Name: Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Impara la dissezione degli aschi di Saccharomyces cerevisiae per l'analisi genetica meiotica. Questa tecnica di micromanipolazione consente di selezionare zigoti diploidi e identificare i genotipi delle singole cellule.

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Lavoro in laboratorio dell&#39;autore è finanziato dal Canadian Institutes of Health Research, la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, le scienze naturali e ingegneria Research Council e Concordia University.

Costruzione di ceppi diploidi Protocollo per la produzione di diploidi con l&#39;accoppiamento <ol><li> I ceppi iniziale deve essere colpito sulla media YPD, o selettivo, se necessario, per la produzione di singole colonie. I due ceppi aploidi dovrebbe essere di tipo accoppiamento opposto (cioè Mata e MATα). </li><li> Utilizzando un&#39;ansa sterile inoculazione raccogliere una piccola porzione di una colonia da uno dei due ceppi aploidi. Su una striscia nuova piastra YPD il ciclo una volta in linea retta tutta la piastra. Segnare la direzione della striscia con una freccia sul fondo del piatto. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per il secondo ceppo sulla stessa piastra YPD. Questa volta la vena colonia perpendicolare alla prima, attraversando la striscia prima con la seconda. Segnare la direzione della striscia secondo e nota l&#39;area in cui la vena seconda attraversa il primo. Questa zona sarà dove diploidi saranno prodotti. </li><li> Incubare la piastra YPD a 30 ° C durante la notte. </li><li> Replica piastra la piastra YPD su terreni selettivi che permettono selettivamente la crescita della neo-costituita diploidi. </li><li> Scegli una singola colonia, se possibile, o una piccola porzione della stria diploide e strisciare sullo stesso mezzo selettivo per generare singole colonie. </li></ol> Sporulazione e la digestione di aschi Protocollo <ol><li> Scegli singole colonie dalla piastra sopra e fai piccoli (1 cm x 1 cm) patch su sporulazione (SPO) piastre e incubare a 30 ° C per 3-7 giorni a sporulare. </li><li> Sporulazione può essere controllato, cercando in cellule di ogni patch sotto un microscopio ottico. Cellule posto su un vetrino da microscopio in 5-10 microlitri di acqua, mettere un coprioggetto sulla parte superiore della goccia, e cercare la presenza di aschi. Se aschi non si trovano facilmente poi rimesso nell&#39;incubatrice. </li><li> Se c&#39;è sporulazione efficace in una delle patch, preparare una sterile tubo 15 ml coniche con 100μL di succo di tetrade. </li><li> Cellule di Pick up da questa patch sporulazione con un&#39;ansa sterile inoculazione 3 mm (le cellule dovrebbero coprire ¼ del ciclo) e posto nel succo tetrade. Capovolgere delicatamente il ciclo per permettere alle cellule di cadere il ciclo e mescolare con la soluzione. </li><li> Lasciare in succo tetrade (contenente zymolyase) per 4-10 minuti (a seconda della concentrazione e l&#39;attività di zymolyase e dello stesso ceppo). Questo permette la digestione della parete cellulare che circonda il ascospore. </li><li> Segna parte superiore e inferiore della regione inoculo su un piatto YPD. </li><li> Opzionale. Reazione può essere interrotta con l&#39;aggiunta di 1 ml di freddo ghiaccio sterile dH 2 O. Permettono alle cellule di accontentarsi di 5 minuti. Rimuovere il surnatante da 1 ml quindi mescolare delicatamente a mano e tenere sul ghiaccio. </li><li> Prendere 5μL di cellule digerito dal passaggio 5 e delicatamente posto gocce in una linea nella regione di inoculo del pre-segnato piastra YPD. </li><li> Utilizzare un&#39;ansa sterile inoculazione 3mm a molto delicatamente diffondere i tempi di 1-3 gocce in una linea, mentre appena il contatto con l&#39;agar. </li><li> Lasciare che il liquido di assorbire in agar (se viene omesso il passaggio 7, questo è quando la digestione della parete cellulare esterna sarà ridotta o fermata). Procedere al microscopio dissezione. </li></ol> Dissezione di Asci Protocollo Si noti che il protocollo qui descritto si un microscopio Singer sistema di micromanipolazione MSM 200. Questo protocollo può essere seguito con lievi modifiche se si utilizza