Name: Photo-Induced Cross-Linking delle proteine non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Impara la tecnica PICUP per analizzare la distribuzione delle dimensioni degli oligomeri di peptidi amiloidogenici. Questo metodo biochimico consente di studiare le proprietà strutturali delle proteine coinvolte nelle malattie neurodegenerative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni AG027818 e AG030709 dal NIH / NIA, 2005/2E dalla L. Larry Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 dall&#39;Associazione Alzheimer, e 07-65798 dalla California Department of Public Health.

1. Peptide preparazione <ol><li> Pesare ~ 100-200 mg di peptide liofilizzato utilizzando una microbilancia e trasferimento in etichetta, siliconato, a basso adsorbente tubi microcentrifuga. Qui, usiamo le sequenze umano di Aβ40, Aβ42, calcitonina, e GRF. </li><li> Qui, usiamo peptidi pre-trattati con 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) per ottenere omogeneo, aggregato senza preparazioni. Questo passaggio è necessario perché preformato aggregati indurre una rapida aggregazione di proteine ​​amiloidogenica, che si traducono in scarsa riproducibilità tra esperimenti 5. Altri metodi, quali il filtraggio e la SEC può anche essere utilizzato per ottenere aggregati privi preparativi per PICUP 6. </li><li> Per trattare i peptidi con HFIP, pre-chill contenitore HFIP sul ghiaccio all&#39;interno di una cappa aspirante indossando una protezione adeguata (HFIP è volatile e tossico). Raffreddamento di una bottiglia da 250 ml in genere richiede 10-15 minuti. Aggiungi HFIP di pre-raffreddata provette contenenti lyophilizates peptide per ottenere una concentrazione nominale peptide di 0,5 mm. </li><li> Sonicare le soluzioni peptide in un bagnomaria ultrasuoni per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Vortex delicatamente e incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Freddo i tubi in ghiaccio (per 1 min), e dividere le soluzioni in 10-50-microlitri aliquote in etichetta 0,6 ml basso adsorbente tubi. </li><li> Rimuovere HFIP per evaporazione sotto leggera corrente di azoto, o lasciare i tubi aperti nella cappa durante la notte. Per evaporazione durante la notte, il luogo tubi aperti in un rack e coprire con un grande foglio di Kimwipes per evitare che polvere e contaminazioni particolato. </li><li> Essiccare il HFIP rimanenti nel vuoto in un liofilizzatore, o un concentratore centrifugo per 30 minuti, o in un exsiccator collegato a un ingresso vuoto per 2 ore Il prodotto finale sarà un film peptide sul fondo dei tubi microcentrifuga. Se opportunamente essiccate, i tubi possono essere conservati a tenuta d&#39;aria per lunghi periodi (mesi) a -20 e -80 ° C. </li></ol> 2. Solubilizzante il HFIP trattati con peptidi e foto di cross-linking <ol><li> Prima solubilizzante il HFIP trattati con peptidi per il cross-linking reazioni, bisogna preparare il cross-linking e reagenti di raffreddamento. </li><li> Pesare persolfato di ammonio (APS, il signor 228,2 g / mol) e preparare una soluzione di 20 mM a 10 mM fosfato di sodio, pH 7.4. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Preparare soluzione 1 mM di Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) esaidrato (RuBpy, il signor 748,63 g / mol) in 10 mM fosfato di sodio, pH 7.4. Mescolare con un vortice e verificare la completa dissoluzione. Proteggere il tubo dalla luce con un foglio di alluminio. </li><li> Per SDS-PAGE seguente analisi cross-linking, un reagente tempra conveniente è del 5% β-mercaptoetanolo in 2 × SDS-PAGE tampone del campione. In alternativa, 1 M ditiotreitolo (DTT, il signor 154,5 g / mol) in acqua deionizzata o un buffer adatto può essere usato. </li><li> HFIP trattati con film peptide sono sciolti in NaOH diluito e poi tampone fosfato di sodio viene aggiunto per ottenere la concentrazione del peptide ~ 30 micron. Aggiungere 60 mM NaOH seguito da acqua deionizzata nella provetta contenente il film peptide tale che NaOH e acqua costituiscono il 10 e il 45% del volume finale, rispettivamente. Raschiare il film peptide fuori le pareti interne della provetta da microcentrifuga usando la punta, mescolare pipettando su e giù, e ultrasuoni per 5 minuti in un bagnomaria ultrasuoni. </li><li> Aggiungere il 45% di fosfato di sodio 20 mM, pH 7,4, mescolare pipettando, e centrifugare a 16.000 g per 10 min. Mettere da parte aliquote di disincrociare legata peptidi miscelato con il reagente di spegnimento per