Name: Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Scopri la tecnica di assotomia a due fotoni e imaging confocale time-lapse in embrioni di zebrafish vivo. Questo metodo consente di studiare la degenerazione e rigenerazione degli assoni periferici in neuroscienza.

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Ringraziamo Segna Terasaki per la consulenza iniziale utilizzando un microscopio a due fotoni per creare danni del tessuto locale, Kathy Joubin per un consiglio su montaggio per time-lapse imaging, ed i laboratori Sagasti e Portera-Cailliau per le discussioni. Le prime esperienze sono state eseguite da AS come Fellow Grass Fondazione presso i laboratori di biologia marina di Woods Hole, Massachusetts. Lavoro in laboratorio Sagasti è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Whitehall, la Fondazione Klingenstein, e un Premio alla Carriera Burroughs Wellcome Fondo in Scienze Biologiche.

Parte 1: embrioni di zebrafish di montaggio a lungo termine di imaging <ol><li> Preparare 1% bassa temperatura di fusione soluzione di agarosio per l&#39;incorporamento. Sciogliere agarosio in acqua deionizzata da riscaldamento in un forno a microonde, aliquota in tubi piccoli e conservare in un blocco di riscaldamento a 42 gradi Celsius. </li><li> Selezionare gli embrioni per l&#39;imaging e rimuovere la loro chorions tirando delicatamente il corion a parte con una pinza. Gli embrioni possono essere inseriti in una soluzione al 5% PTU Ringers a 22-24 ore dopo la fecondazione (HPF) di inibire la formazione di pigmento. Ciò migliora la chiarezza delle immagini ed è essenziale per l&#39;esecuzione di due fotoni axotomies degli assoni sensitivi. Se il pigmento naturale è consentito di formare, autofluorescenza oscura assoni sul microscopio a due fotoni. Suonerie soluzione per zebrafish contiene 116 mm NaCl, 2.9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2 e HEPES 5mm, pH 7,2. </li><li> Anestetizzare gli embrioni con l&#39;aggiunta di ~ 0,02% tricaine al Ringers PTU. Assicurarsi che gli animali non sono sensibili al tatto prima di procedere. </li><li> Preparare a lungo termine della camera di imaging mediante l&#39;applicazione di grasso per vuoto ad un lato di un anello in vetro o in teflon e fissaggio su un vetrino di vetro. </li><li> Trasferimento di un embrione nella soluzione di 42 gradi agarosio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non trasferire gran parte del Ringers PTU, poi trasferire l&#39;embrione con una goccia di agarosio su un vetrino preparato. </li><li> Posizionare l&#39;embrione come desiderato come l&#39;agarosio si indurisce. Tenete presente che la camera di imaging saranno invertite quando si è fatto in modo che la polizza di copertura sarà la superficie superiore. </li><li> Se si dispone di uno stadio motorizzato e può posizioni più immagini in una sola volta, ripetere i passaggi 1,4-1,6 per ogni embrione. </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare completamente, quindi riempire l&#39;anello con il 0,02% tricaine Ringers PTU. </li><li> Ingrassare vuoto dall&#39;altra parte del ring (s), quindi coprire l&#39;anello (s) con una lastra di vetro. Capovolgere la camera stagna (s) finita. Queste camere possono essere utilizzate per l&#39;imaging su microscopi diritta o capovolta. </li></ol> Parte 2: due fotoni assotomia utilizzando un custom microscopio a due fotoni con un Ti-Sapphire Chameleon laser <ol><li> Prepararsi per l&#39;imaging. Posizionare l&#39;embrione (s) montati su un supporto per diapositive sotto il microscopio. Focus su un embrione con un 40X (0,8 NA) obiettivo di acqua. Accendere il laser. Siamo stati in grado di visualizzare in modo riproducibile e danneggiare i neuroni che esprimono GFP utilizzando i seguenti parametri. Per visualizzare gli assoni a non danneggiare il potere, di laser a una lunghezza d&#39;onda di 910 nanometri (nm) e una potenza di 30 milliwatt (mW elencati sono la quantità di potenza del campione). Aprire il software di imaging. Noi utilizziamo software scanimage sviluppato nel laboratorio di Karel Svoboda 2, 3. </li><li> Premere il fuoco per eseguire la scansione l&#39;embrione con il laser a due fotoni, individuare l&#39;assone si desidera axotomize, e catturare un&#39;immagine di questo assone. Segnare