Name: Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Impara la crioconservazione degli ovociti di criceto e degli embrioni di topo con protocolli controllati di congelamento e scongelamento. Questo metodo garantisce elevate percentuali di sopravvivenza post-scongelamento per la ricerca riproduttiva.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministerio de Educación y spagnolo Ciencia (BIO 2006-11792) e la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano Marc Puigcerver e Jonatan Lucas per la loro assistenza tecnica per la preparazione dei mezzi. Tutto il personale da d&#39;Servei Estabulari è riconosciuto per la stabulazione degli animali, e soprattutto Juan Jose Martin e Javier Benito per il loro contributo supplementare a registrare parte di questo video. BCN è un collega del portoghese Fundação para a Ciência e Tecnologia e SG è un compagno dello spagnolo Ministerio de Educación y Ciencia.

La cura degli animali e le procedure sono state condotte secondo le linee guida e regolamenti approvati dal Comitato Etico per animali e la ricerca umana della Universitat Autònoma di Barcellona, ​​in Spagna. I. ovociti collezione <ol><li> Controllare e selezionare criceti femmina (Mesocricetus auratus; 8-12 settimana di età) del ceppo d&#39;oro siriano per la presenza di uno scarico di spessore vaginale (scarica fase postovulatoria). </li><li> Indurre femmine selezionati per superovulate mediante iniezione intraperitoneale di 40 UI di PMSG (Pregnant Mare Serum gonadotropina), seguita da 40 UI di hCG (gonadotropina corionica umana) 60 ore dopo. </li><li> Euthanize criceti femmina 16 ore dopo la somministrazione di hCG in una camera di anidride carbonica. </li><li> Isolare ovidotti dalle femmine, come mostrato nel video e trasferirli su una goccia di KSOM-H media. </li><li> Raccogliere ovocita-cumulo complessi strappando l&#39;ampolla ovidotto sotto un microscopio stereoscopico in una goccia di ialuronidasi (156 U / ml) a 37 ° C. Ovociti sarà liberato da cellule del cumulo in circa 5 minuti. </li><li> Pick up ovociti da ialuronidasi e lavarli due volte in KSOM-H media. </li></ol> Per la raccolta di embrioni di topo, topi di sesso femminile (Mus musculus, 6-8 settimane di età) sono indotti a superovulate mediante iniezione intraperitoneale di 5 UI di PMSG seguito da 5 UI di hCG dopo 48 ore e accoppiati con topi di sesso maschile. Le femmine sono sacrificati per dislocazione cervicale a 24-26, 44-46 o 54-56 ore dopo la somministrazione di hCG per ottenimento dei pronuclei, 2-4-cell o cellule di embrioni fase, rispettivamente. Raccolta di embrioni pronuclei viene eseguita esattamente come descritto per ovociti di criceto. Embrioni nelle fasi di 2-celle e 4-celle vengono raccolti svuotando la ovidotti con KSOM-H media [6]. Nota: A seguito di questo protocollo circa 20 o 30 ovociti / embrioni possono essere raccolti da ogni femmina. II. Preparazione di gelo e disgelo soluzioni <ol><li> Preparare la soluzione mi diluendo 0,57 ml di propilenglycol in 5 ml di KSOM-H (1,5 M di propilenglycol). </li><li> Preparare la soluzione disgelo con l&#39;aggiunta di 2 ml di KSOM-H ad un tubo con 0,2052 g di saccarosio (0,3 M di saccarosio). </li><li> Preparare la soluzione di congelamento con l&#39;aggiunta di 2 ml di soluzione che ho ad un tubo con 0,0684 g di saccarosio (1,5 M di saccarosio propilenglycol e 0,1 M). </li></ol> Nota: I Solution e il congelamento e scongelamento soluzioni devono essere preparate poco prima del loro utilizzo. Tuttavia, la determinata quantità di saccarosio da utilizzare per la preparazione delle soluzioni di congelamento e scongelamento può essere ponderata in anticipo e conservati in 3 ml tubi a temperatura ambiente per diversi mesi. III. Protocollo di congelamento <ol><li> Ovociti trasferimento / embrioni dal KSOM-H medio-una goccia di soluzione di I e incubare per 7-15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Nel frattempo, preparare un piatto di 90 millimetri di Petri per caricare il cannucce mettendo 90 gocce ml di congelamento e scongelamento soluzioni come viene mostrato nel video (1 goccia di ogni soluzione / paglia). </li><li> Trasferire il numero desiderato di ovociti / embrioni per le gocce soluzione di congelamento. Nota: Di solito trasferimento tra 5-30 ovociti o embrioni / drop. </li><li> Allegare una cannuccia in un sistema controllato aspirazione bocca e caricarlo seguendo questo ordine: soluzione che, d&#39;aria, con la caduta di congelamento degli ovociti, aria, calo di scongelamento, aria. </li><li> Una volta la paglia viene caricato, mantenere l&#39;aspirazione fino a quando la prima goccia introdotto (soluzione che ho) raggiunge il polimero alla fine superiore della paglia e tenute questo fine. Thermo-seal l&#39;altra estremità della paglia o di tenuta con un tappo in plastica. </li><li> Accendere il congelatore programmabile e selezionare il programma di congelamento. Il programma