i controlli negativi. </li><li> Regolare l&#39;otturatore della fotocamera di ritardo a 1 s. A volte l&#39;irradiazione superiore, ampia reazioni radicale può causare la degradazione delle proteine. Caricare l&#39;otturatore della fotocamera. Tempo di irradiazione aver bisogno di essere ottimizzato quando si utilizza il metodo con una nuova proteina. </li><li> Una reazione tipica PICUP viene eseguita in un volume di reazione di 20 microlitri. Trasferire 18 microlitri della soluzione del peptide in una parete sottile, trasparente, 0,2 ml di tubo di PCR. </li><li> Per la soluzione di peptide, aggiungere 1 RuBpy microlitri seguito da 1 APS microlitri e mescolare i reagenti pipettando (la concentrazione finale di RuBpy e APS nella miscela di reazione sarà 0,05 e 1 mm, rispettivamente). </li><li> Rapidamente mettere il tubo di reazione all&#39;interno di un 1,8 mL flaconcino di vetro. Mettere il flaconcino all&#39;interno del soffietto attaccato davanti al corpo della fotocamera. Fissare la protezione dell&#39;obiettivo e premere il pulsante di scatto in modo che il campione è irradiato per 1 s all&#39;interno del soffietto. </li><li> Dopo l&#39;irradiazione del campione, assumere rapidamente il flacone dal soffietto e il tubo di PCR dal flaconcino. Rapidamente placare la reazione aggiungendo 1 DTT microlitri o 10 microlitri di buffer riducendo campione PAGINA. Ripetere la reazione per ciascuna aliquota peptide. </li><li> Le miscele di reazione può essere congelato a -20 ° C per lo stoccaggio per non più di 7 giorni o tenuta in ghiaccio prima dell&#39;analisi mediante SDS-PAGE e colorazione argento. </li></ol> 3. SDS-PAGE e colorazione scheggia-di cross-linked peptide <ol><li> Routine SDS-PAGE e colorazione argento vengono eseguite per visualizzare reticolato peptidi. </li><li> Di carico 5 microlitri della miscela di reazione per corsia di ottenere ~ 130 pmol di peptide per corsia. </li><li> Includi quantità simili di disincrociare legati peptidi per il confronto. Includono anche una scaletta standard di proteine ​​per approssimazione visiva di peso molecolare di bande peptide. </li><li> Esegui il gel con uno standard apparato elettroforesi su gel. Usiamo il XCell SureLock Mini-Cell sistema da Invitrogen ed eseguire argento colorazione secondo Invitrogen pubblicazione IM-1002, Novex Pre-Cast Guida elettroforesi su gel. </li></ol> Parte 4: Risultati Rappresentante (Figura 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: Argento macchiato di gel di poliacrilammide mostrando disincrociare-linked (-) e foto-cross-linked (+) GRF, calcitonina, Aβ40 e Aβ42 SDS-PAGE e colorazione argento-analisi di PICUP generati Aβ40 oligomeri mostrano intensità di banda di circa simili di monomero attraverso tetramero, seguita da un forte calo l&#39;abbondanza di una maggiore oligomeri 7. Sciogliete legata Aβ40 migra con un coerente con quello del monomero 7 Il sig. Aβ42 mostra un distinto distribuzione delle dimensioni oligomeri. Aβ42 oligomeri comprendono 2-3 gruppi di 8. Il primo gruppo, monomero attraverso trimero, decrescenti intensità con oligomeri ordine crescente. Nel secondo gruppo, una distribuzione gaussiana, come si osserva tra tetramero e heptamer, con un massimo a pentamero e esamero. Il terzo gruppo, che non è qui, contiene oligomeri del sig ~ 30,000-60,000 Da 8. Questi oligomeri superiori Sig. tipicamente vengono osservate con SEC-isolato LMW Aβ42 ma non peptide preparato per filtrazione o trattamento HFIP 6. Sciogliete-linked Aβ42 produce prevalentemente due bande, una band monomero e un ampio trimero / tetramero band, che è un artefatto indotto da 5,9 SDS. Calcitonina produce una distribuzione delle dimensioni oligomero che si discosta fortemente da una diminuzione monotona esponenziale nel monomero regione attraverso tetramero, suggerendo pre-esistenza di dimeri, trimeri e tetrameri 7. Il controllo polipeptide, GRF, produce una distribuzione monotona oligomero che vanno dal dimero attraverso esamero tale che gli importi relativi apparente di oligomeri diminuiscono in modo esponenziale con l&#39;aumentare della massa molecolare. In altri esperimenti, una maggiore oligomeri potrebbe anche essere visualizzati 7. Il numero esatto e le intensità relative delle bande oligomeri possono variare un po &#39;tra gli esperimenti a seconda della concentrazione di proteine ​​reali, la quantità di proteina caricata sul gel, e il tempo utilizzato per la fase di sviluppo nel protocollo di colorazione argento.