le posizioni prima e l&#39;ultima Z, acquisire l&#39;immagine, e fare una sporgenza massima delle pile Z. </li><li> Zoom 70X sul ramo del assone si desidera axotomize e interrompere la scansione. Aumentare la mW a campione per il potenziale nocivo di 180 mW, ed eseguire una singola scansione con il laser. Facciamo questo impostando il numero di fette Z a 1 e premendo &quot;Grab&quot;. Questo dovrebbe essere sufficiente per tagliare l&#39;assone. Si veda la discussione di metodi per ottimizzare questa procedura per il microscopio e l&#39;obiettivo sperimentale. </li><li> Ridurre, ridurre la potenza a 30 mW e scattare una foto. </li></ol> Parte 3: a due fotoni assotomia il microscopio confocale Zeiss 510 / a due fotoni <ol><li> Luogo embrione montato sul palco e portarlo a fuoco con un obiettivo 25X acqua o altro obiettivo adeguato. </li><li> Accendere i due fotoni (910 nm) e argon (488 nm) in un ambiente multi-traccia in modo che sia possibile passare da uno all&#39;altro. Sebbene entrambi i laser sono utilizzati per rilevare GFP, i due fotoni emissione viene visualizzata con il rosso e l&#39;emissione argon laser verde per differenziare i due. </li><li> Usare il laser ad argon per identificare un assone a ferire. Sotto Z impostazioni segnare le sezioni prima e l&#39;ultima ottica. Prendete un immagine confocale e di creare una proiezione massima dello stack Z. </li><li> Scegli la regione dell&#39;assone di essere feriti e portare questa regione a fuoco. Spegnere il laser Argon e accendere i due fotoni del laser. Scansione del campione con i due fotoni ad una intensità del laser di trasmissione ~ 9% per assicurarsi che l&#39;assone è ancora a fuoco. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;stop&quot; in modo che lo strumento di ritaglio sarà disponibile. Dell&#39;uso delle colture per ingrandire l&#39;area di interesse. Di solito ci zoom ~ 70X (zoom può essere verificato sotto la scheda &quot;modalità&quot;). Nella scheda &quot;canali&quot; modificare l&#39;intensità dei due fotoni dalla trasmissione ~ 9% al 15-20% di trasmissione. </li><li> Per tagliare un assone attivare il &quot;fast XY&quot; pulsante per circa 1 secondo e quindi premere il pulsante di arresto per evitare danni in eccesso. L&#39;assone dovrebbe essere visto come detriti sparsi se la procedura ha funzionato. </li><li> Per garantire che l&#39;assoneè stato danneggiato tornare al 488 nm Argon laser, prendere un&#39;altra immagine confocale, e creare una proiezione massima. </li></ol> Parte 4: confocale time-lapse imaging Zeiss LSM 510 <ol><li> Prepararsi per l&#39;imaging. Se si utilizza uno stadio riscaldato, assicurarsi di accenderlo almeno 30 minuti prima di configurare il time-lapse film. Posizionare l&#39;embrione (s) montati su un supporto per diapositive sotto il microscopio. Focus su un embrione con l&#39;obiettivo d&#39;aria desiderato. Usiamo un 20X, 0,5 obiettivo NA. Aprire Zeiss LSM 510 software di imaging. Accendere il laser appropriato e impostare la configurazione desiderata. Noi ora descrivere un protocollo dettagliato per l&#39;imaging a lungo termine con il software Zeiss LSM Tempo Multi. Questi metodi possono essere adattati per essere utilizzati sul vostro microscopio proprio con il software di imaging. </li><li> Definire la posizione e la configurazione del vostro primo embrione nella finestra di tempo Multi. Aprire la scansione, lo stadio, e le finestre Tempo Multi. Attivare rapidamente la scansione nella finestra di scansione. Spostare lo stadio fino alla posizione XY desiderata. Segnare le posizioni prima e l&#39;ultima Z nella finestra di scansione. Premere stop, poi media, anche nella finestra di scansione. Attendere che la scansione della fetta centrale Z per finire, quindi premere posizione marchio nella finestra palco. Se siete solo un embrione di imaging, clicca sul &quot;Single Location&quot; scheda nella finestra Tempo Multi. Clicca su &quot;Sostituisci XYZ&quot; e poi su &quot;Save Configuration&quot;. D&#39;accordo quando gli viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Passare al punto 4.4. Se si dispone di un palcoscenico meccanizzato, è possibile impostare diverse posizioni di embrioni immagini multiple. In questo caso, è necessario selezionare il &quot;Multiple Locations&quot; scheda