Name: Umano in vivo Bioassay per il tessuto-specifica misura di mediatori infiammatori e nocicettivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Impara la microdialisi per campionare fluido interstiziale dalla pelle infiammata e analizzare mediatori nocicettivi e infiammatori. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi del dolore in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L&#39;induzione di infiammazione sperimentale: <ol><li> Un primo grado scottatura è indotta a non conciata pelle di una coscia con l&#39;aiuto di un calibrato, fonte di raggi ultravioletti B (Saalmann Multitester FFS LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Germania). La scottatura è indotta 24 ore prima di iniziare un esperimento microdialisi applicando tre volte la quantità di luce UVB necessaria per provocare arrossamento completo di pelle esposta, o tre volte la dose minima eritema (MED). Il MED è determinato in ogni soggetto prima di iniziare lo studio. Consegna precisa di energia è assicurata con un misuratore UV (RM 12, il dottor Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Germania). </li></ol> Catetere collocamento e raccolta dei campioni: <ol><li> Preparare una area di sosta con guanti sterili, 1 porta aghi sterili, 1cc la siringa luer con un calibro 23 (G) ago, 1cc siringa con un ago 30G, 1% di lidocaina, tamponi imbevuti di alcool, 2x2 garze sterili, cateteri microdialisi fissati ad una fine di un ago 23G 4 centimetri (Dialisi cutanea, Erlangen, Germania), e provette da 1,5 ml di raccolta Microcent (E &amp; K scientifico, Santa Clara, CA.) con la soluzione 4μl inibitore della proteasi per esempio 100μl in ghiaccio secco. inibitore della proteasi soluzione è fatto per istruzione costruttore, utilizzando un cocktail di inibitori della proteasi compresse (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germania). </li><li> Preparare una soluzione all&#39;1% di albumina umana in soluzione Ringer lattato e renderlo il 1cc siringa punta luer, assicurandosi che non ci siano bolle d&#39;aria residua nella siringa. </li><li> Caricare la siringa con l&#39;1% di albumina umana arricchita di soluzione di Ringer lattato nella base di appoggio (microdialisi multi-siringa rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) montato su una pompa ad alta infusione di precisione (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Assicurarsi che la barra della pompa di infusione guida la siringa è a pieno contatto con lo stantuffo della siringa. Impostare la velocità della pompa dopo aver verificato che il diametro della siringa è stata accuratamente entrato nella pompa. Velocità di infusione comunemente utilizzata varia fra 2 e 4μl/min. </li><li> Definire l&#39;area si prevede di raccogliere il campione da. Quando il campionamento da un&#39;area creata artificialmente infiammato, come la solarizzazione di cui sopra, ha intenzione di inserire il catetere a bordo della solarizzazione. </li><li> Pulire una piccola area ai bordi opposti della lesione, o un sito che si intende ritirare il campione, con l&#39;alcol. Queste aree pulite sarà l&#39;inserimento previsto e punti di uscita per il catetere. Iniettare quel tanto che basta lidocaina intra-cutaneo (evidenziato dal pallore della pelle iniezione) in questi siti per creare una bozza molto piccoli (massimo di 2 mm). Iniezione di tale quantità limitata di intra-cutanea alla lidocaina entrata e di uscita del catetere microdialisi non dovrebbe alterare i risultati del biotest, ma fa l&#39;inserimento del catetere significativamente meno dolorosa per i soggetti di studio. </li><li> Utilizzando tecniche asettiche, inserire i cateteri microdialisi con l&#39;ausilio di aghi 23G attaccato per tutta la lunghezza della zona cutanea esplorata. La profondità di inserimento è all&#39;interfaccia tra cute e sottocute. Inserimento a una profondità adeguata può essere verificata otticamente. Come l&#39;ago e il catetere attaccato vengono spostati in avanti l&#39;ago dovrebbe causare un po &#39;di up-piegatura della pelle così come alcuni sbiancamento della pelle. Assenza di sanguinamento dovrebbe verificarsi. Se l&#39;emorragia si verifica questo indica che l&#39;ago si trova più profonda del previsto e la profondità di inserimento deve essere regolata. Una volta che l&#39;ago è stato spinto attraverso il punto di uscita della pelle, lavare i cateteri con 1% di albumina soluzione arricchita Ringer lattato fino a vedere le gocce per tutta la lunghezza del catetere. Questo viene fatto con cura inserendo l&#39;ago di una siringa (ago 23G) nella parte distale del catetere microdialisi, e lentamente iniettare la soluzione. </li><li> Dopo il lavaggio del catetere tirare delicatamente l&#39;ago per alimentare il catetere collegato attraverso la pelle. Trattamento delicato è necessario perché i cateteri sono di piccolo diametro, e quindi fragile. Tirare il catetere fino a quando non è completamente filettato attraverso la pelle, cioè la base del tubo di plastica più grandi incorporare l&#39;estremità distale del catetere tocca la pelle al punto di ingresso. Come accennato in precedenza, poco o nessun sanguinamento al termine della procedura di conferma posizionamento ottimale del catetere. </li><li> Collegare l&#39;estremità distale del catetere alla punta dell&#39;ago 23G della siringa di riposo nel rack della pompa di infusione. La cura è necessario per evitare la puntura l&#39;ago attraverso la parete del catetere, che causerebbe perdite potenziali. </li><li> Tagliare l&#39;ago fuori l&#39;estremità prossimale del catetere. </li><li> Utilizzando ¼ pollici nastro rosa, collegare il tubo di 1,5 ml preparato raccolta Microcent la pelle vicino al sito di uscita del catetere. Posizionare la punta del catetere nel tubo di raccolta per permettere la raccolta di microdialysate. Avviare la pompa a perfusione r predeterminatomangiato e intermittente verificare che il volume consegnato e raccolti corrispondono. In caso di volumi non corrispondono, perdite dal punto di ingresso cutaneo deve essere esclusa (a volte può essere risolto tirando la parte del catetere che è integrato dal tubo di plastica più strettamente punto di ingresso sulla pelle). In alternativa, un catetere può essere necessario sostituire se i volumi consegnati e raccolti non corrispondono. </li><li> Una volta che il campionamento è completa, i campioni sono posti in ghiaccio secco fino a stoccaggio a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