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

PICUP è stato sviluppato originariamente per studiare complessi proteici stabili 2. Il metodo è stato applicato in seguito allo studio quantitativo delle assemblee metastabili proteina amiloide, tra cui Aβ 10, prioni e le malattie associate PrP Sc 11 e α-sinucleina 12. I fattori più importanti che devono essere considerati quando si progetta un esperimento PICUP sono la stechiometria dei reagenti, tempo di irradiazione, e la preparazione procedura di esempio. I primi due problemi può richiedere l&...

<table><tbody><tr><td>Lampada a incandescenza Dolan-Jenner da 200 W</td><td>Altro</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Modello 170-D</td><td>Il calore generato dalla lampada d&amp;#8211;non influisce sui campioni per brevi periodi di incubazione.</td></tr><tr><td>corpo macchina fotografica SLR da 35 mm</td><td>Strumento</td><td>Pentax</td><td>modello SP500</td><td>Nelle nostre condizioni sperimentali, un mantice è collegato al corpo della fotocamera per fornire una camera agevole in cui irradiare il campione posizionato a 10 cm dalla sorgente luminosa.</td></tr><tr><td>Tubi PCR trasparenti a pareti sottili</td><td>Altro</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 fornito da Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Vial di vetro (1,8 mL)</td><td>Altro</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, fornito da Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Reagente</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Reagente</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilizzare in una cappa chimica.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 e A&amp;#946;42</td><td>Reagente</td><td>Laboratorio Biopolimeri UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcitonina</td><td>Reagente</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) esaidrato</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortexare fino a quando la soluzione non diventa limpida. Coprire il tubo di RuBpy con della stagnola per proteggere il reagente dalla luce ambiente. Il RuBpy viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h.</td></tr><tr><td>Peroxidisolfato di ammonio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Agitare fino a quando la soluzione diventa limpida. Il APS viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>Può essere utilizzato quando viene eseguita l'analisi mediante SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-cellula</td><td>Strumento</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine Gel (10-20%)</td><td>Altro</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la colorazione Silver Express</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

photo-induced cross-linking delle proteine ​​non modificati (picup) applicata a peptidi amiloidogenico