prima di definire la XYZ e la configurazione per la vostra prima posizione. Inoltre, assicurarsi che il menu a tendina appena sotto il &quot;Multiple Locations&quot; scheda è in posizione 1, e che il menu a tendina nella sezione di configurazione dice più loc 1, prima di fare clic su Salva configurazione. </li><li> Definire la posizione e la configurazione del vostro embrioni rimanenti nella finestra di tempo Multi. Individuare l&#39;embrione successivo, quindi premere veloce scansione, spostare lo stage nella posizione desiderata XY, e segnare le posizioni prima e l&#39;ultima Z nella finestra di scansione. Premere stop, poi media, anche nella finestra di scansione. Attendere che la scansione della fetta centrale Z per finire, quindi premere posizione marchio nella finestra palco. Clicca su &quot;Sostituisci XYZ&quot;. Verificare che il menu a tendina appena sotto il &quot;Multiple Locations&quot; scheda è in posizione 2, e che il menu a tendina nella sezione di configurazione dice più loc 2, quindi fare clic su &quot;Salva configurazione&quot;. D&#39;accordo quando gli viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Ripetere la procedura per gli embrioni rimanenti. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;acquisizione delle immagini nella finestra Multi Loc. Scegli la GR-GL opzione nella sezione &quot;Elenco delle Blocchi&quot;, quindi immettere il numero desiderato di ripetizioni di gruppo. Questo è il numero di volte che il confocale acquisirà l&#39;immagine in ogni sede. Inserire l&#39;intervallo di attesa desiderato nella sezione Parametri. Questa è la quantità di tempo dall&#39;inizio di una ripetizione di imaging per l&#39;inizio della ripetizione successiva. Selezionare &quot;ZStackXY&quot; nella sezione di configurazione. Inserisci il tuo nome base del file nella sezione inferiore. Clicca su &quot;DB Seleziona immagine&quot; e scegli il tuo mdb. Fare clic sul pulsante &quot;Opzioni&quot;. Selezionare la cartella mdb per salvare i file temporanei. Check &quot;tenere immagine finale aperto&quot;, &quot;salva immagine finale&quot;, e &quot;mezzo della pila z&quot;. Seleziona aspettare intervallo. Fare clic su OK per chiudere la finestra delle opzioni. Clicca su &quot;Start Time&quot;. Lascia finestra Tempo Multi aperta per la durata di imaging. </li><li> Analizzare i dati. Quando il time-lapse imaging ha finito, il software Multi Ora compila tutti i file temporanei in un file di riepilogo per ogni località. Se si desidera interrompere il film prima che sia completa, assicurarsi di premere il tasto &quot;Fine&quot; invece di &quot;Stop&quot;, in modo che un file di riepilogo verrà creato. I file temporanei e file di sintesi deve essere salvato automaticamente nella cartella mdb designata. Dal menu del software LSM, clicca su &quot;View 3D&quot;, poi &quot;proiezione&quot;. Con il vostro file di riepilogo selezionata nel menu a discesa, fare clic su &quot;Applica&quot;. Questo genererà proiezioni massima dello stack Z per ogni immagine confocale. Nel menu del software LSM, cliccare su &quot;File&quot;, poi &quot;Esporta&quot;. Salva le proiezioni al massimo come una serie di file con estensione tif. Si può quindi creare un film della serie di file tif utilizzando ImageJ o QuickTime Pro. Assoni nelle immagini LSM può essere rintracciata in tre dimensioni utilizzando software di analisi dell&#39;immagine (per esempio NeuroLucida da MicroBrightfield) per generare dettagliate informazioni quantitative sulla morfologia degli assoni. </li></ol> Parte 5: risultati Rappresentante Un esperimento riuscito si tradurrà in una rappresentazione accurata della dinamica cellulares di recupero degli assoni da un infortunio. Il tuo embrioni saranno sani dopo l&#39;imaging, senza degenerazione visibile e un battito cardiaco forte. Il assotomia dovrebbe causare danni preciso, solo tagliando il ramo definito dell&#39;assone. Non dovrebbero esserci lesioni al assoni circostante e la morte delle cellule minime. Noi crediamo di vedere la morte di una singola cellula epidermica direttamente sul sito di assotomia in ~ 50% degli esperimenti. Se si osservano più danni, si dovrebbe ottimizzare le due fotoni protocollo, come descritto nella discussione.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