L&#39;uso combinato di tecniche di microdialisi e immunodosaggio tecnologia multiplex è un prezioso tempo reale, in-vivo biologico umano permettono di approfondire eventi biochimici nel tessuto di interesse. In combinazione con test comportamentali, quali i test dolore, il metodo permette di studiare le complesse interazioni tra sostanze biochimiche che mediano il dolore e l&#39;infiammazione. Il metodo è promettente per 1) identificare biomarcatori specifici tessuti mediando dolore e l&#39;infiammazione, 2) fornendo visione meccanicistica ...

<table><tbody><tr><td>Catetere per microdialisi</td><td>Strumento</td><td>Dialisi dermica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pompa 22</td><td>Strumento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Strumento</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Radiometro RM-12 IP-65</td><td>Strumento</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore completo delle proteasi</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugetta</td><td>Strumento</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumina al 5%</td><td>Reagente</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ringer lattato</td><td>Reagente</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Altro</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

umano in vivo bioassay per il tessuto-specifica misura di mediatori infiammatori e nocicettivo

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Questo in-vivo biologico umano può essere utilizzato per studiare volontari e pazienti. I campioni sono stati raccolti da siti pertinenti tessuti come la pelle attraverso cateteri inseriti microdialisi in modo asettico (Dialisi cutanea, Erlangen, Germania). Illustrato in questo esempio è la raccolta di liquido interstiziale dalla cute sperimentalmente infiammata in volontari umani. Raccolta del campione può essere combinato con altri test sperimentali. Per esempio, la valutazione simultanea di sostanze biochimiche a livello locale rilasciato e la sensibilità soggettiva agli stimoli dolorosi in pelle sperimentalmente infiammata fornisce la critica biochimico-comportamentale di collegamento per identificare biomarcatori del dolore e dell&#39;infiammazione. Saggio presentato nell&#39;organismo umano vivente permette di comprensione meccanicistica nei processi di tessuto-specifici alla base del dolore e / o infiammazione. Il metodo è adatto anche per esaminare l&#39;efficacia degli interventi esistenti o nuove - come ad esempio nuovi farmaci candidati - mira il trattamento di condizioni dolorose e / o infiammatorie. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata sull&#39;uso di tecniche di microdialisi per la raccolta di liquido interstiziale dalla lesione cutanea sperimentalmente infiammata dei soggetti in studio umano. I campioni di fluidi interstiziali vengono solitamente trattati con l&#39;aiuto dei test immunologici serie multiplex tallone che consente dosaggio fino a 100 analiti in campioni più piccolo in volume di 50 microlitri.

