Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Per tagliare gli assoni utilizzando l'immagine in vivo a due fotoni, posizionare embrioni di pesce zebra anestetizzati all'interno di una goccia di aros mentre si indurisce in una camera specializzata composta da un supporto in TEFLON e un'ampolla coprioggetto. Un vetro ottico viene posizionato sopra la camera, che viene quindi capovolta prima dell'esotomia. Acquisire un'immagine preliminare dell'assone da tagliare con un ingrandimento di 40x, quindi passare a 70x sulla regione da esotomizzare.

E con il laser spento, aumentare la potenza del laser. Accendere brevemente il laser. Nell'immagine residua dell'assone, si osserverà materiale assonale disperso se l'esotomia ha avuto successo.

Ciao, sono Georgia O'Brien. Ciao, sono Sandra Rigo. E io sono Shauna Martin.

E siamo del laboratorio di Alvarez TI del Dipartimento di biologia cellulare molecolare e dello sviluppo presso l'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'esodoscopia a due fotoni e l'acquisizione temporale con microscopia confocale in embrioni di pesce zebra vivi. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni somatosensoriali periferici.

Iniziamo. Per prima cosa, prepareremo una soluzione al 1% di agarosio a basso punto di fusione per l'inclusione. Sciogliamo l'agarosio in acqua doppio distillata riscaldando al microonde, quindi trasferiamo in provette piccole e conserviamo in un blocco riscaldante a 42 gradi Celsius.

I primi embrioni possono essere posizionati in una soluzione di Ringer al 5% di PTU da 22 a 24 ore dopo la fecondazione per inibire la formazione del pigmento, che è fortemente autofluorescente e oscurerebbe gli assoni al microscopio a due fotoni. Successivamente, selezioniamo gli embrioni per l'analisi e rimuoviamo la corion con delicatezza staccandoli con una pinzetta. Una volta selezionati gli embrioni, vengono anestetizzati aggiungendo circa lo 0,02% di trica al Ringer con PTU.

Prima di procedere, assicurarsi che gli animali non rispondano al contatto. Preparare la camera per l'immagine a lungo termine applicando grasso da vuoto su un lato di un anello di vetro o teflon e fissandolo su un vetrino coprioggetto. Fare attenzione a non trasferire gran parte della soluzione di PTU ringer.

Trasferire un embrione nella soluzione di agaro a 42 gradi utilizzando una pipetta di vetro. Successivamente, trasferire l'embrione con una goccia di agaro su un'ogiva preparata. Una volta trasferito, posizionare l'embrione come desiderato mentre l'agaro si indurisce.

Tenere presente che la camera di imaging verrà capovolta al termine, in modo che la lamella di rame risulti sulla superficie superiore. Se si dispone di un palchetto motorizzato e si possono acquisire immagini in più posizioni contemporaneamente, ripetere questi passaggi per ciascun embrione. Attendere che le piastre di agar rosa si solidifichino completamente.

Quindi riempire l'anello con ringer PTU tri canino allo 0,02%. Infine, applicare grasso da vuoto sull'altro lato degli anelli. Quindi coprirli con un vetrino.

Ribaltare le camere di sigillatura. Ora siamo pronti per l'imaging di due dissezioni da quattro tonnellate. Per prepararsi all'imaging, posizionare gli embrioni montati su un portatavola sotto il microscopio.

Concentrarsi su un singolo embrione utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua con apertura numerica di 0,8 a 40x. Quindi accendere il laser. Impostare il laser su una lunghezza d'onda di 910 nanometri e una potenza di 30 milliwatt.

Aprire il software di acquisizione delle immagini. Utilizziamo il software Scan Image sviluppato a Corals per il Boar's Laboratory. A questa potenza, è possibile esaminare il campo alla ricerca di un assone candidato da recidere.

Dopo averlo individuato, acquisire un'immagine dell'assone bersaglio. Indicare la prima e l'ultima posizione in Z, acquisire l'immagine e creare una proiezione massima degli stack in Z. Successivamente, ingrandire di 70x sul ramo dell'assone che si desidera esaminare in dettaglio.