Abbiamo usato i metodi descritti per axotomize proprio assoni periferici sensoriali e di osservare direttamente la rigenerazione di un embrione in zebrafish vivente. A lungo termine time-lapse confocale in zebrafish può essere usato per osservare molti processi di sviluppo in vivo. I due fotoni assotomia procedura descritta può essere modificata per molti scopi diversi sperimentali. Abbiamo usato la stessa procedura generale per l&#39;ablazione intero trigemino corpi cellulari dei neuroni sensoriali, con lo zoo...

due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish sono stati a lungo utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo da parte time-lapse imaging del embrione vivente trasparente. Qui si descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging e di dimostrare come automatizzare la cattura di time-lapse immagini utilizzando un microscopio confocale. Abbiamo anche descrivere un metodo per creare controllato e preciso per i danni di singoli rami periferici assoni sensoriali in zebrafish utilizzando la potenza concentrata di un laser a femtosecondi montato su un microscopio a due fotoni. I parametri per il successo a due fotoni assotomia deve essere ottimizzato per ogni microscopio. Dimostreremo a due fotoni assotomia sia su un personalizzato costruito a due fotoni e un microscopio Zeiss 510 / confocale a due fotoni per fornire due esempi. Zebrafish neuroni sensoriali del trigemino possono essere visualizzati in una linea transgenici che esprimono GFP guidata da un promotore dei neuroni sensoriali specifici 1. Abbiamo adattato questo modello zebrafish trigemino di osservare direttamente la rigenerazione degli assoni sensitivi in ​​vita embrioni di zebrafish. Embrioni sono anestetizzati con tricaine e posizionato all&#39;interno di una goccia di agarosio come si solidifica. Embrioni immobilizzati sono sigillati all&#39;interno di una camera piena di immagini phenylthiourea (PTU) suonerie. Abbiamo scoperto che gli embrioni possono essere continuamente ripreso in queste camere per 12-48 ore. Una singola immagine confocale viene poi catturato per determinare il sito desiderato assotomia. La regione di interesse si trova sul microscopio a due fotoni per immagini gli assoni sensoriali in basso, che non infligge danno potere. Dopo lo zoom sul sito desiderato assotomia, la potenza è aumentata e una singola scansione di quella regione definita è sufficiente per recidere l&#39;assone. Multiple location time-lapse imaging è quindi impostare su un microscopio confocale per osservare direttamente il recupero da un infortunio assonale.

Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

I zebrafish sono stati a lungo utilizzati per studiare i meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo attraverso l'imaging time-lapse dell'embrione vivente trasparente.