Una tecnica è presentato per la raccolta in vivo di campioni di liquido interstiziale del tessuto da siti pertinenti (pelle qui, sperimentalmente infiammata) per la misurazione di sostanze biochimiche che mediano il dolore e l&#39;infiammazione.

Umano in vivo Bioassay per il tessuto-specifica misura di mediatori infiammatori e nocicettivo

Questo bio-saggio umano in vivo può essere utilizzato per studiare volontari e pazienti umani. I campioni vengono raccolti da siti tissutali pertinenti, come la pelle, tramite...

Questo video inizia 24 ore dopo l'induzione di una scottatura solare sperimentale sul fianco di un paziente, utilizzando una sorgente luminosa UV calibrata. Dopo l'applicazione di anestetico locale, un catetere a microdialisi viene inserito tra i tessuti cutanei e sottocutanei e quindi estratto attraverso la pelle. Una siringa di perfusione viene collegata all'estremità prossimale del catetere, e l'attivazione della pompa di perfusione indurrà il flusso e la raccolta del microlisato.I campioni raccolti possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino al momento in cui si è pronti per analizzare i mediatori del dolore e infiammatori. Ciao, sono Martin Angst del Dipartimento di Anestesiologia della Stanford University. E ciao, sono Martha Tingle, infermiera ricercatrice senior e responsabile del Human Pain Laboratory, fondato dal Dottor Angst nel 1995 qui alla Stanford University.Oggi vi mostreremo una procedura per il posizionamento di cateteri a microdialisi nella cute infiammata sperimentalmente di partecipanti umani allo studio, al fine di raccogliere il fluido interstiziale. Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare il rilascio tessuto-specifico di sostanze biochimiche fondamentali per la mediazione del dolore e dell'infiammazione. Cominciamo dunque.Un modello di infiammazione cutanea sperimentale è l'ustione solare artificiale. Un'ustione solare di primo grado viene indotta con l'aiuto di una sorgente calibrata di ultravioletti B. La somministrazione accurata dell'energia è garantita da un misuratore di UV.La scottatura solare viene generalmente indotta applicando due o tre volte la quantità di luce UVB necessaria per provocare arrossamento. Prima di raccogliere i campioni, preparare un'area di lavoro con guanti sterili, un pinzetta per aghi sterile e siringhe da un CC con ago da 23 e 30 gauge, a seconda delle necessità. Saranno inoltre necessari cateteri per microdialisi collegati a un'estremità a un ago da 23 gauge lungo quattro centimetri. I campioni verranno raccolti in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro contenenti quattro microlitri di soluzione inibitrice delle proteasi per ogni campione da 100 microlitri. La soluzione inibitrice delle proteasi viene preparata seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando compresse di cocktail inibitore delle proteasi. Preparare una soluzione al 1% di albumina umana in soluzione di Ringer lattato e aspirarla in una siringa da un CC con ago a connessione luer, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria all'interno della siringa. Caricare la siringa contenente la soluzione di Ringer lattato arricchita con albumina umana al 1% nel supporto montato su una pompa di infusione ad alta precisione. È possibile caricare più siringhe per ottenere simultaneamente campioni di fluido interstiziale da diversi siti.Assicurarsi che la barra della pompa di infusione che aziona la siringa sia a contatto completo con lo stantuffo della siringa. Impostare la velocità della pompa dopo aver verificato che il diametro della siringa sia stato inserito correttamente nella pompa. Le velocità di infusione comunemente utilizzate variano da due a quattro microlitri al minuto.Ora si è pronti per posizionare il catetere prima del posizionamento del catetere stesso. L'area da cui vengono raccolti i campioni deve essere definita quando il campionamento avviene da una zona infiammata artificialmente, come ad esempio una scottatura solare indotta sperimentalmente. Prevedere l'inserimento del catetere al margine della scottatura solare.Pulire una piccola area ai bordi opposti della lesione o del sito C da cui si intende prelevare il campione, utilizzando tamponi alcolici; queste aree pulite saranno i punti previsti per