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Fonte: Rhiannon M. LeVeque1, Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1e Victor J. DiRita1
1 Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Stati Uniti d'America
I batteri sono diversi microrganismi che si trovano quasi ovunque sulla Terra. Molte proprietà aiutano a distinguerli l'uno dall'altro, incluso ma non limitato al tipo di colorazione di Gram, alla forma e alla disposizione, alla produzione di capsule e alla formazione di spore. Per osservare queste proprietà, si può usare la microscopia ottica; tuttavia, alcune caratteristiche batteriche (ad esempio dimensioni, mancanza di colorazione e proprietà di rifrazione) rendono difficile distinguere i batteri esclusivamente con un microscopio ottico (1, 2). La colorazione dei batteri è necessaria quando si distinguono i tipi batterici con la microscopia ottica. I due principali tipi di microscopi otscopici sono semplici e composti. La principale differenza tra loro è il numero di lenti utilizzate per ingrandire l'oggetto. I microscopi semplici (ad esempio una lente d'ingrandimento) hanno una sola lente per ingrandire un oggetto, mentre i microscopi composti hanno diverse lenti per migliorare l'ingrandimento (Figura 1). I microscopi composti hanno una lente obiettiva vicino all'oggetto che raccoglie la luce per creare un'immagine dell'oggetto. Questo viene poi ingrandito dall'oculare (lente oculare) che ingrandisce l'immagine. La combinazione dell'obiettivo e dell'oculare consente un ingrandimento maggiore rispetto all'utilizzo di una singola lente da sola. Tipicamente, i microscopi composti hanno più lenti obiettivo di varie potenze per consentire un ingrandimento diverso (1, 2). Qui, discuteremo la visualizzazione dei batteri con macchie di Gram, macchie di capsule e macchie di endospore.
Figura 1: Un tipico microscopio composto. Le parti più importanti del microscopio sono etichettate.
La macchia di Gram, sviluppata nel 1884 dal batteriologo danese Hans Christian Gram (1), differenzia i batteri in base alla composizione della parete cellulare (1, 2, 3, 4). In breve, uno striscio batterico viene posto su un vetrino per microscopio e quindi fissato a calore per far aderire le cellule al vetrino e renderle più facilmente accettabili delle macchie (1). Il campione fissato a caldo viene colorato con Crystal Violet, trasformando le cellule in viola. Il vetrino viene lavato con una soluzione di iodio, che fissa il Crystal Violet alla parete cellulare, seguito da un decolorante (un alcool) per lavare via qualsiasi Crystal Violet non fisso. Nella fase finale, una controcolore, Safranin, viene aggiunta alle celle colorate di rosso (Figura 2). I batteri Gram-positivi si colorano di viola a causa dello spesso strato di peptidoglicano che non è facilmente penetrato dal decolorante; I batteri Gram-negativi, con il loro strato peptidoglicano più sottile e il più alto contenuto lipidico, si dissacrono con il decolorante e sono controcolorati di rosso quando viene aggiunta Safranina (Figura 3). La colorazione di Gram viene utilizzata per differenziare le cellule in due tipi (Gram-positivo e Gram-negativo) ed è anche utile per distinguere la forma delle cellule (sfere o cocchi, aste, aste curve e spirali) e la disposizione (celle singole, coppie, catene, gruppi e cluster) (1, 3).
Figura 2: Schema del protocollo di colorazione di Gram. La colonna di sinistra mostra come reagiscono i batteri Gram-negativi in ogni fase del protocollo. La colonna di destra mostra come reagiscono i batteri Gram-positivi. Inoltre, sono mostrate due tipiche forme di cellule batteriche: i bacilli (o bastoncelli) e i cocchi (o sfere).
Figura 3: Risultati della colorazione di Gram. Una macchia di Gram di una miscela di Staphylococcus aureus (cocchi viola Gram-positivi) ed Escherichia coli (barre rosse Gram-negative).
