Drosophila larvali NMJ Dissection
4 febbraio 2009
Questo protocollo dimostra come sezionare Drosophila in preparazione per immunoistochimica e / o immagini della giunzione neuromuscolare.
Questa procedura inizia con il posizionamento di una larva di terzo stadio sulla piastra di dissezione. I perni sono posizionati nelle estremità posteriore e anteriore delle larve. Le forbici vengono utilizzate per aprire le larve e le pinze vengono utilizzate per rimuovere gli organi interni.
Infine, altri quattro perni vengono posizionati in ogni angolo della parete del corpo della larva per tenerla tesa durante il fissaggio. Ciao, sono Jonathan Brent del Laboratorio di Brian McCabe presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica solista presso il Columbia University College of Physicians and Surgeons. Oggi ti mostreremo la procedura per la larva di drosophila e la dissezione MJ.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo sinaptico della giunzione neuromuscolare. Quindi iniziamo. Nelle larve di drosophila, ci sono 30 muscoli per segmento emi la cui disposizione all'interno della parete periferica del corpo è nota.
Un totale di 35 motoneuroni innervano questi muscoli in uno schema altamente stereotipato. Per accedere alla giunzione neuromuscolare o NMJ, è necessario sezionare attentamente ogni larva con un'adeguata dissezione. L'NMJ può essere utilizzato per l'imaging, l'immunoistochimica o l'elettrofisiologia.
Iniziare la procedura mettendo una goccia di tampone HL 3.1 su una piastra di dissezione. Il tampone viene preparato in anticipo e raffreddato con ghiaccio. Raccogli con cura una larva di stella di terza estremità errante dal lato della fiala usando una grande pinza SS.
Il movimento indica che le larve non sono entrate nella pupa Posizionare le larve con il lato dorsale rivolto verso l'alto nella goccia tampone sulla piastra di dissezione. Il tampone freddo anestetizzerà le larve e le manterrà ferme usando una pinza. Posiziona uno spillo di mnuchin tra le sferiche posteriori, quindi posiziona un secondo spillo vicino agli uncini della bocca scuri in modo che le larve siano distese e pronte ad aprirsi.
Usando le forbici a molla, fai una piccola incisione orizzontale verso l'estremità posteriore delle larve. Inserisci una lama delle forbici nello sci e fai un taglio longitudinale verso l'estremità anteriore della larva. Quindi, quindi praticare incisioni orizzontali all'estremità anteriore delle larve a sinistra e a destra del perno.
Per rimuovere organi come l'intestino, aggiungere diverse gocce di tampone HL 3.1 all'animale, l'intestino e altri organi fluttueranno nella soluzione e possono essere estratti dal corpo usando una pinza. Inoltre, rimuovere il sistema tracheale con gli altri organi. Ora esponi i muscoli interni del corpo bloccando indietro i lembi fatti dalle incisioni.
Assicurati di allungare le pareti del corpo aperte orizzontalmente e verticalmente. Quando si fissano le alette. Rimuovere i pezzi di organo rimanenti e lavarli una volta.
Con l'aggiunta di un nuovo tampone HL 3.1, la larva è ora pronta per essere fissata con formaldeide appena fatta diluita al 3,5% in un XPBS immergere completamente le larve e il fissativo e attendere 25 minuti. Al termine del periodo di fissazione, lavare le larve due volte con tampone HL 3.1 per tre minuti. Rimuovere con cautela i perni, trasferire le larve in provette da 1,5 mil contenenti un XPBS, se necessario.
Le larve possono essere conservate per un massimo di due giorni a quattro gradi Celsius. Per risultati ottimali, utilizzare immediatamente le larve sezionate. Ci sono diversi componenti chiave per una larva di drosofila sezionata correttamente.
Innanzitutto, fai attenzione a non danneggiare i muscoli, in particolare sei, sette e quattro. In secondo luogo, l'animale deve essere adeguatamente disteso. In caso contrario, la giunzione neuromuscolare potrebbe non essere accessibile o distinguibile.
Qui si può vedere una larva sezionata correttamente. L'NMJ è chiaramente visibile e il sistema è ora pronto per gli esperimenti. Ti abbiamo appena mostrato come sezionare la larva esofaga per studiare la giunzione neuromuscolare.
Quando si esegue questa procedura, è importante portare i muscoli intatti. Se i muscoli sono danneggiati, non ci saranno giunzioni neuromuscolari da studiare. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo illustra come dissezionare larve di Drosophila in preparazione per l'immunohistochimica e/o l'analisi di imaging della giunzione neuromuscolare. La procedura prevede un'attenta posizione dei perni e l'uso di forbici e pinzette per preparare le larve ad ulteriori analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Immunoeistochemia
Sfondo
- I larve di Drosophila sono comunemente utilizzate negli studi neurobiologici.