l'inserimento e l'uscita del catetere. Utilizzando una siringa da un cc con ago da 30 gauge, iniettare lidocaina all'1%, come evidenziato dal sollevamento della cute durante l'iniezione; iniettare una quantità sufficiente di lidocaina in questi punti per formare un piccolo bleb di dimensioni massime di due millimetri. L'iniezione di una piccola quantità di lidocaina nei punti di ingresso e di uscita del catetere per microdialisi rende l'inserimento del catetere meno doloroso per i soggetti, ma non dovrebbe influire sui risultati dei saggi biologici, utilizzando tecniche asettiche.Inserire i cateteri microdialitici con l'aiuto dell'ago da 23 gauge allegato lungo tutta la lunghezza dell'area cutanea esplorata. La profondità di inserzione corrisponde all'interfaccia tra cute e tessuto sottocutaneo. Una penetrazione adeguata può essere verificata visivamente mentre l'ago e il catetere ad esso collegato vengono avanzati.L'ago dovrebbe causare un leggero sollevamento della pelle e un certo sbiancamento della cute. Non deve verificarsi sanguinamento; se ciò avviene, significa che l'ago si trova più in profondità rispetto a quanto previsto e la profondità di inserimento deve essere regolata.Dopo aver fatto passare l'ago attraverso il punto di uscita della cute, tirare delicatamente l'ago per inserire il catetere collegato attraverso la pelle. È fondamentale maneggiare con delicatezza poiché i cateteri hanno un diametro ridotto e sono molto fragili. Tirare il catetere finché non sarà completamente inserito attraverso la cute, ovvero alla base del tubo di plastica più grande.La parte distale del catetere deve toccare la pelle nel punto di inserimento. Ancora una volta, dovrebbe verificarsi una lieve o nulla perdita di sangue, indicando che il catetere è stato posizionato correttamente. Per iniziare la raccolta del campione, prima sciacquare i cateteri con soluzione di ringer lattato arricchita con albumina al 1%.Questo viene fatto inserendo con attenzione una siringa con ago da 23 gauge nell'estremità distale del catetere di microdialisi e iniettando lentamente la soluzione. Lavare il catetere fino a quando non si osservano goccioline lungo tutta la sua lunghezza e anche alla sua estremità. Dopo il lavaggio, collegare l'estremità distale del catetere alla punta dell'ago da 23 gauge della siringa che è posizionata nel supporto della pompa di infusione.Evitare di perforare con l'ago la parete del catetere, il che potrebbe causare perdite utilizzando nastro rosa da un quarto di pollice. Applicare la provetta da raccolta microcentrifuga da 1,5 millilitri preparata sulla cute vicino al lato di uscita del catetere. Posizionare la punta del catetere all'interno della provetta di raccolta per consentire la raccolta del lisato micro.Avviare la pompa di perfusione alla velocità predeterminata e controllare periodicamente che il volume somministrato e quello raccolto corrispondano; qualora i volumi non corrispondano, verificare la presenza di perdite all'ingresso cutaneo. Le perdite a livello del sito possono talvolta essere risolte tirando più saldamente la parte del catetere inserita nel tubo di plastica sull'ingresso cutaneo.In alternativa, un catetere potrebbe dover essere sostituito se i volumi somministrati e raccolti non corrispondono al termine del campionamento. I campioni vengono posti su ghiaccio secco fino al loro stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.È stato appena mostrato come raccogliere il liquido interstiziale da cute sperimentale infiammata utilizzando cateteri a microdialisi. Ora siamo pronti ad analizzare i campioni ottenuti mediante saggi immunoistochimici per identificare i marcatori biochimici del dolore e dell'infiammazione. Durante questa procedura, è fondamentale manipolare con grande attenzione i cateteri, avanzare lentamente mantenendo il tubo senza tensione, ed è utile lubrificare i cateteri prima dell'inserimento con una piccola quantità della soluzione sterile preparata per la fase di infusione dello studio.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

human-vivo-bioassay-for-tissue-specific-measurement-nociceptive

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Una tecnica per la raccolta e la misura della ferita chirurgica mediatori biochimici a punti temporali specifici.