Alcuni batteri producono uno strato esterno viscoso extracellulare chiamato capsula (3, 5). Le capsule sono strutture protettive con varie funzioni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'aderenza a superfici e altri batteri, la protezione dall'essiccazione e la protezione dalla fagocitosi. Le capsule sono tipicamente composte da polisaccaridi contenenti più del 95% di acqua, ma alcune possono contenere polialcoli e poliammine (5). A causa della loro composizione per lo più non ionica e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzionano con la capsula; invece, la colorazione della capsula utilizza una tecnica di colorazione negativa che macchia le cellule e lo sfondo, lasciando la capsula come un alone chiaro intorno alle cellule (1, 3) (Figura 4). La colorazione della capsula comporta la spalma di un campione batterico in una macchia acida su un vetrino per microscopio. A differenza della colorazione di Gram, lo striscio batterico non viene fissato termicamente durante una colorazione della capsula. Il fissaggio del calore può interrompere o disidratare la capsula, portando a falsi negativi (5). Inoltre, il fissaggio termico può ridurre le celle con conseguente pulizia intorno alla cellula che può essere scambiata per una capsula, portando a falsi positivi (3). La macchia acida colora lo sfondo della diapositiva; mentre segue con una macchia di base, Crystal Violet, colora le cellule batteriche stesse, lasciando la capsula incontaminata e apparendo come un alone chiaro tra le cellule e lo sfondo del vetrino (Figura 5). Tradizionalmente, l'inchiostro indiano è stato usato come macchia acida perché queste particelle non possono penetrare nella capsula. Pertanto, né la capsula né la cellula sono macchiate dall'inchiostro dell'India; invece, lo sfondo è macchiato. Congo Red, Nigrosin o Eosin possono essere utilizzati al posto dell'inchiostro indiano. La colorazione della capsula può aiutare i medici a diagnosticare le infezioni batteriche quando si guardano le colture dai campioni dei pazienti e guidare il trattamento appropriato del paziente. Le malattie comuni causate da batteri incapsulati includono polmonite, meningite e salmonellosi.
Figura 4: Schema del protocollo di colorazione della capsula. Il pannello superiore mostra lo striscio di scorrimento prima di qualsiasi applicazione di macchia. Il pannello centrale mostra come la diapositiva e i batteri si occupano della macchia primaria, Congo Red. Il pannello finale mostra come il vetrino e i batteri si occupano della controcolorazione, Crystal Violet.
Figura 5: Risultati della colorazione della capsula. Colorazione della capsula di Acinetobacter baumannii incapsulato (indicato con frecce nere) e Escherichia coli non incapsulato (indicato con frecce bianche). Si noti che lo sfondo è scuro e le cellule di A. baumannii sono macchiate di viola. La capsula intorno alle cellule di A. baumannii è evidente come un alone, mentre E. coli non ha alone.
In condizioni avverse (ad esempio limitazione dei nutrienti, temperature estreme o disidratazione), alcuni batteri producono endospore, strutture metabolicamente inattive resistenti ai danni fisici e chimici (1, 2, 8, 9). Le endospore consentono al batterio di sopravvivere a condizioni difficili proteggendo il materiale genetico delle cellule; una volta che le condizioni sono favorevoli alla crescita, le spore germinano e la crescita batterica continua. Le endospore sono difficili da macchiare con le tecniche di colorazione standard perché sono impermeabili ai coloranti tipicamente utilizzati per la colorazione (1, 9). La tecnica abitualmente utilizzata per macchiare le endospore è il Metodo Schaeffer-Fulton (Figura 6),che utilizza la macchia primaria Malachite Green, una macchia solubile in acqua che si lega relativamente debolmente al materiale cellulare, e il calore, per consentire alla macchia di sfondare la corteccia della spora (Figura 7). Questi passaggi colorano le cellule in crescita (denominate cellule vegetative nel contesto della biologia delle endospore), così come le endospore e le eventuali spore libere (quelle che non sono più all'interno del precedente involucro cellulare). Le cellule vegetative vengono lavate con acqua per rimuovere Malachite Green; le endospore trattengono la macchia a causa del riscaldamento del verde malachite all'interno della spora. Infine, le cellule vegetative sono controbattete con Safranin per visualizzare (Figura 8). La colorazione per le endospore aiuta a differenziare i batteri in formatori di spore e formatori non sporici, oltre a determinare se le spore sono presenti in un campione che, se presente, potrebbe portare a contaminazione batterica al momento della germinazione.