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

L&#39;assemblaggio delle proteine ​​amiloidogenica in oligomeri tossici è un evento fondamentale nella patogenesi delle malattie misfolding, tra cui l&#39;Alzheimer, il Parkinson, la corea di Huntington e le malattie, ereditarie sclerosi laterale amiotrofica, e diabete di tipo 2. A causa della natura metastabile di queste assemblee di proteine, è difficile valutare la distribuzione delle dimensioni oligomero quantitativamente con metodi classici, come l&#39;elettroforesi, cromatografia luce, fluorescenza, o dinamico dispersione. Oligomeri di proteine ​​amiloidogenica esistono come miscele metastabile, in cui gli oligomeri dissociano in monomeri e associare in grandi gruppi contemporaneamente. PICUP stabilizza popolazioni oligomero da covalenti cross-linking e in combinazione con metodi di frazionamento, come il sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) o la dimensione-cromatografia di esclusione (SEC), PICUP fornisce istantanee delle distribuzioni di dimensioni oligomero che esisteva prima croce -linking. Quindi, PICUP permette la visualizzazione e l&#39;analisi quantitativa delle popolazioni di proteine ​​metastabili e possono essere utilizzati per monitorare le relazioni di assemblaggio e decifrare tra le modifiche sequenza e oligomerizzazione<sup&gt; 1</sup&gt;. Meccanicisticamente, PICUP coinvolge foto-ossidazione del Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; In un (bipyridyl) tris Ru (II), complessi (RuBpy) alla Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Per irraggiamento con luce visibile in presenza di un accettore di elettroni. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; È un forte ossidante di un elettrone in grado di astrarre un elettrone da una molecola di proteina vicini, generando una proteina radicale<sup&gt; 1,2</sup&gt;. I radicali sono instabili, specie altamente reattiva e quindi scomparire rapidamente attraverso una serie di reazioni intra ed intermolecolari. Un radicale può utilizzare l&#39;energia di un elettrone spaiato a reagire con un altro monomero proteina dimerica formando un radicale, che perde quindi un atomo di idrogeno e forma un stabile, covalentemente legato dimero. Il dimero può quindi reagire ulteriormente attraverso un meccanismo simile con monomeri e dimeri di altri per formare oligomeri di ordine superiore. Vantaggi del PICUP rispetto ad altri foto-chimiche o cross-linking metodi<sup&gt; 3,4</sup&gt; Sono brevi (≤ 1 s) l&#39;esposizione a non distruttiva la luce visibile, senza bisogno di<i&gt; Pre facto</iModifica&gt; la stessa sequenza, e di lunghezza zero covalente cross-linking. Inoltre, consente PICUP cross-linking delle proteine ​​all&#39;interno di pH e temperatura, inclusi i parametri fisiologici. In questo studio dimostriamo applicazione di PICUP di cross-linking di tre proteine ​​amiloidogenica il 40 - e 42-β-amiloide residui di proteine ​​varianti (Aβ40 e Aβ42) e la calcitonina, e una proteina di controllo, l&#39;ormone della crescita-releasing factor (GRF).

Foto-indotta cross-linking delle proteine ​​non modificato (PICUP) permette la caratterizzazione della distribuzione dimensionale oligomeri in miscele proteiche metastabili. Dimostriamo applicazione di PICUP a tre peptidi rappresentante amiloidogenico il 40 - e 42-residuo forme di β-amiloide, proteina, e la calcitonina, e un peptide di controllo della crescita-fattore di rilascio dell&#39;ormone.

Photo-Induced Cross-Linking delle proteine ​​non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico

L'assemblaggio di proteine amiloidogeniche in oligomeri tossici è un evento cruciale nella patogenesi delle malattie da misfolding proteico, tra cui l'Alzheimer, ...

