Name: Drosophila larvali NMJ Dissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Impara la dissezione delle larve di Drosophila per l'analisi immunohistochimica della giunzione neuromuscolare. Questo protocollo standardizzato utilizza spilli, forbici e pinze per preparare i campioni.

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Prima di iniziare <ol><li> Tutte le culture devono essere coltivate a 25 ° C. </li><li> HL3.1 tampone dissezione può essere preparata in anticipo. Prendete un aliquota 50 ml di HL3.1 e tenerlo in ghiaccio. </li><li> Preparare 15 ml di fresca formaldeide 3,5% nel HL3.1. Tenerlo in ghiaccio. </li></ol> Dissezione larvale <ol><li> Mettere una goccia di freddo HL3.1 sul piatto dissezione. Ciò manterrà l&#39;animale da essiccazione e stordire l&#39;animale che lo rende più facile lavorare con. </li><li> Utilizzando le pinze lunghe, selezionare un errante larva terzo instar e inserirlo nel menu di HL3.1. </li><li> In primo luogo, utilizzare pinze breve per cogliere un perno minutien. Posizionare il perno tra gli spiracoli posteriori. L&#39;animale in genere tenta di strisciare via dal perno che si stira fuori e rendendo più facile per voi di inserire un pin dritto nella testa della larva nei pressi della foce ganci. Tratto l&#39;animale in senso longitudinale. Questo vi aiuterà a massimizzare la quantità di parete del corpo esposte si può raggiungere durante il taglio. Nota: Se si sceglie di pin la prima testa, l&#39;animale può avvolgere il corpo in tutto il pin o frusta il suo corpo avanti e indietro, rendendo difficile al pin. Di solito è possibile contrastare questa rimuovendo il HL3.1 e mettere una goccia fresca fredda stupefacente l&#39;animale di nuovo. Lo scienziato ambidestro può solo prendere l&#39;animale e tenerlo in posizione. </li><li> Forbici primavera utilizzando fare una incisione orizzontale appena anteriormente al pin posteriore sul lato dorsale della larva. Luogo una lama delle forbici in incisione e fare un taglio verticale lungo la linea mediana dorsale verso la fine rostrale della larva. Alla tribuna degli animali fanno incisioni orizzontali a sinistra ea destra del perno. Nota: il risultato finale dovrebbe apparire come un io sul lato dorsale della larva lungo l&#39;asse rostrocaudal. </li><li> Rimuovere gli organi. Iniziare mettendo alcuni ulteriori cadute di HL3.1 sulla larva. In questo modo gli organi di galleggiare fuori dal corpo consentendo di rimuoverli molto più facilmente. In primo luogo, rimuovere il sistema tracheale. In secondo luogo, utilizzare la pinza per afferrare il resto degli organi e rimuoverli. </li><li> Durante la fase 3 che hai fatto un flap flap sinistra e destra nella parete del corpo. Pin i lembi in senso orario assicurandosi per allungare la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente. </li></ol> Fissazione Fissare ogni animale presente nel 3,5% di formaldeide in HL3.1 per 25 minuti. Lavare l&#39;animale due volte in HL3.1 per 5 minuti. Immagazzinamento Rimuovere i perni e trasferire le larve in una provetta contenente 1,5 ml di PBS 1X. Se si prevede di utilizzare l&#39;immagine del NMJ fuso tag fluorescenti, si dovrebbe immagine degli animali entro due giorni. È possibile memorizzare le larve sezionato per un massimo di una settimana a 4 ° C. Rappresentante risultati Ci sono parecchi componenti chiave di una larva adeguatamente sezionato Drosophila. In primo luogo, si deve fare molta attenzione a non danneggiare i muscoli, soprattutto i muscoli 4, 6, e 7. Questi sono i muscoli più popolari di studiare e se sono danneggiati scartare la preparazione filetto e sezionare un altro animale. In secondo luogo, si deve assicurarsi che l&#39;animale è allungato al massimo in modo che ogni muscolo e NMJ possono essere distinti.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

La tecnica di dissezione dimostrato in questo video può essere utilizzato per preparare le larve di Drosophila per una varietà di tecniche sperimentali. Se i tag proteina fluorescente sono presenti, le larve possono essere montati e ripreso immediatamente. Altrimenti, immunostaining può essere effettuata in modo da segnare specifici comparti sinaptica. Inoltre, elettrofisiologia può essere facilmente effettuata sulla larve sezionato per valutare il funzionamento della neurotrasmissione. <p class="jove_conte...

HL3 Buffer Dissection: (in mm) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7.3.<br /<br /&gt; Sylgard Piastra dissezione: Mescolare delicatamente (per evitare le bolle) 10:1 in un bicchiere. Versare il composto nella piastra di Petri (qualsiasi dimensione). Lasciare SylGard per curare una notte in incubatrice 37C.

drosophila larvali nmj dissection

Drosophila Larval NMJ Dissection

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Giunzione neuromuscolare (NMJ) è un sistema modello stabilito usato per lo studio dello sviluppo e della plasticità sinaptica. L&#39;uso diffuso del<em&gt; Drosophila</em&gt; Motore del sistema è dovuta alla sua alta accessibilità. Può essere analizzati con cella singola risoluzione. Ci sono 30 muscoli per hemisegment la cui disposizione all&#39;interno delle mura organo periferico sono noti. Un totale di 35 neuroni motori attribuiscono a questi muscoli in un modello che ha alta fedeltà. Utilizzando biologia molecolare e della genetica, si possono creare animali transgenici o mutanti. Poi, si può studiare le conseguenze dello sviluppo sulla morfologia e la funzione del NMJ. Per poter accedere al NMJ per lo studio, è necessario analizzare con attenzione ogni larva. In questo articolo mostriamo come sezionare correttamente<em&gt; Drosophila</emLarve&gt; per lo studio del NMJ rimuovendo tutti gli organi interni, lasciando intatta la parete del corpo. Questa tecnica è adatta per preparare le larve per l&#39;imaging, immunoistochimica, o elettrofisiologia.