Figura 6: Schema del protocollo di colorazione delle endospore. La colonna di sinistra mostra come reagiscono i batteri che formano spore in ogni fase del protocollo. La colonna di destra mostra come reagiscono i batteri che non formano spore.
Figura 7: Diagramma della struttura delle endospore. Cellula batterica contenente un'endospora con le varie strutture sporiche etichettate.
Figura 8: Risultati della colorazione delle endospore. Una colorazione tipica delle endospore di Bacillus subtilis. Le cellule vegetative (indicate con le frecce bianche) sono macchiate di rosso, mentre le endospore (denotate con le frecce nere) sono macchiate di verde.
1. Colorazione del grammo
2. Colorazione della capsula
3. Colorazione delle endospore (metodo Schaeffer-Fulton)
I batteri sono organismi viventi microscopici che hanno molte caratteristiche distintive come la forma, la disposizione delle cellule, se producono o meno capsule e se formano spore. Queste caratteristiche possono essere tutte visualizzate colorando e aiutando nell'identificazione e classificazione di diverse specie batteriche.
Per esaminare le prime due caratteristiche della forma e della disposizione cellulare, possiamo usare una semplice tecnica chiamata colorazione di Gram. Qui, il viola cristallino viene applicato ai batteri, che sono stati fissati a calore su un vetrino. Successivamente, la soluzione di iodio di Gram viene aggiunta al vetrino, con conseguente formazione di un complesso insolubile tra il viola cristallino e la soluzione di iodio di Gram. Viene quindi applicato un decolorante e qualsiasi batterio con uno spesso strato di peptidoglicano macchierà di viola, poiché questo strato non è facilmente penetrato dal decolorante. Questi batteri sono indicati come Gram positivi.
I batteri Gram negativi hanno uno strato di peptidoglicano più sottile e smacchiano il decolorante, perdendo il colore viola. Tuttavia, si macchiano di rosa rossastro quando viene aggiunta una macchia di contatore di safranina, che si lega a uno strato di lipopolisaccaride all'esterno. Una volta macchiate, le cellule possono essere osservate per morfologia, dimensioni e disposizione, ad esempio in catene o grappoli, che aiuta ulteriormente nella classificazione e nell'identificazione.
Un'altra tecnica utile nel toolkit del microbiologo è la colorazione della capsula, utilizzata per visualizzare le capsule esterne che circondano alcuni tipi di cellule batteriche. A causa della composizione non ionica delle capsule e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzioneranno. Invece, viene utilizzata una tecnica di colorazione negativa, che prima macchia lo sfondo con un colorante acido, come il rosso Congo, prima che le cellule batteriche siano macchiate di viola cristallino. Questo lascia qualsiasi capsula presente come un alone chiaro intorno alle cellule.
L'ultima importante tecnica di colorazione qui trattata può aiutare a determinare se i batteri studiati formano spore. In condizioni avverse, alcuni batteri producono endospore, strutture dormienti, dure, non riproduttive, la cui funzione primaria è quella di garantire la sopravvivenza dei batteri attraverso periodi di stress ambientale, come temperature estreme o disidratazione. Tuttavia, non tutte le specie batteriche producono endospore e sono difficili da macchiare con tecniche standard perché sono impermeabili a molti coloranti. Il metodo Schaeffer-Fulton utilizza la macchia verde malachite, che viene applicata ai batteri fissati a un vetrino. Lo scivolo viene quindi lavato con acqua prima di essere contromaccato con safranina. Le cellule vegetative appariranno rosso-rosate, mentre le eventuali endospore presenti appariranno verdi. In questo video, imparerai come eseguire queste comuni tecniche di colorazione batterica e quindi esaminare i campioni di colorazione utilizzando la microscopia ottica.
