Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Per misurare la durata della vita in C. Elgan, viene generata una popolazione sincronizzata con l'età utilizzando un linguaggio delle uova cronometrato in modo riproduttivo. I vermi ermafroditi adulti attivi vengono trasferiti su piastre di substrato per la crescita dei nematodi seminate con E. coli morti dai raggi UV, lasciati deporre uova per sei-otto ore e poi rimossi nei due giorni successivi; i vermi si schiudono da queste uova e crescono fino allo stadio larvale L quattro. I L quattro vermi vengono trasferiti su nuove piastre NGM contenenti ampicillina per prevenire la contaminazione batterica viva e FUDR per impedire la riproduzione e lasciati svilupparsi in adulti.

Da questo momento in poi, i vermi adulti vengono osservati ogni due o tre giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. Ad ogni momento temporale, i vermi morti vengono rimossi dalla piastra e viene registrato il numero di vermi vivi e morti. Sono George Seton del laboratorio di Matt Capline nel Dipartimento di Patologia dell'Università di Washington.

Oggi vi mostreremo come misurare la durata della vita e vedere la nostra eleganza per l'epatite. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la genetica dell'invecchiamento. Quindi cominciamo.

Un esperimento di durata di base richiede due tipi di piastre: le piastre NGM standard, che non contengono additivi, e le piastre AMP FUDR, che contengono sia ampicillina che fluorosoxiuridina aggiunte alla NGM. Entrambi i tipi di piastre sono posizionate con batteri E. coli OP 50, che vengono successivamente uccisi dall'esposizione ai raggi UV. Inizia preparando 10 millilitri di soluzione NGM.

Per piastra di Petri da 60 millimetri si scioglie completamente il nucleo naturale solido riscaldando al microonde a 32° impulso. Fai ruotare i mezzi tra un impulso e l'altro per evitare che si accumulino bolle di gas pressurizzate, metti il liquido in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius o sul banco per permettere al mezzo di raffreddarsi. Una volta che il substrato si è raffreddato a 55 gradi Celsius, momento in cui dovresti riuscire a tenere comodamente il contenitore di vetro a mani nude, è pronto per l'aggiunta di farmaci.

E per versare i piatti con farmaci, aggiungi 33 microlitri di FUDR da 150 millimolari e 100 microlitri di 100 milligrammi per millilitro. L'ampicillina per 100 millilitri NGM e la spirale per mescolare l'ampicillina vengono utilizzate per prevenire la contaminazione batterica estranea e la FUDR per impedire la schiusa delle uova. Quindi i vermi non dovranno essere trasferiti ogni pochi giorni per separarli dalle larve in crescita.

Ora versa il substrato e lascia asciugare le lastre sul banco per due giorni il giorno prima che le piastre finiscano di asciugare la coltura liquida LB dei semi con una singola colonia da una nuova striscia di E. coli. OP 50 batteri su LB embora. Prepara almeno una coltura di 0,5 millilitri per piastra da 60 millimetri.

Metti la coltura OP 50 in uno shaker a 37 gradi Celsius e lascia crescere i batteri durante la notte. Il giorno successivo si mette in pellet il batterio OP 50 con 3.500 g di forza centrifuga per 10 minuti. Fai decant abbastanza di supernatant da risospendere i batteri a una concentrazione di 10 volte.

Ora inoculate ogni piastra con 100 microlitri della coltura concentrata. Evita di toccare la punta della pipetta con la superficie della NGM, poiché le imperfezioni nella superficie del substrato permetteranno ai vermi di scavare le piastre vorticose finché i batteri non coprono l'area centrale della NGM senza avvicinarsi alle pareti delle placche, lasciando le placche ad asciugare sul banco per 24 ore. Una volta asciutta, esponiamo la superficie delle piastre a una dose UV abbastanza forte da fermare la crescita batterica; usiamo un gene strata UV straddle linker 2, 400.

Inizia caricando le piastre nel collegatore a straddle senza i coperchi. Ora premi energia. Inserisci 9 9 9 9 sulla tastiera e premi start.

Le piastre saranno esposte ai raggi UV per circa cinque minuti. Le piastre con batteri che uccidono dai raggi UV possono essere conservate a testa in giù a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Questa sezione descrive come generare una popolazione di vermi con una data comune di schiusa.

Inizia trasferendo circa 20 vermi giovani adulti su una nuova piastra NGM senza farmaci. Lascia il piatto a 25 gradi Celsius per circa una settimana per permettere ai vermi di propagarsi e mangiare tutto il cibo batterico entro una settimana. I vermi appena schiusi nella fase di dote a fermo aumento dovrebbero apparire, trasferire 20-30 larve di dote su una piastra NGM fresca senza farmaci e incubarli a 25 gradi Celsius in presenza di cibo.

Le larve della dote diventeranno adulte attive riproduttivamente entro due giorni e rimaneranno attive per alcuni giorni dopo. Ora trasferisci 10-15 degli adulti riproduttivamente attivi su una nuova piastra NGM senza farmaci. Questa piastra è chiamata piastra a tempo per la deposizione delle uova o piastra TEL.

