Name: Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Impara l'immunoistochimica su larve di Drosophila per visualizzare proteine coinvolte nello sviluppo sinaptico. Questo metodo consente di studiare la regolazione genetica della formazione delle sinapsi in vivo.

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Prima di iniziare <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: PBT (0,1% Triton X100 in PBS 1X), PBTB (0,2% BSA in PBT), e PBTN (2% in PBTB NGS). </li><li> Sezionare larve di Drosophila. Si prega di consultare Drosophila larvale Dissection NMJ. </li></ol> Immunoistochimica <ol><li> Spostare le larve in una provetta contenente 1,5 ml PBT. Lavare le larve due volte per 15 minuti in PBT. Nota: per lavare, posizionare il tubo di 1,5 ml di un mixer nutator. Asportare il liquido con un pippetor e sostituirlo con il liquido fresco. </li><li> Rimuovere il PBT. Lavare in PBTB due volte per 30 minuti. </li><li> Rimuovere il PBTB. Lavare in PBTN due volte per 15 minuti. </li><li> Incubare in anticorpo primario diluito in PBTN a temperatura ambiente per 1 ora o al 4 º C durante la notte. </li><li> Sciacquare due volte con PBTB. Nota: alla soluzione di risciacquo aggiungere e rimuovere in fretta. </li><li> Lavare due volte per 15 minuti in PBTB. </li><li> Lavare in PBTN per 30 minuti. </li><li> Incubare in anticorpo secondario (e coniugato anticorpo primario se si utilizza uno) diluito in PBTN. </li><li> Copertura in stagnola e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare due volte con PBTB. </li><li> Lavare due volte per 15 minuti con PBTB. </li><li> Procedere al montaggio. </li></ol> Montaggio Nota: il Monte in glicerolo se i campioni saranno immediatamente ripreso. Montare a prolungare oro se i campioni saranno conservati prima immagine (per più di una settimana) o se i campioni devono essere ripreso più volte. Per utilizzare, posto una bottiglia di prolungare a 65 ° C bagnomaria per 2-3 minuti. Prelevare un &#39;aliquota di prolungare oro e di tenere a fuoco-block a 45-50 º C. <ol><li> Versare prepara macchiato in PBT per un vetro da orologio. </li><li> Metti un po &#39;glicerolo su un vetrino pulito per l&#39;elaborazione. </li><li> Spostare gli animali per far scorrere il trattamento con la scelta fuori dal vetro da orologio da un angolo con pinze. Assicurare che siano parte cuticole verso il basso. </li><li> Togliere la testa e la coda con una lama di rasoio fresca sul vetrino di elaborazione. Exacto un coltello con lama # 16 funziona bene per questo. </li><li> Su un altro scivolo (montaggio di diapositive), mettere una piccola goccia di glicerolo / prolungare e stenderlo con una pinza pulita. </li><li> Spostare gli animali sezionati al vetrino di montaggio al loro margine, facendo attenzione a non invertire loro. Prova a montarli in fila con lo stesso orientamento. Monte 6-8 animali per vetrino. </li><li> Caduta di una scivolata sulla copertura mettendo un bordo in glicerolo / Prolungare e lentamente liberando. </li><li> Sigillare la diapositiva con smalto. [Nota Non immagine fino a quando la vernice è asciutta. Questo di solito prende dieci minuti. Per i campioni montati in oro prolungare, lasciate le diapositive asciugare per almeno tre ore prima di chiusura o di immagini.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Immunoistochimica (IHC) è di vitale importanza per lo studio della biologia NMJ perché consente la visualizzazione delle NMJ. Questo è ottenuto utilizzando anticorpi che riconoscono la membrana neuronale (ad esempio, HRP), il presynapse (ad esempio, CSP, SYT), e / o il postsynapse (ad esempio, DLG). Molecole di segnalazione, proteine ​​strutturali, nuove proteine ​​o di interesse possono anche essere colorati. Poi, i geni possono essere mutati o missexpressed e IHC in grado di rilevare perturbazione di struttura sinapti...