Per tagliare gli assoni utilizzando l'immagine in vivo a due fotoni, posizionare embrioni di pesce zebra anestetizzati all'interno di una goccia di aros mentre si indurisce in una camera specializzata composta da un supporto in TEFLON e un'ampolla coprioggetto. Un vetro ottico viene posizionato sopra la camera, che viene quindi capovolta prima dell'esotomia. Acquisire un'immagine preliminare dell'assone da tagliare con un ingrandimento di 40x, quindi passare a 70x sulla regione da esotomizzare.E con il laser spento, aumentare la potenza del laser. Accendere brevemente il laser. Nell'immagine residua dell'assone, si osserverà materiale assonale disperso se l'esotomia ha avuto successo.Ciao, sono Georgia O'Brien. Ciao, sono Sandra Rigo. E io sono Shauna Martin.E siamo del laboratorio di Alvarez TI del Dipartimento di biologia cellulare molecolare e dello sviluppo presso l'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'esodoscopia a due fotoni e l'acquisizione temporale con microscopia confocale in embrioni di pesce zebra vivi. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni somatosensoriali periferici.Iniziamo. Per prima cosa, prepareremo una soluzione al 1% di agarosio a basso punto di fusione per l'inclusione. Sciogliamo l'agarosio in acqua doppio distillata riscaldando al microonde, quindi trasferiamo in provette piccole e conserviamo in un blocco riscaldante a 42 gradi Celsius.I primi embrioni possono essere posizionati in una soluzione di Ringer al 5% di PTU da 22 a 24 ore dopo la fecondazione per inibire la formazione del pigmento, che è fortemente autofluorescente e oscurerebbe gli assoni al microscopio a due fotoni. Successivamente, selezioniamo gli embrioni per l'analisi e rimuoviamo la corion con delicatezza staccandoli con una pinzetta. Una volta selezionati gli embrioni, vengono anestetizzati aggiungendo circa lo 0,02% di trica al Ringer con PTU.Prima di procedere, assicurarsi che gli animali non rispondano al contatto. Preparare la camera per l'immagine a lungo termine applicando grasso da vuoto su un lato di un anello di vetro o teflon e fissandolo su un vetrino coprioggetto. Fare attenzione a non trasferire gran parte della soluzione di PTU ringer.Trasferire un embrione nella soluzione di agaro a 42 gradi utilizzando una pipetta di vetro. Successivamente, trasferire l'embrione con una goccia di agaro su un'ogiva preparata. Una volta trasferito, posizionare l'embrione come desiderato mentre l'agaro si indurisce.Tenere presente che la camera di imaging verrà capovolta al termine, in modo che la lamella di rame risulti sulla superficie superiore. Se si dispone di un palchetto motorizzato e si possono acquisire immagini in più posizioni contemporaneamente, ripetere questi passaggi per ciascun embrione. Attendere che le piastre di agar rosa si solidifichino completamente.Quindi riempire l'anello con ringer PTU tri canino allo 0,02%. Infine, applicare grasso da vuoto sull'altro lato degli anelli. Quindi coprirli con un vetrino.Ribaltare le camere di sigillatura. Ora siamo pronti per l'imaging di due dissezioni da quattro tonnellate. Per prepararsi all'imaging, posizionare gli embrioni montati su un portatavola sotto il microscopio.Concentrarsi su un singolo embrione utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua con apertura numerica di 0,8 a 40x. Quindi accendere il laser. Impostare il laser su una lunghezza d'onda di 910 nanometri e una potenza di 30 milliwatt.Aprire il software di acquisizione delle immagini. Utilizziamo il software Scan Image sviluppato a Corals per il Boar's Laboratory. A questa potenza, è possibile esaminare il campo alla ricerca di un assone candidato da recidere.Dopo averlo individuato, acquisire un'immagine dell'assone bersaglio. Indicare la prima e l'ultima posizione in Z, acquisire l'immagine e creare una proiezione massima degli stack in Z. Successivamente, ingrandire di 70x sul ramo dell'assone che si desidera esaminare in dettaglio.Aumentare la potenza a 180 milliwatt e impostare il numero di slice Z su uno. Eseguire una singola scansione con il laser premendo grab. Questo dovrebbe essere sufficiente per recidere l'assone, tuttavia è necessario ottimizzare questa procedura in base al microscopio e all'obiettivo sperimentale.Infine, eseguire uno zoom indietro. Ridurre la potenza a 30 milliwatt e acquisire un'immagine dell'assone appena reciso. Se uno microscopio a due fotoni su misura non è disponibile nel vostro laboratorio, anche il microscopio confocale a due fotoni Zes five 10 può essere utilizzato per recidere gli