un micromanipolatore manuale come un micromanipolatore Zeiss MR. <ol><li> Focus su una regione della piastra dove la metà del campo contiene cellule e mezzo è vuoto. Portare lentamente l&#39;ago a fuoco in modo che tocca la regione vuota del campo. Questo farà sì che l&#39;ago non contiene cellule di un uso precedente. Il contatto tra l&#39;ago e l&#39;agar è visto come un cerchio nero scuro che viene lentamente a fuoco. </li><li> Vai alla matrice in A1 posizione e fare un segno penetrante l&#39;agar di nuovo. Questo è per aiutare a determinare l&#39;orientamento della piastra se viene tolto il microscopio prima del completamento. </li><li> Passare alla modalità di ricerca. Individuare un aschi. Scegliere preferibilmente aschi che si trovano in aree in cui le cellule sono ben distribuiti. Evitare le zone con i cluster di cellule. I quattro ascospore da un aschi dovrebbe essere ancora attaccati l&#39;uno all&#39;altro. Due ascospore possono essere leggermente più grande rispetto agli altri due. Evitare di raccogliere aschi ascospore dove si è sciolto e non collegata al resto del ascospore. </li><li> Prendere un asco con l&#39;ago. Portare lentamente l&#39;ago fino alla piastra. Quando l&#39;ombra del microago è visto, questa linea con l&#39;asco di essere raccolti. Nuovo approccio l&#39;ago fino a quando la sagoma nera di un cerchio (la punta dell&#39;ago) si vede. Toccare il tetrade con questo cerchio e poi rapidamente tirare l&#39;ago via. Assicurarsi che i quattro ascospore da un asco hanno aderito l&#39;ago e che non le cellule supplementari sono stati raccolti sulla microago che non fanno parte di questo ASCUS. </li><li> Tirare il microago lontano dal piatto e andare alla matrice (per la asco prima, andare aposizione A1). Prendere nota di ogni posizione in cui viene spostato uno asco. Posizionare il asco giù toccando il piatto con il microago e tirando via fino a tutte e quattro le ascospore si stacca il microago. Picchiettando leggermente il braccio ago o la piattaforma che fissano la piastra YPD è spesso utile in questa fase. </li><li> Ripetere i passaggi 3-5 e posto aschi giù in posizioni consecutive sulla matrice fino a quando il numero desiderato di aschi sono stati raccolti. </li><li> Torna alla ciascun asco e rompere le quattro celle a parte da prendere in giro con l&#39;ago, picchiettando delicatamente la piattaforma o una combinazione di entrambi. Raccogliere le cellule lasciando uno dietro a una nuova posizione nella matrice fino a che ogni ascospore in ogni asco è divisa in file di quattro. </li><li> Posizionare la piastra YPD in un incubatore a 30 ° C per diversi giorni per osservare il modello di crescita. </li><li> Replica piastra le cellule sezionato per terreno selettivo se necessario. </li></ol> Trasferimento di zigoti Protocollo <ol><li> Streak fuori due ceppi aploidi con i tipi di accoppiamento opposto sul terreno adeguato per ottenere colonie singole. </li><li> Compagno di questi due ceppi, come descritto sopra e lasciar crescere da 4 a 6 ore (o tutta la notte se necessario). </li><li> Verificare la presenza di zigoti sotto un microscopio ottico. Zigoti apparirà come manubrio a forma di cellule con o senza una gemma. </li><li> Raccogliere le cellule con un ciclo inoculazione 3 mm (le cellule dovrebbero coprire ¼ del ciclo) e posto delicatamente in 100μL di sterili dH 2 O. </li><li> Segna parte superiore e inferiore della regione inoculo su un piatto YPD. </li><li> Prendere 5μL e delicatamente posto gocce in una linea nella regione di inoculo del pre-segnato piastra YPD. </li><li> Usare un ciclo 3 millimetri inoculazione di diffondere le gocce in una linea molto delicatamente, mentre appena il contatto con l&#39;agar. </li><li> Lasciare che il liquido di assorbire in agar. Procedere al microscopio dissezione. </li><li> Focus su una regione della piastra dove la metà del campo contiene cellule e mezzo è vuoto. Portare lentamente l&#39;ago a fuoco in modo che tocca la regione vuota del campo. Questo farà sì che l&#39;ago non contiene cellule di un uso precedente. Il contatto tra l&#39;ago e l&#39;agar è visto come un cerchio nero scuro che viene lentamente a fuoco. </li><li> Vai alla matrice in A1 posizione e fare un segno penetrante l&#39;agar di nuovo. Questo è per aiutare a determinare l&#39;orientamento della piastra se viene tolto il microscopio prima del completamento. </li><li> Passare alla modalità di ricerca. Individuare uno zigote. </li><li> Prendete uno zigote con l&#39;ago. </li><li> Luogo zigoti individualmente sulla matrice. </li><li> Lasciare zigoti a crescere per alcuni giorni. </li><li> Piastra replica il zigoti sul mezzo adeguato selettivo. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Figura 1: L&#39;accoppiamento di due ceppi aploidi di tipi di accoppiamento opposto genera un ceppo diploide. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Figura 2: (A) Un piatto YPD con risultati thre di un incrocio tra un ceppo sensibile alla temperatura (con un auxotrophy leu2) e un ceppo wild-type (LEU2). Cellule digeriti sono sparsi nella regione di inoculo sulla sinistra dove si vede la crescita di spessore tra le due linee nere. Aschi che sono stati sezionati crescere equidistanti nella matrice di destra. (B) La piastra in (A) è stato replicato su una SD-Leucina drop-out piatto. Si noti la 02:02 di crescita per il marcatore LEU2 indica un ascospore convalidato è stato dissezionato. (C) La piastra in (A) è stato replicato su un piatto YPD e incubate a 37 ° C. Si noti il ​​02:02 crescita che conferma ulteriormente che un ascospore è stato dissezionato.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

Dissezione lievito è un utile strumento per selezionare nuove varietà con marcatori desiderato. Nel determinare il modello teorico di crescita di quattro ascospore è importante guardare al genotipo della cellula vegetativa. Se un plasmide è presente, si deve sapere se è solo esemplare, alto o basso, come questo influirà che ascospore (s) ricevono il plasmide e influenzerà le previsioni e conclusioni per quanto riguarda i ceppi manipolati. Alcuni ceppi possono sporulare meglio di altri la pro...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Microscopio</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitolo</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zimolasi 100T</td><td>Reagente</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Base di azoto per lieviti</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-triptone</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di adenina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracile</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-istidina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Reagente</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>Reagente</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione di saccharomyces cerevisiae asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Il lievito è un sistema modello altamente trattabile che viene utilizzato per studiare molti processi cellulari diversi. Il ceppo di laboratorio comune<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Esiste sia in una aploide o stato diploide. La possibilità di combinare gli alleli di due haploids e la possibilità di apportare modifiche al genoma richiede la produzione e la dissezione di aschi. Produzione di aschi da cellule aploidi inizia con l&#39;accoppiamento di due ceppi di lievito aploidi con tipi di accoppiamento compatibile per la produzione di un ceppo diploide. Questo può essere ottenuto in diversi modi, sia su terreno solido o liquido. È vantaggioso per selezionare i diploidi in mezzo che favorisce selettivamente la crescita rispetto ad uno dei due ceppi aploidi. I diploidi sono poi permesso di sporulare sul poveri di nutrienti medio per formare aschi, un fascio di quattro cellule figlie aploidi derivanti dalla riproduzione meiotica della diploide. Una miscela di cellule vegetative e aschi viene poi trattata con l&#39;enzima per digerire zymolyase via la membrana che circonda il sacco ascospore di aschi. Mediante micromanipolazione con un microago al microscopio dissezione si può raccogliere e separare i singoli aschi e ricollocare i quattro ascopores. Aschi sezionato sono coltivate per diversi giorni e testati per i marcatori o alleli di interesse da parte placcatura replica su appropriati terreni selettivi.

