Name: Drosophila larvali NMJ Dissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Impara la dissezione delle larve di Drosophila per l'analisi immunohistochimica della giunzione neuromuscolare. Questo protocollo standardizzato utilizza spilli, forbici e pinze per preparare i campioni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prima di iniziare <ol><li> Tutte le culture devono essere coltivate a 25 ° C. </li><li> HL3.1 tampone dissezione può essere preparata in anticipo. Prendete un aliquota 50 ml di HL3.1 e tenerlo in ghiaccio. </li><li> Preparare 15 ml di fresca formaldeide 3,5% nel HL3.1. Tenerlo in ghiaccio. </li></ol> Dissezione larvale <ol><li> Mettere una goccia di freddo HL3.1 sul piatto dissezione. Ciò manterrà l&#39;animale da essiccazione e stordire l&#39;animale che lo rende più facile lavorare con. </li><li> Utilizzando le pinze lunghe, selezionare un errante larva terzo instar e inserirlo nel menu di HL3.1. </li><li> In primo luogo, utilizzare pinze breve per cogliere un perno minutien. Posizionare il perno tra gli spiracoli posteriori. L&#39;animale in genere tenta di strisciare via dal perno che si stira fuori e rendendo più facile per voi di inserire un pin dritto nella testa della larva nei pressi della foce ganci. Tratto l&#39;animale in senso longitudinale. Questo vi aiuterà a massimizzare la quantità di parete del corpo esposte si può raggiungere durante il taglio. Nota: Se si sceglie di pin la prima testa, l&#39;animale può avvolgere il corpo in tutto il pin o frusta il suo corpo avanti e indietro, rendendo difficile al pin. Di solito è possibile contrastare questa rimuovendo il HL3.1 e mettere una goccia fresca fredda stupefacente l&#39;animale di nuovo. Lo scienziato ambidestro può solo prendere l&#39;animale e tenerlo in posizione. </li><li> Forbici primavera utilizzando fare una incisione orizzontale appena anteriormente al pin posteriore sul lato dorsale della larva. Luogo una lama delle forbici in incisione e fare un taglio verticale lungo la linea mediana dorsale verso la fine rostrale della larva. Alla tribuna degli animali fanno incisioni orizzontali a sinistra ea destra del perno. Nota: il risultato finale dovrebbe apparire come un io sul lato dorsale della larva lungo l&#39;asse rostrocaudal. </li><li> Rimuovere gli organi. Iniziare mettendo alcuni ulteriori cadute di HL3.1 sulla larva. In questo modo gli organi di galleggiare fuori dal corpo consentendo di rimuoverli molto più facilmente. In primo luogo, rimuovere il sistema tracheale. In secondo luogo, utilizzare la pinza per afferrare il resto degli organi e rimuoverli. </li><li> Durante la fase 3 che hai fatto un flap flap sinistra e destra nella parete del corpo. Pin i lembi in senso orario assicurandosi per allungare la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente. </li></ol> Fissazione Fissare ogni animale presente nel 3,5% di formaldeide in HL3.1 per 25 minuti. Lavare l&#39;animale due volte in HL3.1 per 5 minuti. Immagazzinamento Rimuovere i perni e trasferire le larve in una provetta contenente 1,5 ml di PBS 1X. Se si prevede di utilizzare l&#39;immagine del NMJ fuso tag fluorescenti, si dovrebbe immagine degli animali entro due giorni. È possibile memorizzare le larve sezionato per un massimo di una settimana a 4 ° C. Rappresentante risultati Ci sono parecchi componenti chiave di una larva adeguatamente sezionato Drosophila. In primo luogo, si deve fare molta attenzione a non danneggiare i muscoli, soprattutto i muscoli 4, 6, e 7. Questi sono i muscoli più popolari di studiare e se sono danneggiati scartare la preparazione filetto e sezionare un altro animale. In secondo luogo, si deve assicurarsi che l&#39;animale è allungato al massimo in modo che ogni muscolo e NMJ possono essere distinti.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

La tecnica di dissezione dimostrato in questo video può essere utilizzato per preparare le larve di Drosophila per una varietà di tecniche sperimentali. Se i tag proteina fluorescente sono presenti, le larve possono essere montati e ripreso immediatamente. Altrimenti, immunostaining può essere effettuata in modo da segnare specifici comparti sinaptica. Inoltre, elettrofisiologia può essere facilmente effettuata sulla larve sezionato per valutare il funzionamento della neurotrasmissione. <p class="jove_conte...