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Mixer nutatore Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Taglierino di precisione n. 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Lame n. 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Reagente anti-sfalsamento ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larvali nmj immunoistochimica

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Giunzione neuromuscolare (NMJ) è stabilito un sistema modello utilizzato per lo studio dello sviluppo e della plasticità sinaptica. L&#39;uso diffuso del<em&gt; Drosophila</em&gt; Motore del sistema è dovuta alla sua alta accessibilità. Può essere analizzati con cella singola risoluzione. Ci sono 30 muscoli per hemisegment la cui disposizione all&#39;interno delle mura organo periferico sono noti. Un totale di 31 neuroni motori attribuiscono a questi muscoli in un modello che ha alta fedeltà. Utilizzando biologia molecolare e della genetica, si possono creare animali transgenici o mutanti. Poi, si può studiare le conseguenze dello sviluppo sulla morfologia e la funzione del NMJ. Immunoistochimica può essere usato per l&#39;immagine chiaramente i componenti del NMJ. In questo articolo mostriamo come utilizzare colorazione anticorpi per visualizzare le<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale NMJ.

Questo protocollo illustra come eseguire immunoistochimica su sezionato larva di Drosophila.

Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila è un sistema modello consolidato, utilizzato per lo studio dello sviluppo e della plasticità sinaptica. L'ampio utilizzo...

Questo protocollo descrive come eseguire una colorazione immunohistochimica su larve gsof dissezionate per visualizzare le proteine coinvolte nello sviluppo delle sinapsi. Durante tutta la procedura viene utilizzato un tubo da 1,7 mil per l'incubazione con gli anticorpi primari e secondari, nonché per i passaggi di lavaggio. Successivamente, le larve vengono trasferite su un vetrino di lavorazione, dove vengono rifinite con un cutter per poi spostare i campioni su una goccia di reagente anti-sfaldamento.Su un vetrino portaoggetti, un coprioggetto viene infine sigillato al vetrino con smalto per unghie. Ciao, sono Jonathan Brent del laboratorio di Brian McCade del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica Cellulare della Columbia University College of Physicians and Surgeons. Utilizziamo questo procedimento per studiare la regolazione genetica della formazione delle sinapsi alla giunzione neuromuscolare e al nodo in via di sviluppo.Iniziamo. Prima di eseguire l'immunohistochimica sulle larve di gsof n MJ, è necessario dissezionare correttamente le larve. Per apprendere questa procedura, guardare il video articolo allegato intitolato Dissezione della Larva di Drosophila N MJ.Per iniziare la procedura, preparare tre soluzioni fresche. In primo luogo, preparare la soluzione PBT aggiungendo un detergente al PBS appena preparato. In secondo luogo, prelevare un'aliquote di albumina sierica bovina e aggiungerla a una soluzione PBT.Per preparare il PBTB terziario, prendere un normale siero di capra acquoso e aggiungerlo alla soluzione PB TB per ottenere la soluzione PBTN. Dopo aver preparato queste soluzioni, trasferire le larve in una provetta da 1,5 ml contenente 1 ml di PBT. Questo è il primo lavaggio.Ogni lavaggio prevede la sostituzione della soluzione in cui sono immersi i larvi, seguita dall'incubazione dei larvi su un agitatore rotante lento. Non trasferire i larvi da un tubo all'altro, poiché ciò potrebbe danneggiarli. Questo primo lavaggio dura 15 minuti a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti di mescolamento, sostituire il PBT con PBT fresco utilizzando una pipetta e lavare le larve per altri 15 minuti. Durante il cambio delle soluzioni di lavaggio, prestare sempre attenzione a non danneggiare le larve. Una volta completati i lavaggi con PBT, lavare le larve in PBTB per 30 minuti.Ripetere questo lavaggio con soluzione fresca per altri 30 minuti. Il lavaggio con PBTB è completo. Lavare due volte con PBTN per 15 minuti per ogni lavaggio.Nel corso del secondo passaggio di lavaggio, l'anticorpo primario può essere diluito in PBTN alla concentrazione di lavoro desiderata. Dopo il lavaggio, incubare le larve in questa miscela di anticorpi per un'ora con mescolamento delicato a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpo primario mediante sifonamento e risciacquare rapidamente le larve diverse volte con PBTB per eliminare qualsiasi anticorpo residuo.Per preparare le larve per il successivo incubazione con l'anticorpo, lavarle una volta in PBTB per 15 minuti e due volte in PBTN per 30 minuti. Diluire l'anticorpo secondario in PBTN alla concentrazione lavorativa desiderata e incubare le larve in questa miscela per un'ora e mezza. A temperatura ambiente, assicurarsi di coprire le larve per evitare l'esposizione alla luce e ridurre al minimo lo sbiancamento del