Raccolta e misurazione nocicettivo mediatori infiammatori e nelle ferite chirurgiche

Algoritmi di valutare la soglia del dolore termico e meccanico in pelle sperimentalmente infiammata di soggetti umani studio sono mostrati. I due paradigmi di prova dolore nocicettivo indipendentemente esaminare l'elaborazione da parte dei due principali popolazioni nervo periferico in fibra di trasmissione del dolore, cioè, non mieliniche delle fibre C e piccole mieliniche A-delta fibre.

Determinazione calore e soglia del dolore meccanico in pelle infiammata dei soggetti umani

Questo video dimostra la quantificazione dei mediatori infiammatori durante l'infezione incubando cellule immunitarie derivate da tessuto polmonare umano con Haemophilus influenzae. La citometria a flusso viene utilizzata per misurare la fluorescenza delle citochine nei linfociti marcati, correlata con la produzione di citochine pro-infiammatorie in risposta all'infezione batterica.

Quantificazione dei mediatori infiammatori in cellule infette derivate da tessuti umani

Per studiare i cambiamenti di fibre nervose nocicettive intraepidermiche (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN), abbiamo sviluppato protocolli che potrebbe esaminare direttamente le variazioni morfologiche tridimensionali osservati in IENFs nocicettivi. Analisi tridimensionale IENFs ha il potenziale di valutare le variazioni morfologiche del IENF in PN.

Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane

Descriviamo un metodo di imaging non invasivo per distinguere le fasi infiammatorie. Consegna sistemica di luminol rivela le aree di infiammazione acuta che dipendono dalle attività MPO nei neutrofili. Al contrario, l'iniezione di lucigenina permette la visualizzazione di infiammazione cronica dipende attività Phox in macrofagi.

In vivo metodo di imaging per distinguere infiammazione acuta e cronica

I livelli della molecola infiammatoria di segnalazione cellulare ossido nitrico (NO) sono comunemente dosati utilizzando il reagente Griess. In questo protocollo, abbiamo creato un test di Griess modificato utilizzando tessuto cerebrale vivo di Drosophila al fine di rilevare la secrezione di NO in un metodo semplice, quantificabile e altamente ripetibile.

Nuovo test quantitativo dell'intero tessuto dei livelli di ossido nitrico nella risposta neuroinfiammatoria della Drosophila

Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l'aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei.

Valutazione della morfina-indotta iperalgesia e analgesico tolleranza nei topi mediante nocicettive termica e meccanica Modalità

Questo articolo spiega l'applicazione dell'immagine fluorescente utilizzando una sonda ottica attivabile per la visualizzazione dell'attività in vivo delle metalloproteinasi di matrici chiave in due diversi modelli sperimentali di infiammazione.

Non invasivo<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescenza ottica di imaging dell&#39;attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo

I cambiamenti morfologici si verificano nelle cellule fibroblaste immunitarie dopo l'attivazione e promuovono alterazioni nel reclutamento cellulare. Utilizzo dell'imaging a 2 fotoni in combinazione con una proteina specifica fibroblasta geneticamente ingegnerizzata 1 (FSP1)-cre; tdTomato- linea di mouse flossa-stop-floxed (TB/TB) e verde fluorescente etichettato lipopolysaccharide-FITC, possiamo illustrare l'assorbimento altamente specifico di lipopolissaccharide nei fibroblasti dermici e...

In Vivo a due colori immagini fotone di cellule reporter geneticamente taggate nella pelle

Viene descritto un protocollo standard per studiare l'attività antitumorale e la tossicità associata di IL-1α in un modello murino singeneico di HNSCC.

Valutazione dell'attività antitumorale in vivo di nanoparticelle di polianidride IL-1α

Il protocollo descrive come misurare l'iperalgesia del ginocchio nei topi. Mostriamo esempi in modelli murini di dolore acuto al ginocchio e in modelli di osteoartrite (OA).

Valutazione dell'iperalgesia del ginocchio nei topi utilizzando la misurazione dell'applicazione della pressione

Impara la microdialisi per campionare fluido interstiziale dalla pelle infiammata e analizzare mediatori nocicettivi e infiammatori. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi del dolore in vivo.

Umano in vivo Bioassay per il tessuto-specifica misura di mediatori infiammatori e nocicettivo

Esplora altri video