Micromanipolazione di cellule di lievito è necessaria per l&#39;analisi genetica meiotica o per selezionare zigoti diploidi. Queste micromanipolazioni vengono effettuate utilizzando il microago di un microscopio dissezione. Il microago viene utilizzato per trasferire le cellule ed è controllato da un micromanipolatore che sono disponibili con diversi gradi di automazione.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Il lievito è un sistema modello estremamente versatile, utilizzato per studiare numerosi e differenti processi cellulari. Il ceppo di laboratorio comune Saccharomyces cerevisiae ...

Questa procedura inizia con l'incrocio di due cellule di lievito haid geneticamente diverse. I diploidi vengono selezionati mediante replicazione su piastra in un mezzo che permette la crescita solo dei diploidi. I diploidi vengono quindi trasferiti su piastre di sation o su aschi form.Gli asci vengono dissecati posizionando gli aplosi in una posizione definita sulla piastra. Una volta che gli aplosi risultanti sono cresciuti fino a formare una colonia visibile, la piastra viene replicata su un mezzo selezionato per identificare il genotipo delle singole cellule. Ciao, sono Adrian Morris.E io sono Audrey Mahe. Siamo del laboratorio del Dottor Michael Satcher presso l'Università di Concordia a Montreal. Oggi vi mostreremo un procedimento per la dissezione di aschi di lievito, comunemente indicati come ra.Utilizzare questo procedimento nel nostro laboratorio per incrociare ceppi haplo D con genotipi nuovi e per studiare gli effetti della combinazione di due mutazioni. Cominciamo: per costruire un ceppo diploide, due ceppi haplo di tipo di accoppiamento opposto vengono incrociati. I ceppi haplo vengono innanzitutto seminati su un terreno appropriato, nel nostro caso YPD, per ottenere colonie singole utilizzando un’ansa di inoculazione sterile; prelevare una piccola porzione di una colonia da uno dei due ceppi haplo e tracciare l’ansa su una nuova piastra YPD.Una volta tracciata una linea retta attraverso la piastra, segnare la direzione del tratto con una freccia sul fondo della piastra. Successivamente, prelevare una piccola porzione di una colonie dall'altro ceppo aploide presente sulla stessa piastra YPD. Tracciare la colonia perpendicolarmente al primo ceppo, incrociando il primo tratto con il secondo segno, nella direzione del secondo tratto.E osservare la zona in cui la seconda striatura incrocia la prima. Questa zona sarà quella in cui vengono prodotti i diploidi.Incubare la piastra YPD a 30 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, effettuare un replica plating della piastra YPD su un mezzo selettivo che consenta selettivamente la crescita dei diploidi appena formati. Incubare la piastra durante la notte a 30 gradi Celsius.Una volta che i diploidi sono cresciuti sulla piastra, se possibile, selezionare una singola colonia oppure una piccola porzione della linea di diploidi e riseminare sulla stessa base selettiva per ottenere singole colonie. Una volta ottenuto il ceppo diploide, selezionare singole colonie e formare piccole aree su piastre di sporulazione. Incubare a 30 gradi Celsius per tre-sette giorni per indurre la sporulazione.Per verificare la sporulazione, osservare le cellule di ciascun tratto al microscopio ottico. Posizionare le cellule su un vetrino. Aggiungere da cinque a dieci microlitri di acqua.Posizionare un coprivetrino sulla goccia e cercare la presenza di aschi. Se questi non sono presenti o non sono facilmente individuabili, rimettere la piastra nell'incubatore. Se in una delle colonie è avvenuta una sporulazione efficace, preparare un tubo conico sterile da 15 millilitri contenente 100 microlitri di succo di tetra.Prelevare le cellule da questa colonia di sporulazione con un’ansa di inoculazione sterile da tre millimetri e posizionarle nel succo per tetradi. Ruotare delicatamente l’ansa per permettere alle