Name: Volume di grandi dimensioni (20L +) Filtrazione di campioni dacqua di mare costiero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Impara la filtrazione di grandi volumi di acqua di mare per raccogliere biomassa microbica. Questo metodo consente di isolare particelle da 0,22μm a 2,7μm per studiare la diversità microbica marina.

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Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution.

<ol><li> Messa a punto di apparecchiature di filtrazione <ol><li> Per impostare l&#39;apparato di filtrazione, utilizzare una pinzetta per posizionare un grado GF / D filtro in unità abitativa prefiltro. Liberamente stringere la custodia a mano. Come regola generale, non stringere troppo o l&#39;unità perdite una volta che la parte di pompaggio. </li><li> Sostituire il tappo di damigiana con il tappo in autoclave e il tubo attaccato con attenzione inserito il tubo interno in damigiana senza toccarla. Se necessario, utilizzare una pinzetta per guidare il tubo nel damigiana. </li><li> Far passare il tubo esterno attraverso la pompa peristaltica. </li><li> Collegare unità abitative prefiltro alla fine di entrambi i tubi esterni (2 unità per damigiana). Stringere la connessione con le pinze. </li></ol></li><li> Filtrazione di acqua di mare <ol><li> Per iniziare a filtrare l&#39;acqua di mare, accendere la pompa e impostare la velocità di flusso a 1. Guarda per assicurare che l&#39;acqua viene pompata nella direzione corretta. </li><li> Lasciare 500 ml di acqua di fluire liberamente attraverso l&#39;unità prefiltro e in un contenitore 1 L. </li><li> Spegnere la pompa, e collegare un filtro Sterivex al raccordo maschio luer alla fine privo di configurazione prefiltro. Serrare le abitazioni prefiltro comodamente a mano. </li><li> Guarda per l&#39;alloggiamento prefiltro e al collegamento tra il corpo prefiltro e il tubo che porta alla damigiana. Se si verificano perdite, spegnere la pompa fuori e allentare e stringere di nuovo la custodia prefiltro di conseguenza. Accendere la pompa di nuovo. </li><li> Raccogliere il filtrato in 4 fiaschi L. Una volta che sono piene, vuote i flaconi in una damigiana pulito. Assicurarsi di prendere nota del volume passa attraverso ciascun filtro. Raccolti filtrato possono essere ulteriormente elaborati, come ad esempio la filtrazione di virus. </li><li> Continuare a filtrare l&#39;acqua fino a quando non viene lasciato in damigiane. Solita gamma di filtrazione volte tra 4-5 ore / 20 L damigiana, ma questo dipende drammaticamente dalla quantità di biomassa all&#39;interno dell&#39;acqua. </li><li> Una volta che la filtrazione è completa, accendere la pompa e staccare i filtri Sterivex. </li></ol></li><li> Conservazione dei filtri <ol><li> Per memorizzare i filtri, prima espellere l&#39;acqua residua con una siringa da 30-60 ml. </li><li> Usando una pipetta, aggiungere buffer di lisi 1.8ml al filtro, mantenendo ~ 200 ul di spazio nel filtro per la successiva aggiunta di reagenti. </li><li> Sigillare la parte inferiore e superiore del filtro Sterivex con un piccolo pezzo di Parafilm, i filtri e l&#39;etichetta con la data e l&#39;identificazione del campione. </li><li> Conservare i filtri in un pre-etichettati tubo da 50 ml di falco a -80 ° C </li><li> Rimuovere i filtri dalla unità abitativa e metterli in etichetta tubi Falcon da 50 ml contenente 2 ml di tampone di lisi. Conservare questi a -80 ° C. </li></ol></li><li> Pulizia <ol><li> Per la pulizia finale, posto il tubo che era dentro la damigiana in un pallone contenente 0,1 M HCl </li><li> Diretto il tubo che porta al pallone 4L in damigiana originale. </li><li> Accendere la pompa e correre a 3, raccogliendo il flusso attraverso eseguito in damigiana originale. </li><li> Infine, sciacquare il tubo con l&#39;acqua in autoclave. </li></ol></li></ol> Risultati rappresentante: Il risultato finale è costituito da due filtri Sterivix ognuno contenente biomassa microbica da circa 10 L di acqua di mare nella gamma di dimensioni di 0.22μm e 2.7μm. Questo è memorizzato in tampone di lisi e pronto per l&#39;estrazione del DNA. Inoltre, questa procedura raccoglie e concentra biomassa superiore a 2,7 micron, il GF / D prefiltri. Questo è anche memorizzate nel buffer di lisi e pronto per l&#39;estrazione del DNA. Se i passaggi ulteriori elaborazioni sono adottate, il 0,22 mM flow-through può essere concentrato verso il basso per raccogliere la frazione virale pure.

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

E &#39;indispensabile per pulire panche e pompe con un panno umido dopo l&#39;uso per rimuovere ogni traccia persistente di acqua salata che altrimenti corrodere attrezzature. Anche se la procedura è semplice, il requisito di tempo può essere esteso a seconda della concentrazione di biomassa o detriti nel campione essere filtrato.