- La giunzione neuromuscolare è un'area fondamentale per lo studio della trasmissione sinaptica.
- Tecniche di dissezione appropriate sono essenziali per un'analisi e un'acquisizione di immagini di successo.
- Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per la dissezione delle larve.
Scopo dello studio
- Preparare larve di Drosophila per l'analisi immunohistochemica.
- Facilitare l'imaging della giunzione neuromuscolare.
- Standardizzare le tecniche di dissezione per garantire la riproducibilità nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Posizionamento dei perni per stabilizzare le larve durante la dissezione.
- Utilizzo delle forbici per aprire le larve.
- Rimozione degli organi interni con pinze.
- Fissazione della parete corporea ai fini dell'acquisizione di immagini.
Risultati principali
- Una dissezione corretta permette una chiara visualizzazione della giunzione neuromuscolare.
- Metodi standardizzati migliorano la coerenza tra esperimenti diversi.
- Permette ulteriori studi sulla funzione e lo sviluppo sinaptico.
- Fornisce una base per future ricerche in neurobiologia di Drosophila.
Conclusioni
- La dissezione delle larve di Drosophila è un passaggio fondamentale per la ricerca neurobiologica.
- Le tecniche appropriate migliorano la qualità dell'analisi immunohistochimica.
- Questo protocollo rappresenta una risorsa preziosa per i ricercatori del settore.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La giunzione neuromuscolare (NMJ) della larva di Drosophila rappresenta un modello geneticamente accessibile per lo studio dello sviluppo sinaptico e della plasticità, offrendo un'elevata accessibilità e risoluzione a livello cellulare singolo. Questo protocollo di dissezione consente la preparazione riproducibile della NMJ per applicazioni successive come l'analisi di immagini, l'immunohistochimica e l'elettrofisiologia, sostenendo la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. Fornendo un metodo standardizzato per isolare e visualizzare le strutture sinaptiche, la tecnica aumenta la fiducia predittiva nella valutazione degli obiettivi neurobiologici e nella chiarificazione dei percorsi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase di Scoperta e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche relative alla funzione sinaptica e ai percorsi neurosviluppatori.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione ad alta fedeltà dei pattern di innervazione tra motoneuroni e muscoli.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione di interventi genetici o farmacologici sulla morfologia e funzione della giunzione neuromuscolare (NMJ).
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici standardizzati per lo screening di composti con accessibilità costante alle giunzioni neuromuscolari.
- Output quantitativi: Consente la misurazione del numero e delle dimensioni dei bouton sinaptici e della localizzazione delle proteine come parametri fenotipici.
- Scalabilità: Permette l'elaborazione parallela di larve per campagne di screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella meccanismi sinaptici conservati applicabili alla validazione di bersagli in disturbi neurodegenerativi e neuromuscolari.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte genetiche in Drosophila alla biologia sinaptica dei mammiferi attraverso vie conservate.
- De-risking meccanicistico: Permette una valutazione precoce dell'interazione con il bersaglio e della modulazione della via in un sistema vivo e integro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro di dissezione si integra nelle fasi iniziali della scoperta permettendo la verifica di ipotesi, prosegue con l'identificazione di composti promettenti attraverso fenotipi sinaptici quantificabili e supporta la validazione preclinica mediante screening fenotipici rilevanti per la malattia.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi sinaptici e la validazione funzionale dei bersagli mediante la visualizzazione diretta della giunzione neuromuscolare.
- Screening: Fornisce preparazioni pronte per saggi con letture strutturali e fluorescenti riproducibili per la valutazione di composti.
- Analisi: Genera dati quantitativi morfologici e immunoistochimici per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca Translazionale: Collega i meccanismi sinaptici di Drosophila a modelli preclinici attraverso percorsi molecolari conservati.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di bersagli neurologici in molteplici campagne di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sinaptici.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della preparazione della giunzione neuromuscolare tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale consentendo la rilevazione precoce di tossicità sinaptica o dell'interazione con l'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei neuro-obiettivi in base agli esiti sinaptici funzionali, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di Drosophila, microchirurgia e microscopia a fluorescenza.
- Richiede l'uso di piastre per dissezione, spilli per insetti, forbici a molla, pinzette e tampone HL 3.1.
- Necessita della standardizzazione della tensione applicata dagli spilli e delle condizioni del tampone tra diversi utilizzatori.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono stadi larvali e background genetici variabili che influenzano l'integrità muscolare.
- I limiti pratici comprendono l'elevata destrezza manuale richiesta e il potenziale danno muscolare in caso di dissezione imprecisa.