di congelamento utilizzato in questo protocollo si basa sulla velocità di raffreddamento originariamente pubblicato da Lassalle et al. [7]: <ul><li> 2 ° C / min dalla temperatura ambiente a -7 ° C 0 ° C / min per 10 minuti per consentire l&#39;equilibrio di temperatura e di induzione di semina (vedi sotto) </li><li> 0,3 ° C / min da -7 ° C a -30 ° C 0 ° C / min per 2 minuti per consentire l&#39;equilibrio di temperatura </li><li> 35 ° C / min da -30 ° C a -130 ° C </li></ul></li><li> Caricare le cannucce sugli slot del titolare del congelatore programmabile, assicurandosi che la parte della paglia con la goccia di soluzione di scongelamento è rivolto verso l&#39;esterno. Avviare il programma di congelamento. </li><li> Quando la temperatura del campione raggiunge i -7 ° C ed il raffreddamento è in attesa, effettuare la semina manuale: tuffo la pinza in azoto liquido, tirare i titolari un po &#39;fuori dal freezer per esporre la parte del cannucce contenente le gocce di soluzione di scongelamento, e subito tocco questa parte del cannucce con le pinze. Ripetere per ogni titolare e ogni paglia nel supporto, e poi lasciare che il programma di congelamento fino alla fine. </li><li> Quando il programma è completato, i titolari tuffo in azoto liquido. </li><li> Rimuovere le cannucce daltitolari e loro trasferimento in un alberello con etichetta. </li><li> Infine, memorizzare i alberello all&#39;interno di un serbatoio di azoto liquido. </li></ol> IV. Scongelamento protocollo <ol><li> Rimuovere la cannuccia dal serbatoio di azoto liquido. </li><li> Mantenere la paglia a temperatura ambiente per 40 secondi. </li><li> Mettere a bagno la paglia in un bagno d&#39;acqua a 30 ° C durante 40 secondi. </li><li> Togliere la spina dalla paglia o tagliare il termosaldata punta. </li><li> Svuotare la paglia in un 35-mm piastra di Petri e mescolare delicatamente le due gocce contenenti le soluzioni di congelamento e scongelamento. </li><li> Lascia ovociti / embrioni nella miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferimento ovociti / embrioni di un calo fresco di KSOM-H per altri 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Ovociti / embrioni sono ora pronti per ulteriori manipolazioni. </li></ol> Nota: Durante i passi 6 e 7 si dovrebbe vedere che gli ovociti scongelati / embrioni lentamente si gonfiano a causa di reidratazione. V. Rappresentante Risultati L&#39;utilizzo del protocollo di crioconservazione qui riportati si traduce in un tasso di sopravvivenza di circa il 95% per ovociti di criceto e del&gt; 90%, 85% e 80% per il mouse B6CBAF1 embrioni al pronucleo, 2-cell stadi e 4-celle, rispettivamente. Quando sono embrioni di topo coltivati ​​in vitro in KSOM dopo lo scongelamento, almeno 70 al 80% dovrebbe arrivare allo stadio di blastocisti in condizioni di coltura ottimali. Si raccomanda di includere un gruppo di controllo (paglia) di ovociti / embrioni in ogni esperimento di congelamento e di scongelamento questo gruppo prima del resto degli ovociti / embrioni vengono utilizzati per ulteriori manipolazioni. Se i tassi di sopravvivenza per il gruppo di controllo sono inferiori alle attese, disgelo un&#39;altra paglia dello stesso lotto. Se i tassi di sopravvivenza per questo secondo gruppo sono bassi, scartare il restante cannucce da questo lotto di congelamento.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li>
<li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cooling+rate%2C+warming+rate%2C+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li>
<li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+various+low+temperatures%2C+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival%2C+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li>
<li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobiological+principles+of+embryo+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+In+Vitro+Fert.+Embryo+Transf%22%5BJournal%5D)">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li>
<li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cryopreservation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li>
<li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1%2C2+propanediol%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li>
<li>Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li>
<li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li>
</ol>

Con questo protocollo e ovociti di criceto embrioni di topo possono essere crioconservati con successo. Una volta congelati, gli ovociti / embrioni possono essere conservati in serbatoi di azoto liquido a tempo indeterminato e recuperato in qualsiasi momento o luogo desiderato. Questo offre il vantaggio di avere campioni quasi pronto per l&#39;uso in caso di necessità. D&#39;altra parte, questo protocollo può essere utilizzato anche per generare criobanche embrione di ceppi di topi di valore (come linee transgeniche), come alternativa econo...