HL3 Buffer Dissection: (in mm) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7.3.<br /<br /&gt; Sylgard Piastra dissezione: Mescolare delicatamente (per evitare le bolle) 10:1 in un bicchiere. Versare il composto nella piastra di Petri (qualsiasi dimensione). Lasciare SylGard per curare una notte in incubatrice 37C.

drosophila larvali nmj dissection

Drosophila Larval NMJ Dissection

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Giunzione neuromuscolare (NMJ) è un sistema modello stabilito usato per lo studio dello sviluppo e della plasticità sinaptica. L&#39;uso diffuso del<em&gt; Drosophila</em&gt; Motore del sistema è dovuta alla sua alta accessibilità. Può essere analizzati con cella singola risoluzione. Ci sono 30 muscoli per hemisegment la cui disposizione all&#39;interno delle mura organo periferico sono noti. Un totale di 35 neuroni motori attribuiscono a questi muscoli in un modello che ha alta fedeltà. Utilizzando biologia molecolare e della genetica, si possono creare animali transgenici o mutanti. Poi, si può studiare le conseguenze dello sviluppo sulla morfologia e la funzione del NMJ. Per poter accedere al NMJ per lo studio, è necessario analizzare con attenzione ogni larva. In questo articolo mostriamo come sezionare correttamente<em&gt; Drosophila</emLarve&gt; per lo studio del NMJ rimuovendo tutti gli organi interni, lasciando intatta la parete del corpo. Questa tecnica è adatta per preparare le larve per l&#39;imaging, immunoistochimica, o elettrofisiologia.

Questo protocollo dimostra come sezionare<em&gt; Drosophila</emLarve&gt; in preparazione per immunoistochimica e / o immagini della giunzione neuromuscolare.

Drosophila larvali NMJ Dissection

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila è un sistema modello consolidato utilizzato per lo studio dello sviluppo e della plasticità sinaptica. L'ampio utilizzo...

Questa procedura inizia posizionando una larva del terzo stadio sulla piastra di dissezione. Vengono inseriti dei perni alle estremità posteriore e anteriore della larva. Le forbici vengono utilizzate per aprire la larva e la pinzetta per rimuovere gli organi interni.Infine, quattro ulteriori perni vengono posizionati in ciascun angolo della parete corporea della larva per mantenerla ben tesa durante la fissazione. Ciao, sono Jonathan Brent del Laboratorio di Brian McCabe del Dipartimento di Fisiologia e biofisica solistica presso la Columbia University College of Physicians and Surgeons. Oggi vi mostreremo la procedura per la dissezione della larva di drosophila e della MJ.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo sinaptico della giunzione neuromuscolare. Cominciamo dunque. Nei larve di drosophila, ci sono 30 muscoli per emisegmento, il cui assetto all'interno della parete corporea periferica è noto.In totale, 35 neuroni motori innervano questi muscoli secondo un modello altamente stereotipato. Per accedere alla giunzione neuromuscolare o NMJ, è necessario dissezionare con attenzione ogni larva mediante una dissezione appropriata. La NMJ può esse

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo articolo mostriamo come di sezionare il sistema nervoso centrale da terze larve instar Drosophila.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

Questo protocollo illustra come eseguire immunoistochimica su sezionato larva di Drosophila.

Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica

Larve di Drosophila melanogaster fornire un sistema modello ideale per studiare i meccanismi di trasporto assonale in nervi larvale segmentale. Utilizzando questa procedura, 3 ° larve instar portatori di mutazioni varie può essere paragonato a larve wild-type.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l'anestesia e l'imaging di...

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

In situ di patch clamp registrazioni sono utilizzate per la caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni nel circuito intatto. Nel modello Drosophila genetico cerotto bloccaggio è difficile perché il CNS è piccolo e circondato da una guaina robusta. Questo articolo descrive la procedura per rimuovere i neuroni guaina e pulite per le registrazioni successive patch clamp.

Preparazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni centrali per<em&gt; In situ</em&gt; Patch di serraggio

In questo video, le fibre nervose delle larve di Drosophila sono immerse in un colorante FM, che si lega ai lipidi della membrana cellulare. Il microelettrodo di aspirazione e gli impulsi elettrici stimolano il processo di endocitosi, incorporando il colorante FM nelle vescicole endocitiche di nuova formazione. Questo metodo, che visualizza le fasi presinaptiche della neurotrasmissione, è utile per studiare la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori.

Carico e scarico del colorante FM mediato da microelettrodi nelle cellule nervose delle larve di Drosophila

La morfologia, le dimensioni e la posizione degli organelli intracellulari sono evolutivamente conservate e sembrano influenzare direttamente la loro funzione. Comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi è diventato un obiettivo importante della biologia moderna. Qui mostriamo come questi studi possano essere facilitati dall'applicazione di tecniche quantitative.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Qui descriviamo un metodo semplice e ampiamente accessibile per danneggiare i nervi segmentali nelle larve Drosophila per visualizzare e quantificare la neurodegenerazione dei neuroni motori alla giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di terzo istar.

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Degenerazione dei motori neuronali

Descriviamo una tecnica di dissezione che preserva l'architettura della giunzione neuromuscolare e consente uno studio immunocitochimico dettagliato dei motoneuroni nella gamba adulta di Drosophila .

Dissezione e immunoistochimica della gamba adulta di Drosophila per rilevare i cambiamenti alla giunzione neuromuscolare per un motoneurone identificato

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Impara la dissezione delle larve di Drosophila per l'analisi immunohistochimica della giunzione neuromuscolare. Questo protocollo standardizzato utilizza spilli, forbici e pinze per preparare i campioni.

Drosophila larvali NMJ Dissection

Esplora altri video