cellule di staccarsi e mescolarsi alla soluzione. Lasciare le cellule nel succo per tetradi da quattro a dieci minuti.Questo permette la digestione della parete cellulare che circonda le spore degli ASCO. Per preparare una piastra per la dissezione degli asci, segnare la parte superiore e inferiore della regione di inoculo su una piastra YPD. Quando le cellule sono state sufficientemente digerite, prelevare cinque microlitri di cellule digerite e depositare delicatamente delle gocce in una linea all'interno della regione di inoculo della piastra YPD precedentemente segnata, utilizzando un'ansa di inoculazione sterile da tre millimetri.Stendere molto delicatamente le gocce da una a tre volte in fila, sfiorando appena l'ago. Lasciare che il liquido venga assorbito dall'ago. Ora siete pronti per iniziare la dissezione degli aschi.Per iniziare la dissezione degli aschi, posizionare la piastra di dissezione sotto il microscopio per micromanipolazione Singer MSM System 200. Mettere a fuoco una regione della piastra in cui metà del campo contiene cellule e l'altra metà è vuota. Portare lentamente l'ago a fuoco, in modo che tocchi la regione vuota del campo.Il contatto tra l'ago e l'agar appare come un cerchio nero scuro che entra lentamente a fuoco. Dopo che l'ago ha toccato l'agar, ritirarlo leggermente e verificare che nessuna cellula sia stata depositata nell'area in cui l'ago ha toccato l'agar. Ciò garantisce che l'ago non contenga cellule da un uso precedente.Vai alla matrice nella posizione A1 e fai un segno perforando con l'archetto. Ancora una volta, questo serve ad aiutare a determinare l'orientamento della piastra. Se viene rimossa, prima che la dissezione sia completa.Passare alla modalità di ricerca. Individuare un asco. Le quattro spore dell'ASCO dovrebbero essere ancora unite tra loro.Due spore ASCUS possono essere leggermente più grandi delle altre due. Evitare di selezionare aschi in cui una spora ASCA è libera e non collegata alle altre spore ASCA. Per raccogliere un asco, avvicinare lentamente l'ago alla piastra.Quando si vede l'ombra del micropuntura, allinearla con l'ascus da selezionare. Spostare l'ago finché non si osserva il contorno nero di un cerchio. Toccare il tetrad con questo cerchio, quindi ritirare rapidamente l'ago.Assicurarsi che tutte e quattro le spore provenienti da un asco siano aderite all'ago e che nessuna cellula aggiuntiva, non appartenente a questo asco, sia stata raccolta dal microago. Una volta che l'asco è stato raccolto con il microago, allontanare il microago dalla piastra e spostarsi sulla matrice. Per il primo asco, andare alla posizione a uno.Posizionare l'ascus abbassandolo toccando la piastra con il micropuntello e allontanandolo fino a quando tutte e quattro le spore non si staccano delicatamente dal micropuntello; picchiettare leggermente sul braccio del puntello o sulla piattaforma che sostiene la piastra YPD è spesso utile. In questo passaggio.Continuare a localizzare, prelevare e posizionare gli aschi in posizioni consecutive sulla matrice fino a ottenere il numero desiderato di ASCI. Prendere nota di ciascuna posizione in cui un ASCUS viene spostato. Quando è stato prelevato il numero desiderato di aschi, tornare su ciascun ask us e separare le quattro cellule smuovendole con l'ago, picchiettando delicatamente la piattaforma o utilizzando una combinazione di entrambi i metodi.Prelevare le cellule lasciandone una indietro. Trasferire quella rimasta. Chiedere a E di spostarsi in una nuova posizione nella matrice e ripetere fino a quando ogni richiesta è stata eseguita.APO in ciascun asco è disposto in file di quattro. Si completa una dissezione degli aschi. Posizionare la piastra YPD in un incubatore a 30 gradi Celsius per diversi giorni per osservare il modello di crescita.Una volta che gli aschi dissezionati sono cresciuti, effettuare un replica plating su mezzo selettivo. Se necessario, si tratta