Si ritiene che le forme solubili di proteine amiloidogeniche, attraverso le loro proprietà citotossiche, siano alla base della fisiopatologia delle malattie neurodegenerative. Queste forme solubili si assemblano e dissociano continuamente in soluzione, un fatto che complica gli studi strutturali essenziali per lo sviluppo di molecole inibitorie atte a superare questo problema.Viene utilizzato il cross-linking indotto da luce di proteine non modificate o pickup. Questo metodo prevede l'esposizione di peptidi amiloidogenici disgregati e solubilizzati a reagenti di cross-linking e a un impulso di un secondo di luce intensa per legare covalentemente i dimeri e gli allers. La distribuzione delle dimensioni degli allers può quindi essere analizzata mediante tecniche biochimiche standard.Ciao, sono Far Rahimi del laboratorio Batan del Dipartimento di Neurologia dell'Università della California a Los Angeles. Sono Al Mai del laboratorio Bean. Oggi vi mostreremo un procedimento per la fotoinduzione dell'incrocio di proteine non modificate.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per generare oligomeri stabilizzati della proteina amiloide beta e studiare le modifiche strutturali sulla distribuzione degli oligomeri. Questa procedura è stata inizialmente pubblicata da Fancy e Coate per lo studio di complessi proteici stabili. Il metodo è stato successivamente applicato da Battan e altri per lo studio quantitativo di assemblaggi proteici amiloidi metastabili, inclusi a beta pram e alpha sycle.Iniziamo. Per iniziare il protocollo, si aggiunge HEXA fluoro ISOPROPANOL o HFIP, precedentemente raffreddato su ghiaccio, in una provetta rivestita in silicone a basso assorbimento contenente da uno a 200 microgrammi di peptide liofilizzato, in modo che la concentrazione finale sia di circa 0,5.HFIP millimolare impedisce ai peptidi amilogenici di aggregarsi e migliorerà la coerenza dei risultati. Ora sottoporre il tubo del peptide a sonificazione per cinque minuti, a temperatura ambiente.Al termine della sonificazione, vortexare delicatamente i tubi e lasciarli incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, raffreddare i peptidi su ghiaccio per un minuto. I peptidi raffreddati possono ora essere suddivisi in aliquote da 10 a 50 microlitri in tubi da 0,6 ml a basso assorbimento.Successivamente, posizionare le provette nella cappa con i tappi rimossi. Per consentire l'evaporazione dell'HFIP durante la notte, avvolgere il supporto con le provette e i tamponi Kim per evitare che la polvere si depositi all'interno delle provette. Una volta evaporata la maggior parte dell'HFIP, qualsiasi traccia residua deve essere rimossa ponendo le provette in un essiccatore sotto vuoto per due ore.Il prodotto finale è uno strato sottile di film peptidico all'interno delle provette. Queste provette possono essere conservate per mesi a meno 20 o meno 80 gradi Celsius. Per iniziare le fasi di solubilizzazione e di fotoincrocio, il film peptidico viene prima disciolto in una soluzione di idrossido di sodio diluito.Dopo aver aggiunto l'idrossido di sodio, acqua deionizzata e quindi tampone fosfato, la soluzione finale dovrebbe essere composta da 45% di tampone fosfato, 45% di acqua e 10% di soluzione di idrossido di sodio. Se rimane un film proteico residuo sulla parete del tubo, raschiarlo all'interno della soluzione. Utilizzando la punta di una pipetta, aspirare e dispensare più volte i peptidi sospesi, quindi sottoporre la sospensione a sonificazione in un bagno ad ultrasuoni Sonica per uno o due minuti.Dopo la sonificazione, aggiungere la soluzione di fosfato e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta. Quindi, centrifugare il tubo a 16.000 G per 10 minuti. Mentre la centrifuga è in funzione, preparare la fotocamera per i passaggi di foto-incrocio.Il ritardo dell'otturatore della fotocamera deve essere impostato a un secondo e l'otturatore deve essere caricato. Una volta terminata la centrifugazione dei tubi, preparare aliquote da 18 microlitri della soluzione peptidica in tubi PCR trasparenti da 0,2 ml. Queste aliquote saranno utilizzate per il foto-crosslinking.Assicurarsi di mettere da parte una parte della soluzione peptidica da utilizzare come controllo negativo subito prima della reazione di crosslinking. Aggiungere un microlitro di ammonio persolfato e un microlitro di rutenio. Ora inserire rapidamente il tubo in una provetta di vetro da 1,8 M e posizionare la provetta all'interno del mantice collegato alla parte anteriore del corpo della fotocamera.Chiudere la fotocamera con il tappo dell'obiettivo e premere l'otturatore. Il campione viene ora irradiato per un secondo. A tempi di irradiazione più lunghi, reazioni radicaliche estese provocano la degradazione delle proteine.Dopo l'irradiazione, recuperare rapidamente il tubo PCR da 0,2 mil e aggiungere 10 microlitri di tampone campione per elettroforesi pre-preparato contenente beta-mercaptoetanolo. I peptidi cross-linkati possono essere conservati fino a sette giorni a meno 20 gradi Celsius. Prima dell'elettroforesi SDS-PAGE, della frazionatura e della colorazione argentica.Per analizzare i peptidi cross-linkati, possono essere utilizzati l'elettroforesi su gel SDS-PAGE e la colorazione con argento per stimare i volumi da caricare; cinque microlitri della miscela di reazione dovrebbero produrre circa 130 picomoli di peptide. Si raccomanda di utilizzare il sistema Xcel Sherlock mini cell di in Vitrogen per l'elettroforesi su gel e di eseguire la colorazione con argento. Secondo la pubblicazione di in Vitrogen, IM 1 0 0 2, guida per gel preformati senza NOx, analizzare il gel SDS-PAGE dopo la colorazione con argento: il controllo del polipeptide non cross-linkato, GRF, migra principalmente come monomero.Il GRF reticolato produce una distribuzione continua di ligandi di tutte le dimensioni, che va dal dimero all'esamero, tale che l'intensità apparente relativa delle bande degli oligomeri decresce esponenzialmente con l'aumento della massa molecolare. La calcitonina non reticolata migra principalmente come monomero e in parte come dimero. La calcitonina reticolata genera una distribuzione delle dimensioni dei ligandi che si discosta fortemente da una decrescita esponenziale monotona nella regione.Monomero fino al tetramero, suggerendo la preesistenza di dimeri, trimeri e tetrameri non cross-linkati. Una beta 40 migra solo come monomero; il segnale rilevato ha generato una Beta 40. Tutti i legami mostrano intensità di banda approssimativamente simili dal monomero al tetramero, seguite da una diminuzione nell'abbondanza di legami di ordine superiore.Un cross-linked. A beta 42 produce prevalentemente due bande, una banda monomerica e una banda trimerica. La banda del trimer è un artefatto prodotto dal SDS cross-linked.A Beta 42 mostra una distribuzione di dimensioni degli allomeri nettamente distinta, composta da due gruppi. Il primo gruppo, dal monomero al trimer, presenta un'intensità decrescente con l'aumentare dell'ordine degli allomeri. Nel secondo gruppo, si osserva una distribuzione simile a un picco tra tetramer e eptamer, con un massimo al pentamero e all'esamero.Abbiamo appena mostrato come incrociare le proteine utilizzando pika con questa procedura. È importante ricordare che quando si utilizza una proteina amiloidogenica, è necessario assicurarsi che le preparazioni siano prive di aggregati per ottenere risultati riproducibili. Le condizioni qui mostrate e questi esperimenti possono essere modificati sperimentalmente in base ai ligandi di interesse. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna nell'utilizzo dell'esperimento di pickup.