Per iniziare la procedura, legare i capelli lunghi e indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui un camice da laboratorio e guanti.
Quindi, pulire un vetrino per microscopio fresco con una salvietta di laboratorio. Successivamente, pipettare 10 microlitri di 1X fosfato tamponato soluzione salina sul primo vetrino. Quindi, utilizzare una punta di pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare la colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Impostare la diapositiva sul piano di lavoro e lasciarla asciugare completamente all'aria.
Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per riscaldare i batteri. Usando le pinze, passare la slitta attraverso la fiamma del bruciatore più volte, con i batteri a lato verso l'alto, facendo attenzione a non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo, il che potrebbe distorcere le cellule.
Ora, lavorando sopra il lavandino, tenere premuto il livello della diapositiva e applicare diverse gocce di viola cristallo di Gram per coprire completamente lo striscio batterico e quindi, posizionare lo scivolo sulla panca per riposare per 45 secondi. Quindi, tenere la diapositiva ad angolo e spruzzare delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente lo striscio batterico. Ora, tenendo di nuovo il livello del vetrino, applicare la soluzione di iodio di Gram per coprire completamente i batteri macchiati e quindi lasciarlo riposare per altri 45 secondi. Quindi, risciacquare accuratamente lo iodio dal vetrino, come mostrato in precedenza. Tenendo la diapositiva ad angolo, aggiungere alcune gocce di decolorante di Gram alla diapositiva, permettendole di scorrere sui batteri macchiati, solo fino a quando il deflusso è chiaro, per circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come mostrato in precedenza. Ciò limiterà l'eccessiva decolorazione dello striscio. Quindi, tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare la contromacchia di safranina di Gram per coprire completamente i batteri macchiati. Dopo 45 secondi, sciacquare delicatamente la safranina dalla diapositiva con acqua, come mostrato in precedenza, e quindi asciugare con carta assorbente.
Infine, aggiungere una goccia di olio di immersione direttamente al vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con una lente ad olio 100X.
Per iniziare questo protocollo di colorazione, prima indossare il corretto dispositivo di protezione individuale e quindi assicurarsi che i vetrini che verranno utilizzati siano puliti.
Quindi, preparare le soluzioni. Per produrre una soluzione viola cristallina all'1%, mescolare 0,25 grammi di polvere viola cristallina con 25 millilitri di acqua distillata e vortice fino a quando non si scioglie. Quindi, preparare la soluzione rossa congolese all'1% mescolando 0,25 grammi di polvere rossa congolese con 25 millilitri di acqua distillata e vortice fino a quando non si scioglie. Ora, pipettare 10 microlitri della soluzione rossa del Congo sulla diapositiva. Utilizzando una punta della pipetta pulita e sterile, selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Quindi, spalmare la colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme. Asciugare completamente all'aria il vetrino batterico per 5-7 minuti. Una volta che la diapositiva è asciutta, inondare lo striscio con abbastanza 1% di cristallo viola per coprire lo striscio e lasciarlo riposare per 1 minuto. Ora, tieni la diapositiva ad angolo e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente i batteri. Continuare a tenere la diapositiva con un angolo di 45 gradi fino a completa asciugazione all'aria. Infine, aggiungere una goccia di olio per immersione direttamente al vetrino e quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a olio 100X.
Per eseguire la colorazione delle endospore, in primo luogo, preparare una soluzione verde di malachite allo 0,5% mescolando 0. 125 grammi di polvere verde malachite con 25 millilitri di acqua distillata, quindi vortice la soluzione fino a quando non si scioglie. Successivamente, pipettare 10 microlitri di 1X PBS sul centro della diapositiva. Quindi, utilizzare una punta di pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare i batteri nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Ora, imposta la diapositiva sul piano di lavoro e lasciala asciugare completamente all'aria. Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per riscaldare i batteri. Passare la diapositiva attraverso la fiamma del bruciatore blu più volte, con il lato dei batteri rivolto verso l'alto. Quindi, una volta che la diapositiva si è raffreddata, posizionare un pezzo di carta per lenti pretagliata sopra lo striscio fissato a caldo. Quindi, accendere una piastra riscaldatrice fino all'impostazione più alta e portare a ebollizione un becher d'acqua.
