, the bacterial cells will typically be stained purple, and the background of the slide should be darkly stained. Against this dark background, the capsules of the bacteria, if present, will appear as a clear halo around the cells.

Lastly, in endospore staining, Vegetative cells will be stained red by the Safranin counterstain. If endospores are present in the sample, these will retain the malachite green stain and appear bluish-green in color.

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