<table><tbody><tr><td>Nome del materiale</td><td>Tipo</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commento</td></tr><tr><td>Mini-cannette tipo francese 0,25 ml</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>13407/0010</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td></td><td>Farma-Lepori, Spagna</td><td>749036.4</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td></td><td>Sigma</td><td>H-3884</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo KSOM-H</td><td></td><td></td><td></td><td>Rif. [11]</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td></td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tappi di plastica</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>19046</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td></td><td>Intervet, Spagna</td><td>1.614/8447</td><td></td></tr><tr><td>Propilenglicole</td><td></td><td>Fluka</td><td>82280</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td></td><td>Merck</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BC-060R; BG-061R</td><td></td></tr><tr><td>Termosaldatore</td><td></td><td>SIZ</td><td>220</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 35 e 90 mm</td><td></td><td>Nunc</td><td>153066; 150350</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 10 ml</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>163160</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di azoto</td><td></td><td>MVE, Cryogenics</td><td>XC 43/28</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore programmabile</td><td></td><td>Planner Products Ltd.</td><td>Kryo-10 Series III</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td><td></td></tr></tbody></table>

raccolta e crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embrioni e ovociti crioconservati con successo sono stati più di 30 anni fa, quando Whittingham<i&gt; Et al.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; E Wilmut<sup&gt; 2</sup&gt; Separatamente descritto embrioni di topo che potrebbero essere congelati e conservati a -196 ° C e, pochi anni dopo, Parkening<i&gt; Et al</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; Segnalato la nascita di piccoli vivi da fecondazione in vitro (IVF) di ovociti crioconservati. Da allora, l&#39;uso di tecniche di crioconservazione è rapidamente diffusa a diventare una componente essenziale nella pratica della umana e animale riproduzione assistita e nella conservazione delle risorse genetiche animali. Attualmente, ci sono due metodi principali utilizzati per crioconservare gli ovociti e gli embrioni: il congelamento lento e vitrificazione. Una vasta gamma di approcci sono stati utilizzati per cercare di migliorare sia le tecniche e milioni di animali e migliaia di bambini sono nati da embrioni crioconservati. Tuttavia, le carenze importanti associati alla crioconservazione devono ancora essere superate, in quanto formazione di cristalli di ghiaccio, effetti soluzione e shock osmotico sembrano causare cryoinjuries diversi post-scongelamento degli ovociti e degli embrioni. Congelamento lento con congelatori programmabili ha il vantaggio di usare basse concentrazioni di crioprotettori, che sono di solito associati a tossicità chimica e shock osmotico, ma la loro capacità di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio a basse concentrazioni è limitata. Congelamento lento induce anche gli effetti surraffreddamento che deve essere evitato di usare la semina manuale o automatico<sup&gt; 4</sup&gt;. Nel processo di vetrificazione, alte concentrazioni di crioprotettori inibire la formazione di cristalli di ghiaccio e portare alla formazione di uno stato simile a vetro ceramico in cui è solidificato acqua, ma non ampliato. Tuttavia, a causa della tossicità del cyroprotectants alle concentrazioni utilizzate, gli ovociti / embrioni non può che essere esposti alla soluzione crioprotettore per un periodo di tempo molto breve e in una soluzione di volume minimo, prima sommergendo i campioni direttamente in azoto liquido<sup&gt; 5</sup&gt;. Negli ultimi dieci anni, vetrificazione è diventato più popolare perché è un metodo molto veloce in cui è richiesta nessuna attrezzatura costosa (congelatore programmabile). Tuttavia, il congelamento lento continua ad essere il metodo più utilizzato per ovocita / embrione crioconservazione. In questo video-articolo mostriamo, passo per passo, come raccogliere e lentamente congelare ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.

In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.

Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

Embrioni e ovociti sono stati crioconservati con successo per la prima volta più di 30 anni fa, quando Whittingham et al. 1 e Wilmut 2 descrissero separatamente che il topo ...

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