Saturare la carta della lente con la soluzione verde malachite e, usando le pinze, posizionare il vetrino sopra il becher di acqua bollente a vapore per 5 minuti. Mantenere la carta delle lenti umida aggiungendo più colorante, una goccia alla volta, se necessario. Quindi, di nuovo usando le pinze, prendi la diapositiva dal becher e rimuovi e scarta la carta per lenti. Lasciare raffreddare la diapositiva per 2 minuti. Lavorando sopra il lavandino, tenere la diapositiva ad angolo e spruzzare delicatamente un flusso d'acqua sulla parte superiore dello scivolo. Ora, tenere premuto il livello del vetrino e applicare la safranina per coprire completamente la diapositiva. Quindi, lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, tenere la diapositiva ad angolo e risciacquare come mostrato in precedenza. Lasciare asciugare all'aria la diapositiva sul piano di lavoro. Infine, aggiungere una goccia di olio per immersione direttamente al vetrino, quindi esaminare il vetrino con un microscopio ottico, con un obiettivo olio 100X.
Nel protocollo di colorazione Gram, possono risultare due diverse macchie colorate. La colorazione viola scuro indica che i batteri sono Gram-positivi e che hanno mantenuto la macchia viola cristallina. Al contrario, la colorazione rosa-rossastra è una caratteristica dei batteri Gram-negativi, che invece saranno colorati dalla macchia del contatore di safranin. Inoltre, diverse forme e disposizioni dei batteri possono essere visualizzate dopo la colorazione di Gram. Ad esempio, è possibile differenziare i Cocchi, o batteri rotondi, dai Bacillus a forma di bastoncello, o identificare i batteri che formano fili, rispetto a quelli che tipicamente si aggregano come grumi o si verificano da solo.
In un'immagine al microscopio macchiata di capsula, le cellule batteriche saranno in genere macchiate di viola e lo sfondo del vetrino dovrebbe essere macchiato di scuro. Su questo sfondo scuro, le capsule dei batteri, se presenti, appariranno come un alone chiaro intorno alle cellule.
Infine, nella colorazione delle endospore, le cellule vegetative saranno macchiate di rosso dalla macchia del contatore di safranina. Se le endospore sono presenti nel campione, queste manterranno la macchia verde malachite e appariranno di colore verde-bluastro.
I batteri sono organismi viventi microscopici che hanno molte caratteristiche distintive come la forma, la disposizione delle cellule, se producono o meno capsule e se formano spore. Queste caratteristiche possono essere visualizzate mediante colorazione e aiutano nell'identificazione e nella classificazione di diverse specie batteriche.
Per esaminare le prime due caratteristiche della forma e della disposizione delle cellule, possiamo utilizzare una semplice tecnica chiamata colorazione di Gram. Qui, il cristallovioletto viene applicato ai batteri, che sono stati fissati a caldo su un vetrino. Successivamente, la soluzione di iodio di Gram viene aggiunta al vetrino, con conseguente formazione di un complesso insolubile tra il cristallovioletto e la soluzione di iodio di Gram. Viene quindi applicato un decolorante e tutti i batteri con uno spesso strato di peptidoglicano si colorano di viola, poiché questo strato non è facilmente penetrabile dal decolorante. Questi batteri sono indicati come Gram-positivi.
I batteri Gram-negativi hanno uno strato di peptidoglicano più sottile e decolorano il decolorante, perdendo il colore viola. Tuttavia, si colorano di rosa-rossastro quando viene aggiunto un controcolorante di safranina, che si lega a uno strato di lipopolisaccaride all'esterno. Una volta colorate, le cellule possono essere osservate per morfologia, dimensioni e disposizione, ad esempio in catene o grappoli, il che aiuta ulteriormente nella classificazione e nell'identificazione.