Questo protocollo dimostra come sezionare<em&gt; Drosophila</emLarve&gt; in preparazione per immunoistochimica e / o immagini della giunzione neuromuscolare.

Drosophila larvali NMJ Dissection

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila è un sistema modello consolidato utilizzato per lo studio dello sviluppo e della plasticità sinaptica. L'ampio utilizzo...

Questa procedura inizia posizionando una larva del terzo stadio sulla piastra di dissezione. Vengono inseriti dei perni alle estremità posteriore e anteriore della larva. Le forbici vengono utilizzate per aprire la larva e la pinzetta per rimuovere gli organi interni.Infine, quattro ulteriori perni vengono posizionati in ciascun angolo della parete corporea della larva per mantenerla ben tesa durante la fissazione. Ciao, sono Jonathan Brent del Laboratorio di Brian McCabe del Dipartimento di Fisiologia e biofisica solistica presso la Columbia University College of Physicians and Surgeons. Oggi vi mostreremo la procedura per la dissezione della larva di drosophila e della MJ.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo sinaptico della giunzione neuromuscolare. Cominciamo dunque. Nei larve di drosophila, ci sono 30 muscoli per emisegmento, il cui assetto all'interno della parete corporea periferica è noto.In totale, 35 neuroni motori innervano questi muscoli secondo un modello altamente stereotipato. Per accedere alla giunzione neuromuscolare o NMJ, è necessario dissezionare con attenzione ogni larva mediante una dissezione appropriata. La NMJ può essere utilizzata per l'analisi mediante immunofluorescenza o elettrofisiologia.Iniziare la procedura ponendo una goccia di tampone HL 3.1 su una piastra per dissezione. Il tampone viene preparato in anticipo e raffreddato sul ghiaccio. Prelevare con cura una larva di terzo stadio in fase di erranza dal lato della provetta utilizzando pinzette in acciaio inossidibile di grandi dimensioni.Il movimento indica che la larva non è ancora entrata nella fase di pupazione. Posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto nella goccia di tampone sulla piastra di dissezione. Il tampone freddo anestetizzerà la larva e la manterrà ferma; utilizzare pinzette. Inserire un perno mnuchin tra le sfere posteriori, quindi posizionare un secondo perno vicino agli uncini boccali scuri in modo che la larva sia distesa e pronta per essere aperta.Utilizzando forbici a molla, effettuare una piccola incisione orizzontale verso l'estremità posteriore delle larve. Inserire una lama delle forbici nella sci e praticare un taglio longitudinale verso l'estremità anteriore della larva. Successivamente, effettuare incisioni orizzontali all'estremità anteriore delle larve a sinistra e a destra del perno.Per rimuovere organi come l'intestino, aggiungere alcune gocce di tampone HL 3.1 all'animale; l'intestino e altri organi galleggeranno nella soluzione e potranno essere staccati dal corpo utilizzando pinzette. Rimuovere anche il sistema tracheale insieme agli altri organi. Esporre ora i muscoli interni del corpo fissando all'indietro i lembi creati con le incisioni.Assicurarsi di distendere le pareti del corpo in senso orizzontale e verticale quando si fissano i lembi. Rimuovere eventuali residui di organi e lavare una volta.Aggiungendo del nuovo buffer HL 3.1, la larva è ora pronta per essere fissata con formaldeide appena preparata, diluita al 3,5% in una XPBS, immergendo completamente le larve e il fissativo e lasciando agire per 25 minuti. Al termine del periodo di fissazione, lavare le larve due volte con buffer HL 3.1 per tre minuti. Rimuovere con attenzione i perni e trasferire le larve in provette da 1,5 ml contenenti una XPBS, se necessario.I larve possono essere conservate fino a due giorni a quattro gradi Celsius. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare le larve dissezionate immediatamente. Esistono diversi componenti fondamentali in una larva di drosophila correttamente dissezionata.Prima di tutto, fare attenzione a non danneggiare i muscoli, in particolare il sei, il sette e il quattro. In secondo luogo, l'animale deve essere adeguatamente disteso. In caso contrario, la giunzione neuromuscolare potrebbe non essere accessibile o distinguibile.Qui potete vedere una larva correttamente dissezionata. La giunzione neuromuscolare è chiaramente visibile e il sistema è ora pronto per gli esperimenti. Vi abbiamo appena mostrato come dissezionare una larva esofagea per studiare la giunzione neuromuscolare.Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere i muscoli integri. Se i muscoli vengono danneggiati, non ci saranno giunzioni neuromuscolari da studiare. Questo è tutto.Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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