Aumentare la potenza a 180 milliwatt e impostare il numero di slice Z su uno. Eseguire una singola scansione con il laser premendo grab. Questo dovrebbe essere sufficiente per recidere l'assone, tuttavia è necessario ottimizzare questa procedura in base al microscopio e all'obiettivo sperimentale.

Infine, eseguire uno zoom indietro. Ridurre la potenza a 30 milliwatt e acquisire un'immagine dell'assone appena reciso. Se uno microscopio a due fotoni su misura non è disponibile nel vostro laboratorio, anche il microscopio confocale a due fotoni Zes five 10 può essere utilizzato per recidere gli assoni.

Iniziamo posizionando l'embrione montato sul palchetto e mettendolo a fuoco utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 25x. Successivamente, attivare i laser a due fotoni e al neon in una configurazione multitraccia in modo da poter passare agevolmente dall'uno all'altro. Sebbene entrambi i laser vengano utilizzati per rilevare la GFP, l'emissione a due fotoni viene visualizzata in rosso e l'emissione del laser al neon in verde.

Per differenziarli, utilizzare il laser di Argonne per identificare un assone da mantenere nelle impostazioni Z. Contrassegnare la prima e l'ultima sezione ottica. Acquisire un'immagine confocale e creare una proiezione massima di Zack.

Spegnere il laser ad argon e accendere la scansione con il laser a due fotoni a un'intensità di circa il 9% di trasmissione. Per assicurarsi che l'assone sia ancora a fuoco, fare clic sul pulsante di arresto in modo che lo strumento di ritaglio sia disponibile. Utilizzare il ritaglio per ingrandire l'area di interesse.

Di solito si ingrandisce fino a circa 70 x. Scegliere la regione dell'assone da lesionare e portare questa regione a fuoco. L'ingrandimento può essere verificato nella scheda modalità.

Successivamente, nella scheda canali, modificare l'intensità dei due fotoni da circa il 9% di trasmissione al 15-30% di trasmissione. Per attivare le nuove impostazioni, fare clic sul pulsante XY rapido e quindi interrompere immediatamente dopo. Per evitare danni eccessivi, l'assone dovrebbe apparire come detriti dispersi se la procedura ha avuto successo.

Infine, per assicurarsi che l'assone sia effettivamente danneggiato, tornare al laser ad argon di 488 nanometri. Acquisire un'altra immagine confocale e creare una proiezione massima dei Zacks. Ora che sono stati illustrati due metodi per recidere gli assoni mediante microscopia laser a due fotoni, si esaminerà l'acquisizione confocale in TimeLapse della rigenerazione utilizzando il zes LSM cinque 10.

Per preparare l'acquisizione di immagini in time lapse, assicurarsi di accendere il palco riscaldato almeno 30 minuti prima di impostare il filmato in time lapse. Posizionare gli embrioni montati su un portacampioni sotto il microscopio. Mettere a fuoco un embrione con l'obiettivo a immersione d'aria desiderato.

Utilizziamo un obiettivo con apertura numerica 20 x 0,5, apriamo il software di imaging Zeiss LSM five 10 e quindi attiviamo i laser appropriati e configuriamo l'impostazione desiderata. Apriamo la scan stage e le finestre multitemporali. Se si dispone del software multitemporale, definire la posizione e la configurazione del primo embrione nella finestra multitemporale.

Attivare la scansione rapida nella finestra di scansione, quindi spostare la piastra nella posizione XY desiderata. Contrassegnare la prima e l'ultima posizione Z nella finestra di scansione. Premere stop e quindi anche mid nella finestra di scansione, attendere il completamento della scansione della fetta Z centrale.

Quindi premere il pulsante "segna posizione" nella finestra della piastra. Se si sta acquisendo l'immagine di un solo embrione, fare clic sulla scheda posizione singola nella finestra multitemporale. Fare clic su sostituisci X, y, z. Quindi fare clic su salva configurazione.