Un'altra tecnica utile nel kit di strumenti del microbiologo è la colorazione della capsula, utilizzata per visualizzare le capsule esterne che circondano alcuni tipi di cellule batteriche. A causa della composizione non ionica della capsula e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzioneranno. Invece, viene utilizzata una tecnica di colorazione negativa, che prima colora lo sfondo con un colorante acido, come il rosso Congo, prima che le cellule batteriche vengano colorate con cristallovioletto. Questo lascia qualsiasi capsula presente come un alone chiaro intorno alle cellule.
L'ultima tecnica di colorazione principale qui trattata può aiutare a determinare se i batteri studiati formano spore. In condizioni avverse, alcuni batteri producono endospore, strutture dormienti, dure e non riproduttive la cui funzione primaria è quella di garantire la sopravvivenza dei batteri durante periodi di stress ambientale, come temperature estreme o disidratazione. Tuttavia, non tutte le specie batteriche producono endospore e sono difficili da colorare con le tecniche standard perché sono impermeabili a molti coloranti. Il metodo Schaeffer-Fulton utilizza la colorazione verde malachite, che viene applicata ai batteri fissati a un vetrino. Il vetrino viene quindi lavato con acqua prima di essere controcolorato con Safranin. Le cellule vegetative appariranno rosso-rosate, mentre le eventuali endospore presenti appariranno verdi. In questo video imparerai come eseguire queste comuni tecniche di colorazione batterica e quindi esaminerai i campioni di colorazione utilizzando la microscopia ottica.
Per iniziare la procedura, lega i capelli lunghi e indossa i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui camice da laboratorio e guanti.
Quindi, pulire un vetrino da microscopio nuovo con una salvietta da laboratorio. Quindi, pipettare 10 microlitri di soluzione fisiologica tamponata con fosfato 1X sul primo vetrino. Quindi, utilizzare una punta per pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare la colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Posizionare lo scivolo sul piano di lavoro e lasciarlo asciugare completamente all'aria.
Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per fissare i batteri a caldo. Utilizzando le pinze, passare più volte il vetrino attraverso la fiamma del bruciatore, con i batteri rivolti verso l'alto, facendo attenzione a non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo, che potrebbe distorcere le celle.
Ora, lavorando sopra il lavandino, tenere il vetrino in piano e applicare diverse gocce di cristallovioletto di Gram per coprire completamente lo striscio batterico, quindi posizionare il vetrino sul banco in posa per 45 secondi. Quindi, tieni il vetrino inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore del vetrino, facendo attenzione a non spruzzare direttamente lo striscio batterico. Ora, tenendo di nuovo il vetrino in piano, applicare la soluzione di iodio di Gram per coprire completamente i batteri macchiati e poi lasciarla riposare per altri 45 secondi. Successivamente, sciacquare accuratamente lo iodio dal vetrino, come mostrato in precedenza. Tenendo il vetrino inclinato, aggiungere alcune gocce di decolorante di Gram al vetrino, lasciandolo scorrere sui batteri macchiati, fino a quando il deflusso non è chiaro, per circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come mostrato in precedenza. Ciò limiterà l'eccessiva decolorazione dello striscio. Quindi, tenendo nuovamente il vetrino a livello, applicare il colorante di contrasto alla safranina di Gram per coprire completamente i batteri macchiati. Dopo 45 secondi, sciacquare delicatamente la safranina dallo scivolo con acqua, come mostrato in precedenza, e poi asciugare con carta assorbente.
Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con una lente obiettivo a olio 100X.
Per iniziare questo protocollo di colorazione, indossare prima i dispositivi di protezione individuale corretti e poi assicurarsi che i vetrini che verranno utilizzati siano puliti.
Quindi, prepara le soluzioni. Per ottenere una soluzione di cristallovioletto all'1%, mescolare 0,25 grammi di polvere di cristallovioletto con 25 millilitri di acqua distillata e agitare fino a dissoluzione. Quindi, preparare una soluzione di rosso Congo all'1% mescolando 0,25 grammi di polvere rossa del Congo con 25 millilitri di acqua distillata e agitare fino a quando non si sarà sciolto. Ora, pipettare 10 microlitri di soluzione di rosso Congo sul vetrino. Utilizzando un puntale per pipetta pulito e sterile, selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Quindi, spalmare la colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme. Asciugare completamente all'aria il vetrino batterico per 5-7 minuti. Una volta che il vetrino è asciutto, inondare lo striscio con una quantità sufficiente di cristallovioletto all'1% per coprire lo striscio e lasciarlo riposare per 1 minuto. Ora, tieni lo scivolo inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente i batteri. Continuare a tenere il vetrino a un angolo di 45 gradi fino a completa asciugatura all'aria. Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a olio 100X.
Per eseguire la colorazione con endospore, preparare innanzitutto una soluzione di verde malachite allo 0,5% mescolando 0. 125 grammi di polvere verde di malachite con 25 millilitri di acqua distillata, quindi agitare la soluzione fino a quando non si scioglie. Quindi, pipettare 10 microlitri di 1X PBS al centro del vetrino. Quindi, utilizzare una punta per pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare i batteri nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Ora, posiziona lo scivolo sul piano di lavoro e lascialo asciugare completamente all'aria. Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per fissare i batteri a caldo. Passare più volte il vetrino attraverso la fiamma blu del bruciatore, con il lato dei batteri rivolto verso l'alto. Quindi, una volta che il vetrino si è raffreddato, posizionare un pezzo di carta per lenti pretagliata sopra la macchia fissata a caldo. Quindi, accendi una piastra al massimo e porta a ebollizione un bicchiere d'acqua.
Saturare la carta per lenti con la soluzione di verde malachite e, utilizzando una pinza, posizionare il vetrino sopra il bicchiere di acqua bollente a cuocere a vapore per 5 minuti. Mantieni umida la carta per lenti aggiungendo altro colorante, una goccia alla volta, se necessario. Quindi, sempre usando le pinze, prelevare il vetrino dal becher e rimuovere e gettare la carta per lenti. Lasciare raffreddare il vetrino per 2 minuti. Lavorando sopra il lavandino, tieni lo scivolo inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo. Ora, tieni premuto il vetrino a livello e applica Safranin per coprire completamente il vetrino. Quindi, lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, tenere il carrello inclinato e risciacquare come mostrato in precedenza. Lasciare asciugare lo scivolo all'aria sul piano di lavoro. Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino con un microscopio ottico, con un obiettivo a olio 100X.
Nel protocollo di colorazione di Gram, possono risultare due macchie di colore diverso. La colorazione viola scuro indica che i batteri sono Gram-positivi e che hanno mantenuto la colorazione cristallovioletta. Al contrario, la colorazione rosa-rossastra è una caratteristica dei batteri Gram-negativi, che invece saranno colorati dalla controcolorazione Safranina. Inoltre, dopo la colorazione di Gram è possibile visualizzare diverse forme e disposizioni dei batteri. Ad esempio, è possibile differenziare i Cocchi, o batteri rotondi, dai Bacillus a forma di bastoncello, o identificare i batteri, che formano filamenti, rispetto a quelli che tipicamente si aggregano come grumi o si verificano singolarmente.
In un'immagine al microscopio colorata con capsula, le cellule batteriche saranno tipicamente colorate di viola e lo sfondo del vetrino dovrebbe essere colorato in modo scuro. Su questo sfondo scuro, le capsule dei batteri, se presenti, appariranno come un chiaro alone attorno alle cellule.
Infine, nella colorazione con endospore, le cellule vegetative saranno colorate di rosso dalla controcolorazione safranina. Se nel campione sono presenti endospore, queste manterranno la macchia verde malachite e appariranno di colore verde-bluastro.
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