Lascia la piastra TEL a 25 gradi Celsius così i vermi possono deporre le uova. Gli animali che si schiudono da queste uova saranno animali sperimentali e vedranno la loro durata di vita segnata dopo sei ore. Ispeziona la piastra TEL per le uova.

Se non ci sono ancora abbastanza uova, lascia la piastra TEL a 25 gradi Celsius per un massimo di 24 ore. Controlliamo periodicamente la presenza di uova. Quando è stato deposto un numero sufficiente di uova, rimuovere gli adulti dalla piastra TEL.

Un esperimento tipico sulla durata della vita richiederà da 30 a 90 uova per gruppo sperimentale, ma su una singola piastra TEL possono essere generate diverse centinaia di uova. Circa 150 uova saranno deposte da 10-15 adulti riproduttivamente attivi in sei-otto ore. Nel confronto dei gruppi sperimentali, si può ottenere significatività statistica per grandi differenze di durata di vita con anche solo 30 animali.

Si dovrebbero usare più animali per distinguere differenze più modeste. Ora posiziona la piastra TEL senza adulti a 20 gradi Celsius finché le uova non si schiusero e i vermi non avranno raggiunto lo stadio larvale L 4. Di solito ci vogliono due giorni per ottenere eleganza di tipo C selvatico, ma può richiedere più tempo per ceppi con fenotipi a sviluppo lento.

Questa sezione descrive come seguire la vita di una popolazione sincronizzata con l'età. Per prima cosa, trasferire la larva L quattro dalla piastra TEL alle piastre AMP FUDR seduti. Per ogni ceppo o condizione testata, è tipico installare due o tre piastre con 25-30 vermi per placca.

Incubare le piastre AMP FUDR a 20 gradi Celsius per 24 ore. Poi valuta visivamente i vermi, il substrato e i batteri trasferiscono vermi su piastre AMP FUDR fresche. Se i vermi hanno mangiato la maggior parte del cibo batterico, ciò avviene tipicamente una o due volte a settimana.

All'inizio dell'esperimento, se è presente un numero significativo di larve, ciò indica solitamente che i vermi sono stati trasferiti nelle placche AMP FUDR da giovani adulti invece che come L quattro. I giovani adulti possono deporre le uova prima che la FUDR entri in funzione e, occasionalmente, le larve sfuggono agli effetti della FUDR e crescono fino a diventare adulte. Queste larve confonderanno l'esperimento in questa situazione, trasferiranno i vermi adulti su placche fresche e scarteranno le vecchie placche contenenti le larve.

I vermi dovrebbero anche essere trasferiti su piastre fresche se si osservano batteri viventi in crescita. Generalmente la combinazione di AMP e UV elimina l'esperimento garantisce che nessun batterio vivo contamini l'esperimento, ma occasionalmente ciò accade. Inoltre, trasferisci i vermi.

Se si osserva la crescita fungina sul mezzo. Se individuati abbastanza presto, i funghi possono essere eliminati usando la punta di una pipetta o una spatola. Quando cresce fino a superare qualche millimetro di diametro, di solito è più facile trasferire i vermi su una nuova placca.

Puntua tutti i vermi per la durata della vita ogni due o tre giorni. Usando un endoscopio di dissezione. Determina se ogni verme è vivo o morto.

Tocca delicatamente il piatto. Il verme è vivo se si muove in risposta al battito. Se il verme non risponde al tocco sulla piastra di richiamo, zooma sulla zona della testa, colpisci delicatamente la testa del verme con un plettro di platino a transfer.

Segna il verme come morto. Se non risponde muovendo la testa, rimuovere il verme morto dalla placca. Dopo aver controllato tutti i vermi, annota la data e il numero di vermi vivi e morti.

I vermi mantenuti su substrati solidi a volte riescono a fuggire dalla superficie della lambra scavando o arrampicandosi lungo il muro. I vermi che fuggono sono completamente esclusi dallo studio. Quando hai finito, riporta i piatti nell'incubatore a 20 gradi Celsius.

Aspettare altri due o tre giorni e poi controllare di nuovo le targhe. Continua questo regime finché ogni verme non sarà morto. Il numero di vermi che muoiono ogni giorno viene tipicamente invertito per calcolare la proporzione di vermi vivi in ogni giorno; questi dati sono graficamente rappresentati come una curva di sopravvivenza considerando il giorno della deposizione temporanea.

Giorno zero. La media media della vita per N due. Il ceppo selvatico di elgan marino mantenuto con batteri che uccidono i raggi UV a 20 gradi Celsius dura circa 25 giorni misurati dall'uovo.

Vi abbiamo appena mostrato come misurare la durata della vita e vedere l'eleganza. Puoi modificare questa procedura di base per testare una varietà di condizioni ambientali, inclusa la restrizione dietetica e l'interferenza dell'RNA, come discusso nel testo di supporto. Ecco tutto.

Grazie per aver seguito e buona fortuna con il tuo esperimento.