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aptameri sono ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corti...

Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l&#39;agente eziologico della malattia di Alzheimer

Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.

Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro

Mentre il trasporto delle proteine ​​di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine ​​intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.

Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile

L'amiloide-β (Ap) -injected modello animale consente la somministrazione di una quantità e specie di frammenti Ap definiti e riduce le differenze individuali all'interno di ciascun gruppo di studio. Questo protocollo descrive la intracerebroventricolare (ICV) iniezione di Ap senza strumenti stereotassica, consentendo la produzione di anomalie comportamentali Alzheimer-like nei topi normali.

Iniezione intracerebroventricular dei peptidi beta-amiloide in topi normali per indurre Acutamente Alzheimer-like Deficit cognitivi

Qui riportiamo un protocollo di purificazione HPLC su misura che produce peptidi di amiloide-beta 42 (Aβ42) e amiloide-beta 40 (Aβ40) ad alta purezza, in grado di formare oligomeri. L'amiloide-beta è un peptide idrofobico altamente incline all'aggregazione implicato nella malattia di Alzheimer. La natura amiloidogenica del peptide rende la sua purificazione una sfida.

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

Deposito dell'amiloide è un segno distintivo di diverse malattie e affligge molti organi diversi. Questo articolo descrive l'applicazione della fluorescenza luminescenti oligotiofenici coniugati macchiatura in combinazione con tecniche di microscopia di fluorescenza. Questo metodo di colorazione rappresenta un potente strumento per il rilevamento e l'esplorazione di aggregati proteici nelle configurazioni sia clinici che scientifici.

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

Un protocollo per la sintesi di un 1,2-dithiolane modificato peptide e la caratterizzazione delle strutture supramolecolari derivanti dal peptide self-assembly.

Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l'organizzazione locale all'interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull'organizzazione locale delle fibrille amiloidi.

Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

Qui, presentiamo un metodo sistematico che descrive l'auto-assemblaggio quasi reversibile degli aggregati d'oro da 20 nm rivestiti di amiloide-beta 1-40 (Aβ 1-40). Il networking quasi reversibile nano-dipendente tra i peptidi è stato correlato con specifici amminoacidi o sezioni del monomero Aβ 1-40.

Caratterizzazione dell'autoassemblaggio reversibile pH-dipendente di colloidi d'oro rivestiti di amiloide beta 1-40

Impara la tecnica PICUP per analizzare la distribuzione delle dimensioni degli oligomeri di peptidi amiloidogenici. Questo metodo biochimico consente di studiare le proprietà strutturali delle proteine coinvolte nelle malattie neurodegenerative.

Photo-Induced Cross-Linking delle proteine ​​non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico

Esplora altri video

Photo-Induced Cross-Linking delle proteine non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico