Name: Stampa microcontatto di proteine per Cell Biology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Impara la stampa microcontatto di proteine per la biologia cellulare utilizzando fibronectina su vetro. Questa tecnica consente di ricreare ambienti extracellulari complessi per studiare l'adesione cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Preparazione delle soluzioni e dei materiali Questi passaggi devono essere effettuati diversi giorni di anticipo. <ol><li> Vetrini coprioggetto. Coprioggetto sono stati puliti per immersione per 10 minuti in una soluzione di detersivo Linbro 7X: acqua, mescolata ad un 1: 3 ratio e riscaldato, mescolando, fino a non toccare. Coprioggetto sono stati ampiamente sciacquati con acqua deionizzata, e poi cotto al forno a 450 ° C per 6 ore. Caricamento coprioggetto in rack colorazione ceramica (vedi reagenti) semplificato questo processo. </li><li> Soluzione proteica per stampaggio. Ricostituire fibronectina seguendo le istruzioni del produttore per una soluzione madre di 1 mg / ml di concentrazione. </li></ol> 2. Cast francobolli dal master topologico Questi passaggi possono essere eseguiti diversi giorni di anticipo. Francobolli negozio modello-up in un piatto coperto, come un piatto di coltura di tessuti. <ol><li> Rimuovere la polvere dal master utilizzando un flusso di compressa, aria filtrata o gas inerte. </li><li> Posizionare il, lato master fantasia alto, sul fondo di un piatto di plastica appena superiore a quella del maestro. 60 - o 100 mm piatti coltura tissutale sono adatte per questo scopo. </li><li> In un tubo di polistirene da 50 ml centrifuga, combinare i componenti Sylgard con un rapporto di catalizzatore: elastomero di base di 1: 10 in peso. Mescolare accuratamente con un dispositivo di plastica, come una pipetta monouso. Preparare almeno 0,2 ml di elastomero per centimetro quadrato di area piatto. </li><li> Centrifugare il tubo da 50 ml a 300 g per 5 minuti per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Versare l&#39;elastomero sopra il maestro, poi posto in un essiccatore, sotto vuoto, per 30 minuti. </li><li> Curare l&#39;elastomero in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore. Polimerizzazione a temperature più elevate e più a lungo i risultati in tempi più rigido elastomero. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Separare il foglio di francobolli dal master. </li></ol> 3. Stampa microcontact della fibronectina su vetro <ol><li> Tagliare un unico timbro. Francobolli di misura 4 mm x 4 mm a 1 cm x 1 cm in area e 1 - 2 mm di spessore sono più facili per iniziare. Luogo lato modello su un vetrino o un piatto di plastica di piccole dimensioni. </li><li> Posto timbro e un detersivo plasma, e di processo, sotto vuoto, per 30 secondi. Un Harrick scientifico plasma pulito (vedi attrezzature), impostare l&#39;impostazione di massima di uscita renderà la superficie PDMS idrofila. Risultato più volte la rottura del elastomero. </li><li> Diluire la soluzione fibronectina con acqua deionizzata ad una concentrazione stampaggio di 50 mg / ml. </li><li> Mettere una piccola goccia (10 - 50 ml) di stampaggio soluzione sul timbro. Si diffonderà su tutta la superficie idrofila. Aggiungi unica soluzione sufficiente che la caduta di coprire il timbro, ma non travolto i bordi. Lasciate assorbire le proteine ​​di bollo per 5 minuti. </li><li> Utilizzando un Kimwipe ® o su altri tessuti carta pulita, stoppino via la maggior parte della soluzione proteica dal timbro, senza toccare la regione fantasia. </li><li> Asciugare la soluzione rimanente dal timbro sotto un flusso di aria pulita, asciutta, gas inerte, come l&#39;azoto. </li><li> Utilizzando le pinzette, rimuovere il timbro dal vetrino, invertire, e mettere in contatto con il coprioggetto di vetro pulito (la superficie da fantasia). Mettere un peso sopra per promuovere un buon contatto. Il peso specifico che offre la migliore patterning dipende dalla dimensione del timbro e modello; iniziare con un peso di 5 g, e regolare tra stampati. Lascia timbro in contatto con la superficie per 1 minuto. </li><li> Con attenzione smontare la pila, e il timbro separato da coprioggetto. </li><li> Vigorosamente sciacquare il coprioggetto fantasia in PBS, seguita da acqua deionizzata, per rimuovere le proteine ​​che non è assorbito in superficie. Coprioggetto secco sotto corrente di azoto. </li></ol> Rappresentante Risultati Stampa microcontact è un potente processo di patterning molecole su superfici. Questo processo ha la capacità di creare funzioni con dimensioni che vanno da decine di micrometri a centinaia di nanometri, in fig. 1A, il logo a sinistra sono ogni 200 micron di altezza, mentre le macchie verdi illustrato nella fig. 1B sono 1 micron di diametro e distanziati ad intervalli di 4 micron, misurato da centro a centro. Fig. 1B illustra anche una proprietà potente di stampa microcontact, cioè che è e di processo additivo. Vari cicli di stampa microcontact può essere applicato a una singola superficie per creare sistemi multicomponente 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Figura A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Figura B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Il processo di stampa microcontact è concettualmente semplice e molto robusto, essendo stata applicata a patterning una vasta gamma di molecole su una varietà di substrati. Tuttavia, questo processo rimane qualcosa di un&#39;arte. La geometria specifica del modello da creare, le proteine ​​per essere modellata, peso applicato, e di rivestimento / condizioni di stampaggio tutti influiscono sulla qualità di stampaggio. Per esempio, troppo poco peso, applicata a funzioni di grandi dimensioni, si traduce spesso in lacune nel modello di come si ...

<table><tbody><tr><td>Pulitore al plasma</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Kit per etichettatura delle proteine</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Portaoggetti per colorazione</td><td>Reagente</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Reagente</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Reticolo di diffrazione</td><td>Reagente</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

stampa microcontatto di proteine ​​per cell biology

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

La capacità di proteine ​​modello e altre biomolecole su substrati è importante per catturare la complessità spaziale dell&#39;ambiente extracellulare. Sviluppo della stampa microcontatto dal gruppo Whitesides (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) A metà degli anni 1990 rivoluzionato questo campo facendo microelettronica / tecniche di microfabbricazione accessibile ai laboratori focalizzati sulle scienze della vita. Implementazioni iniziali di questo metodo utilizzato polidimetilsilossano (PDMS) francobolli per creare modelli di prodotti chimici sulle superfici funzionalizzate materiale<sup&gt; 1</sup&gt;. Da allora, una serie di approcci innovativi sono stati sviluppati per altre molecole modello, comprese le proteine<sup&gt; 2</sup&gt;. Questo video mostra il processo di base della creazione di timbri PDMS e li utilizza per le proteine ​​modello, in quanto questi passaggi sono difficili da esprimere con precisione a parole. Ci concentriamo su patterning la proteina della matrice extracellulare fibronectina sul coprioggetto di vetro come un esempio specifico di patterning. Una componente importante del processo di stampa microcontact è un maestro topologica, da cui sono espressi i francobolli, le regioni sollevato e abbassato del maestro si specchiano nel timbro e definire il modello finale. Tipicamente, un maestro è costituito da un wafer di silicio ricoperto di photoresist e poi modellata da fotolitografia come è fatto qui. Creazione di master contenente un modello specifico richiede attrezzature specializzate, ed è meglio affrontato in collaborazione con un centro di fabbricazione o struttura. Tuttavia, quasi ogni tipo di superficie con topologia può essere utilizzato come un maestro, come reticoli di diffrazione di plastica (vedi Reagenti per un esempio), e tali maestri fortuita fornire prontamente disponibili, i modelli semplici. Questo protocollo inizia al punto di avere un master in mano.

Stampa microcontact viene utilizzato estensivamente alle proteine ​​modello e altre molecole sulle superfici dei materiali. Dimostriamo i passaggi fondamentali di questo processo, stampaggio modelli di fibronectina su vetro.

Stampa microcontatto di proteine ​​per Cell Biology

La capacità di depositare proteine e altre biomolecole in pattern su substrati è fondamentale per catturare la complessità spaziale dell'ambiente extracellulare. ...

La stampa microcontatto viene utilizzata per creare schemi di proteine e altre molecole sulle superfici dei materiali, al fine di riprodurre la complessità degli ambienti extracellulari. Per iniziare la stampa microcontatto, si crea un master topologico e successivamente si utilizza la litografia morbida per ottenere un timbro dal master in Sylgard. Il timbro può essere rivestito con proteine e quindi utilizzato per trasferire le proteine su una nuova superficie sulla quale le cellule possono aderire.Ciao, mi chiamo Chen. Sono del laboratorio del dottor Lance Camp di ingegneria biomedica della Columbia University. Ciao, sono GT del Dipartimento di Ingegneria Meccanica.Ciao, sono Lance Kem del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Columbia University. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come le cellule rispondono a disposizioni complesse di proteine nel loro ambiente extracellulare. Questa tecnica è stata sviluppata a metà degli anni '90 nel laboratorio di George Whitesides ed è diventata uno strumento ampiamente utilizzato e prezioso.Esistono numerose varianti di questa tecnica, ma oggi G e Co U illustreranno il processo di base della microstampa p

microcontact-printing-of-proteins-for-cell-biology

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Una descrizione dei metodi utilizzati per convertire un HP DeskJet 500 stampante in un bioprinter. La stampante è in grado di elaborare le cellule viventi, che provoca transitori pori nella membrana. Questi pori possono essere utilizzati per incorporare piccole molecole, tra cui fluorescente G-actina e nelle cellule stampati.

Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d&#39;inchiostro standard

Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Questa tecnologia di stampa microfluidica 3D stampa array di cellule su superfici sommerse.  Descriviamo come gli array di cellule vengono erogati microfluidicamente in celle a flusso 3D su superfici sommerse.  Stampando su superfici sommerse, sono stati prodotti microarray cellulari che consentono lo screening dei farmaci e la valutazione della citotossicità in una moltitudine di aree.

La stampa Sommerso di celle su una superficie modificata utilizzando un flusso di Microspotter continua

I substrati di coltura cellulare funzionalizzati con modelli su microscala di ligandi biologici hanno un'immensa utilità nel campo dell'ingegneria tissutale. Qui, dimostriamo la produzione versatile e automatizzata di substrati di coltura tissutale con spazzole multiple di poli(glicole etilenico) microstrutturate che presentano sostanze chimiche ortogonali che consentono l'immobilizzazione spazialmente precisa e sito-specifica di ligandi biologici.

Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

Questo rapporto descrive una tecnica semplice e facile da eseguire, utilizzando il vuoto a bassa pressione, per riempire canali microfluidici con cellule e substrati per la ricerca biologica.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Il nostro obiettivo generale è quello di capire come le cellule percepiscono segnali extracellulari che portano alla crescita assonale diretta. Qui, descriviamo la metodologia dell'adsordimento molecolare delle proteine indotta dalla luce, utilizzata per produrre micromodelli definiti di componenti della matrice extracellulare al fine di studiare eventi specifici che regolano la crescita degli assoni e la ricerca del percorso.

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Tradizionalmente, la coltura cellulare viene eseguita su substrati planari che imitano male l'ambiente naturale delle cellule in vivo. Qui descriviamo un metodo per produrre substrati di coltura cellulare con geometrie curve fisiologicamente rilevanti e proteine extracellulari micropatternate, consentendo indagini sistematiche sul rilevamento cellulare di questi segnali extracellulari.

Generazione di microambienti cellulari multicue mediante fotopatterning UV di substrati tridimensionali di colture cellulari

Impara la stampa microcontatto di proteine per la biologia cellulare utilizzando fibronectina su vetro. Questa tecnica consente di ricreare ambienti extracellulari complessi per studiare l'adesione cellulare.

Stampa microcontatto di proteine ​​per Cell Biology

Esplora altri video

Stampa microcontatto di proteine per Cell Biology