Accetta quando viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Ora è possibile impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini nella finestra multi lo. Se si dispone di un palchetto motorizzato, è possibile impostare più posizioni per acquisire immagini di più embrioni.

In questo caso, è necessario selezionare la scheda posizioni multiple prima di definire le coordinate X, Y, Z e la configurazione per la prima posizione. Inoltre, assicurarsi che il menu a discesa appena sotto la scheda posizioni multiple sia impostato su posizione uno e che il menu a discesa nella sezione configurazione indichi multi lo uno. Prima di fare clic su salva configurazione, definire la posizione e la configurazione dei restanti embrioni nella finestra multi-temporale.

Individuare la prossima scansione rapida dell'embrione, quindi spostare la piastra nella posizione XY desiderata e segnare la prima e l'ultima posizione Z nella finestra di scansione. Premere interrompi. Quindi anche al centro nella finestra di scansione, attendere il completamento della scansione della sezione Z centrale.

Quindi premere il pulsante "segna posizione". Nella finestra dello stadio, fare clic su sostituisci X, Y, Z. Verificare che il menu a discesa appena sotto la scheda posizioni multiple sia impostato su posizione due e che il menu a discesa nella sezione configurazione indichi "multi lobo due". Quindi fare clic su salva configurazione. Confermare. Quando richiesto di sovrascrivere la configurazione precedente, ripetere questo processo per gli embrioni rimanenti.

Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini nella finestra multi lo. Selezionare l'opzione GR GL nell'elenco della sezione del blocco. Quindi inserire il numero desiderato di ripetizioni del gruppo.

Questo rappresenta il numero di volte in cui il confocale acquisirà un'immagine in ciascuna posizione. Inserire l'intervallo di peso desiderato nella sezione dei parametri. Questo indica la durata compresa tra l'inizio di una ripetizione di acquisizione e l'inizio della successiva.

Selezionare Zack XY nella sezione di configurazione. Inserire il nome file di base nella sezione inferiore. Fare clic su seleziona database immagini e scegliere il proprio database.

Fare clic sul pulsante delle opzioni, quindi selezionare la cartella MDB per salvare anche i file temporanei. Selezionare l'opzione per mantenere aperta l'immagine finale. Salvare l'immagine finale, al centro di Zack, e selezionare l'intervallo di peso.

Fare clic su OK per chiudere la finestra delle opzioni, quindi fare clic su ora di inizio. Lasciare la finestra multi-temporale aperta per tutta la durata dell'acquisizione delle immagini. Ora è il momento di analizzare i dati.

Al termine dell'acquisizione con imaging a intervalli temporali, il software multi-temporale compilerà tutti i file temporanei in un file di riepilogo per ciascuna posizione. Se si desidera interrompere il filmato prima che sia completato, assicurarsi di premere fine invece di stop, in modo che venga creato un file di riepilogo.

I file temporanei e i file di riepilogo dovrebbero essere salvati automaticamente nella cartella MDB designata. Di seguito è riportato un esempio rappresentativo di un filmato confocale a intervalli temporali che documenta l'ex otomia a 54 ore dalla fecondazione. Il primo fotogramma mostra una vista dorsale dell'assone prima dell'ex otomia, con una freccia gialla che indica il sito dell'ex otomia nel tempo successivo.

Il filmato time-lapse inizia entro un'ora dall'esotomia e dura 12 ore. Una serie confocale viene raccolta ogni 20 minuti. Questo filmato confocale in time-lapse viene registrato utilizzando gli stessi parametri a 78 ore dalla fecondazione.

Il primo fotogramma mostra una vista laterale dell'assone prima dell'esosodomia, con una freccia gialla che indica il sito di esosodomia. Vi abbiamo appena mostrato come generare danni tissutali precisi e visualizzare embrioni di pesce zebra vivi mediante esosodomia a due fotoni e imaging confocale a intervalli di tempo. Quando si esegue questa procedura, è importante ottimizzare la quantità di potenza utilizzata per l'esosodomia laser a due fotoni per evitare danni eccessivi.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.