di una piastra che è stata sottoposta a replica plating e su cui sia la piastra originale di dissezione sia la piastra selettiva sono state incubate per tutta la notte. I risultati osservati sulla piastra selettiva devono essere valutati e la cellula aploide appropriata deve essere identificata e selezionata.Nei casi in cui i diploidi non possono essere identificati su piastre selettive, è necessario selezionare manualmente gli aploidi accoppiati, chiamati zigoti, che sono facilmente riconoscibili in una fase precoce dopo l'accoppiamento. La procedura per la preparazione delle cellule aploidi e per l'accoppiamento è identica a quella già descritta, con l'eccezione che la regione in cui dovrebbe trovarsi il diploide viene esaminata dopo tempi di incubazione più brevi a 30 gradi Celsius. Riteniamo che da quattro a sei ore rappresentino un buon punto di partenza, ma la durata ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente.Controllare la presenza di zigoti al microscopio ottico: i zigoti appariranno come cellule a forma di manubrio, con o senza gemmazione; raccogliere le cellule con un’ansa di inoculazione da tre millimetri e posizionarle delicatamente in 100 microlitri di acqua sterile. Dopo aver trasferito le cellule su una piastra YPD precedentemente contrassegnata, utilizzare un’ansa di inoculazione da tre millimetri per spalmare delicatissimamente le gocce in una linea, sfiorando appena la superficie dell’agar. Lasciare assorbire il liquido nell’agar.Procedere al microscopio stereoscopico. Concentrarsi su una regione della piastra in cui metà del campo contiene cellule e l'altra metà è vuota. Portare lentamente l'ago a fuoco in modo che tocchi la regione vuota del campo.Come mostrato in precedenza. Verificare che l'ago non contenga cellule da un uso precedente. Recarsi sulla matrice alla posizione A1 e fare un segno pungendo la spirale.Di nuovo, per aiutare a determinare l'orientamento della piastra. Passare alla modalità di ricerca e individuare uno zigote. Raccogliere lo zigote con l'ago.Posizionare i zigoti singolarmente sulla matrice. Lasciare crescere i zigoti per diversi giorni. Trasferire le cellule diploidi su piastre di sporulazione e procedere come nella parte tre.L'incrocio tra due ceppi aploidi di tipi di coniugazione opposti genera un ceppo diploide. Questa piastra YPD mostra i risultati di un incrocio tra un ceppo sensibile alla temperatura con una mutazione lu due ossidativa e un ceppo di tipo selvatico. I ceppi digeriti sono stati seminati nella regione di inocolo a sinistra, dove si osserva una crescita fitta tra le due linee nere.Gli aschi che sono stati dissezionati crescono in modo uniformemente spaziato nella matrice a destra. Quando questa piastra YPD è stata replicata su una piastra SD priva di leucina, si osserva una crescita due a due per il marcatore LU due, indicando che è stato dissezionato un ascosporo valido. La piastra YPD originale è stata inoltre replicata su un'altra piastra YPD e incubata a una temperatura più elevata di 37 gradi Celsius, dove la crescita due a due conferma ulteriormente che è stato dissezionato un ascosporo. Abbiamo appena mostrato come produrre due ceppi di cellule haid e selezionare i diploidi. Sulla base di due metodi diversi, uno utilizza marcatori trofici e l'altro si basa sulla morfologia cellulare. Quando si utilizza questo procedimento, è estremamente importante ricordare di selezionare le cellule haid appena costruite a partire da una dissezione tetra, in cui i marcatori atrofici sono rappresentati come previsto.È inoltre importante ricordare di non effettuare una digestione eccessiva né insufficiente. I tetra come aschi non riescono a rimanere uniti nei tetradi che sono stati digeriti troppo, mentre risulta difficile separare i tetradi sottodigeriti. Questo è tutto.In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

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