assoni.Iniziamo posizionando l'embrione montato sul palchetto e mettendolo a fuoco utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 25x. Successivamente, attivare i laser a due fotoni e al neon in una configurazione multitraccia in modo da poter passare agevolmente dall'uno all'altro. Sebbene entrambi i laser vengano utilizzati per rilevare la GFP, l'emissione a due fotoni viene visualizzata in rosso e l'emissione del laser al neon in verde.Per differenziarli, utilizzare il laser di Argonne per identificare un assone da mantenere nelle impostazioni Z. Contrassegnare la prima e l'ultima sezione ottica. Acquisire un'immagine confocale e creare una proiezione massima di Zack.Spegnere il laser ad argon e accendere la scansione con il laser a due fotoni a un'intensità di circa il 9% di trasmissione. Per assicurarsi che l'assone sia ancora a fuoco, fare clic sul pulsante di arresto in modo che lo strumento di ritaglio sia disponibile. Utilizzare il ritaglio per ingrandire l'area di interesse.Di solito si ingrandisce fino a circa 70 x. Scegliere la regione dell'assone da lesionare e portare questa regione a fuoco. L'ingrandimento può essere verificato nella scheda modalità.Successivamente, nella scheda canali, modificare l'intensità dei due fotoni da circa il 9% di trasmissione al 15-30% di trasmissione. Per attivare le nuove impostazioni, fare clic sul pulsante XY rapido e quindi interrompere immediatamente dopo. Per evitare danni eccessivi, l'assone dovrebbe apparire come detriti dispersi se la procedura ha avuto successo.Infine, per assicurarsi che l'assone sia effettivamente danneggiato, tornare al laser ad argon di 488 nanometri. Acquisire un'altra immagine confocale e creare una proiezione massima dei Zacks. Ora che sono stati illustrati due metodi per recidere gli assoni mediante microscopia laser a due fotoni, si esaminerà l'acquisizione confocale in TimeLapse della rigenerazione utilizzando il zes LSM cinque 10.Per preparare l'acquisizione di immagini in time lapse, assicurarsi di accendere il palco riscaldato almeno 30 minuti prima di impostare il filmato in time lapse. Posizionare gli embrioni montati su un portacampioni sotto il microscopio. Mettere a fuoco un embrione con l'obiettivo a immersione d'aria desiderato.Utilizziamo un obiettivo con apertura numerica 20 x 0,5, apriamo il software di imaging Zeiss LSM five 10 e quindi attiviamo i laser appropriati e configuriamo l'impostazione desiderata. Apriamo la scan stage e le finestre multitemporali. Se si dispone del software multitemporale, definire la posizione e la configurazione del primo embrione nella finestra multitemporale.Attivare la scansione rapida nella finestra di scansione, quindi spostare la piastra nella posizione XY desiderata. Contrassegnare la prima e l'ultima posizione Z nella finestra di scansione. Premere stop e quindi anche mid nella finestra di scansione, attendere il completamento della scansione della fetta Z centrale.Quindi premere il pulsante "segna posizione" nella finestra della piastra. Se si sta acquisendo l'immagine di un solo embrione, fare clic sulla scheda posizione singola nella finestra multitemporale. Fare clic su sostituisci X, y, z. Quindi fare clic su salva configurazione.Accetta quando viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Ora è possibile impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini nella finestra multi lo. Se si dispone di un palchetto motorizzato, è possibile impostare più posizioni per acquisire immagini di più embrioni.In questo caso, è necessario selezionare la scheda posizioni multiple prima di definire le coordinate X, Y, Z e la configurazione per la prima posizione. Inoltre, assicurarsi che il menu a discesa appena sotto la scheda posizioni multiple sia impostato su posizione uno e che il menu a discesa nella sezione configurazione indichi multi lo uno. Prima di fare clic su salva configurazione, definire la posizione e la configurazione dei restanti embrioni nella finestra multi-temporale.Individuare la prossima scansione rapida dell'embrione, quindi spostare la piastra nella posizione XY desiderata e segnare la prima e l'ultima posizione Z nella finestra di scansione. Premere interrompi. Quindi anche al centro nella finestra di scansione, attendere il completamento della scansione della sezione Z centrale.Quindi premere il pulsante "segna posizione". Nella finestra dello stadio, fare clic su sostituisci X, Y, Z. Verificare che il menu a discesa appena sotto la scheda posizioni multiple sia impostato su posizione due e che il menu a discesa nella sezione configurazione indichi "multi lobo due". Quindi fare clic su salva configurazione. Confermare. Quando richiesto di sovrascrivere la configurazione precedente, ripetere questo processo per gli embrioni rimanenti.Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini nella finestra multi lo. Selezionare l'opzione GR GL nell'elenco della sezione del blocco. Quindi inserire il numero desiderato di ripetizioni del gruppo.Questo rappresenta il numero di volte in cui il confocale acquisirà un'immagine in ciascuna posizione. Inserire l'intervallo di peso desiderato nella sezione dei parametri. Questo indica la durata compresa tra l'inizio di una ripetizione di acquisizione e l'inizio della successiva.Selezionare Zack XY nella sezione di configurazione. Inserire il nome file di base nella sezione inferiore. Fare clic su seleziona database immagini e scegliere il proprio database.Fare clic sul pulsante delle opzioni, quindi selezionare la cartella MDB per salvare anche i file temporanei. Selezionare l'opzione per mantenere aperta l'immagine finale. Salvare l'immagine finale, al centro di Zack, e selezionare l'intervallo di peso.Fare clic su OK per chiudere la finestra delle opzioni, quindi fare clic su ora di inizio. Lasciare la finestra multi-temporale aperta per tutta la durata dell'acquisizione delle immagini. Ora è il momento di analizzare i dati. Al termine dell'acquisizione con imaging a intervalli temporali, il software multi-temporale compilerà tutti i file temporanei in un file di riepilogo per ciascuna posizione. Se si desidera interrompere il filmato prima che sia completato, assicurarsi di premere fine invece di stop, in modo che venga creato un file di riepilogo.I file temporanei e i file di riepilogo dovrebbero essere salvati automaticamente nella cartella MDB designata. Di seguito è riportato un esempio rappresentativo di un filmato confocale a intervalli temporali che documenta l'ex otomia a 54 ore dalla fecondazione. Il primo fotogramma mostra una vista dorsale dell'assone prima dell'ex otomia, con una freccia gialla che indica il sito dell'ex otomia nel tempo successivo.Il filmato time-lapse inizia entro un'ora dall'esotomia e dura 12 ore. Una serie confocale viene raccolta ogni 20 minuti. Questo filmato confocale in time-lapse viene registrato utilizzando gli stessi parametri a 78 ore dalla fecondazione.Il primo fotogramma mostra una vista laterale dell'assone prima dell'esosodomia, con una freccia gialla che indica il sito di esosodomia. Vi abbiamo appena mostrato come generare danni tissutali precisi e visualizzare embrioni di pesce zebra vivi mediante esosodomia a due fotoni e imaging confocale a intervalli di tempo. Quando si esegue questa procedura, è importante ottimizzare la quantità di potenza utilizzata per l'esosodomia laser a due fotoni per evitare danni eccessivi.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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JoVE Journal

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Biologia

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di...

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Questo video descrive il metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish utilizzando l'assotomia laser a due fotoni e osservando il recupero assonale da una lesione.

Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

Fonte: Williams, A. L., et al. Imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione delle cellule neurali in cresta in migrazione negli embrioni di zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra un protocollo di imaging time-lapse multi-fotone per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di zebrafish in tempo reale con alta risoluzione.

Visualizzazione della migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di pesce zebra utilizzando l'imaging time lapse multi-fotone

Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Dimostriamo un metodo che sfrutta la microscopia confocale a scansione rapida per eseguire l'imaging dal vivo delle cellule della microglia nel tectum ottico del pesce zebra in via di sviluppo, consentendo l'analisi della dinamica di queste cellule in vivo.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Scopri la tecnica di assotomia a due fotoni e imaging confocale time-lapse in embrioni di zebrafish vivo. Questo metodo consente di studiare la degenerazione e rigenerazione degli assoni periferici in neuroscienza.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

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