fluoroforo.Dopo un'ora e mezza, rimuovere la soluzione dell'anticorpo secondario e risciacquare ulteriormente i larve diverse volte in PBTB. A questo punto, lavare i larve in PBTV per 15 minuti, due volte. Tutti i successivi lavaggi e la conservazione dei larve devono essere effettuati con esposizione minima alla luce; assicurarsi quindi di mantenerli coperti.Trasferire i larve dal tubo da 1,5 ml in PBT su un vetrino da processamento in vetro. Le larve sono ora pronte per essere montate: montare le larve colorate in soluzione di gold prolungata a caldo in un bagnomaria a 65 gradi Celsius per due o tre minuti. Successivamente, prendere un Eloqua e mantenerlo su un blocco termico impostato a 50 gradi Celsius.Applicare un po' di PB TB su un vetrino da elaborazione. Trasferire le larve nel PB TB. Ruotare le larve in modo che il cuticolo sia rivolto verso il basso utilizzando un bisturi con lama numero 16, rimuovere le teste e le code delle larve.È possibile utilizzare anche un rasoio per questo passaggio. Preparare ora il vetrino portaoggetto aggiungendo su un vetrino pulito 40 microlitri di prolungato oro proveniente dall'aliquota riscaldata e distribuirlo con pinzette pulite. Utilizzando pinzette.Trasferire con attenzione sei-otto larve preparate dal vetrino di lavorazione a quello di montaggio. Cercare di mantenerle nella stessa orientazione e con i lati del cuticolo rivolti verso il basso per montare le larve. Applicare un coprioggetto sulla soluzione prolungata.Sistemarlo su un bordo alla periferia della goccia allargata e far cadere con attenzione il coprioggetto per coprire i campioni. Sigillare i bordi del coprioggetto al vetrino con lo smalto economico e denso del colore preferito. Lasciare asciugare il vetrino per un minimo di tre ore.Se le preparazioni verranno osservate una sola volta e immediatamente dopo la preparazione, la soluzione prolungata di oro può essere sostituita con glicerolo. In tal caso, il tempo di essiccazione dello smalto per unghie e del glicerolo è di soli circa 10 minuti, rispetto alle tre ore necessarie con qualsiasi protocollo di colorazione. L'obiettivo è ottenere un segnale specifico elevato unito a un fondo basso.Questo si ottiene utilizzando anticorpi di alta qualità e svolgendo accuratamente i passaggi di blocco e di lavaggio. Queste immagini mostrano sinapsi di tipo selvatico, nonché quelle di una linea di moscerini che esprime un recettore BMP di tipo due mutato, noto come wishful thinking o mutante witch. La membrana neuronale è colorata in blu con un anticorpo contro la perossidasi del rafano. I vescicoli sinaptici mostrati in rosso sono colorati con un anticorpo antis sinaptico. La post-sinapsi mostrata in verde è colorata con un anticorpo contro discs large. Questi risultati hanno dimostrato che la mutazione del recettore BMP di tipo due wit produce un fenotipo di ridotta crescita sinaptica.Questo mutante è stato fondamentale per stabilire i BMP come segnali retrogradi che regolano il numero di terminali sinaptici a bottone. Abbiamo appena mostrato come eseguire un'immunocitochimica su una giunzione neuromuscolare larvale dell'esofago. Quando si esegue questa procedura.È importante eseguire la procedura con un'adeguata tempistica per garantire la massima riproducibilità e un fondo ridotto. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Etichettatura immunoistologiche di microtubuli in Neuron dendriti sensoriali, trachee, e Muscoli in Drosophila Larva parete del corpo

La giunzione neuromuscolare della Drosophila (NMJ) viene utilizzata come modello per studiare la morfologia e la funzione delle sinapsi. Questo video descrive importanti caratteristiche che i ricercatori quantificano per caratterizzare l'NMJ. Il protocollo di esempio mostra un software in grado di eseguire la quantificazione automaticamente.

drosofila Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

La morfologia, le dimensioni e la posizione degli organelli intracellulari sono evolutivamente conservate e sembrano influenzare direttamente la loro funzione. Comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi è diventato un obiettivo importante della biologia moderna. Qui mostriamo come questi studi possano essere facilitati dall'applicazione di tecniche quantitative.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Questo rapporto fornisce una nuova procedura di preparazione del campione per la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila . Questo metodo è più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale ed è particolarmente utile per l'analisi ultrastrutturale della giunzione neuromuscolare della Drosophila .

Ottimizzazione del processo di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Impara l'immunoistochimica su larve di Drosophila per visualizzare proteine coinvolte nello sviluppo sinaptico. Questo metodo consente di studiare la regolazione genetica della formazione delle sinapsi in vivo.

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