<table><tbody><tr><td>Pompa peristaltica</td><td></td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>77913-20, 77200-62, 77200-04</td><td></td></tr><tr><td>Tubazione Tygon LFL</td><td></td><td>Masterflex (Cole Palmer)</td><td>06429-24</td><td>Per l'apparato di filtrazione</td></tr><tr><td>Pinze per tubi</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>0683204</td><td>Per l'apparato di filtrazione</td></tr><tr><td>Adattatori per tubi da 1/4&amp;#8221; x 3/16&amp;#8221;</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>31702-20</td><td>Per l'apparato di filtrazione</td></tr><tr><td>Contenitore per prefiltro in polipropilene</td><td></td><td>ADVANTEC</td><td>501200</td><td>Per l'apparato di filtrazione</td></tr><tr><td>Connettore metallico luer (da estremità tubo a luer maschio con bloccaggio)</td><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>31507-27</td><td>Per l'apparato di filtrazione</td></tr><tr><td>Magneti da 2&amp;#8220;</td><td></td><td></td><td>Per l'apparato di filtrazione</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per caraffe a 3 vie</td><td></td><td></td><td></td><td>Per l'apparato di filtrazione</td></tr><tr><td>Filtri GV 0.22 &amp;mu;m STERIVIX</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>SVGV01R5</td><td></td></tr><tr><td>Filtri GF/D da 47 mm di diametro, 2,7 &amp;mu;m</td><td></td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1823047</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi</td><td> Reagente</td><td></td><td></td><td>0,75 M saccarosio, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)</td></tr><tr><td>HCl 0,1 %</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Per risciacquo post-filtrazione</td></tr><tr><td>Acqua autoclavata</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>Per risciacquo post-filtrazione</td></tr></tbody></table>

volume di grandi dimensioni (20l +) filtrazione di campioni d&#39;acqua di mare costiero

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

Il flusso di lavoro inizia con la raccolta delle acque marine costiere per la comunità microbica a valle, le analisi dei nutrienti e dei gas traccia. Per questo metodo, i campioni sono stati raccolti dal ponte della HMS operativo John Strickland a Inlet Saanich. Questo volume video di documenti di grandi dimensioni (≥ 20 L) filtrazione di biomassa microbica, compresa tra 0.22μm e 2.7μm di diametro, dalla colonna d&#39;acqua. Due campioni 20L può essere filtrato contemporaneamente utilizzando una sola unità pompa dotata di quattro teste rotanti. La filtrazione è fatto nel settore lunghi viaggi, o immediatamente dopo il ritorno per gite di un giorno. E &#39;importante registrare la quantità di acqua che passa attraverso ogni unità sterivex filtro. Per prevenire la formazione di biofilm tra i viaggi di campionamento, tutte le apparecchiature di filtrazione devono essere lavate con acido cloridrico diluito e acqua deionizzata e sterilizzati in autoclave immediatamente dopo l&#39;uso. Questa procedura richiederà circa 5 ore più un ora in più per la pulizia.

Questo volume video di documenti di grandi dimensioni (≥ 20 L) filtrazione di biomassa microbica, compresa tra 0.22μm e 2.7μm di diametro, dalla colonna d&#39;acqua.

Volume di grandi dimensioni (20L +) Filtrazione di campioni d&#39;acqua di mare costiero

Il flusso di lavoro inizia con la raccolta di acque marine costiere per le successive analisi della comunità microbica, dei nutrienti e dei gas in tracce. Per questo metodo, ...

Ciao, sono David Walsh nel laboratorio di Steven Hallam del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università di Bridge Columbia. Oggi vi mostreremo un procedimento per filtrare grandi volumi di acqua di mare al fine di ottenere biomassa microbica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la diversità microbica nell'ambiente marino.Iniziamo. Per allestire l'apparato di filtrazione, utilizzare una pinzetta per posizionare un filtro di grado GFD nell'unità del contenitore del prefiltro. Stringere leggermente il contenitore a mano.In linea di massima, non stringere eccessivamente, altrimenti l'unità perderà. Una volta iniziata la pompa, sostituire il tappo del carboy con il tappo per autoclave e collegare il tubo inserendo con attenzione il tubo interno nell'auto senza toccarlo. Se necessario, utilizzare pinzette per guidare il tubo all'interno dell'auto.Quindi serrare il tappo e far passare il tubo esterno attraverso la pompa peristaltica. Collegare le unità di alloggiamento del prefiltro all'estremità di entrambi i tubi esterni. Serrare il collegamento con una pinza per iniziare a filtrare l'acqua di mare.Accendere la pompa e impostare la velocità di flusso a un orologio per assicurare che l'acqua venga pompata nella direzione corretta. Far scorrere liberamente 500 millilitri di acqua attraverso l'unità di pre-filtrazione e in un becher da un litro. Spegnere la pompa e collegare un filtro Stax al raccordo maschio all'estremità libera del sistema di pre-filtrazione.Serrare saldamente a mano la sede del prefiltro. Controllare la presenza di perdite nella sede del prefiltro e nel collegamento tra la sede del prefiltro e il tubo che conduce all'auto. Se si verificano perdite, spegnere la pompa, allentare e quindi riavvitare correttamente la sede del prefiltro, quindi riaccendere la pompa.Raccogliere il filtrato in beute da un litro. Una volta piene, svuotare le beute in un carboy pulito. Assicurarsi di annotare il volume passato attraverso ciascun filtro raccolto.Il filtrato può essere ulteriormente trattato, ad esempio mediante filtrazione per virus. Continuare a filtrare fino a quando non rimane più acqua nei carboy. I tempi di filtrazione usuali variano tra quattro e cinque ore per ogni carboy da 20 litri.Tuttavia, ciò dipende notevolmente dalla quantità di biomassa presente nell'acqua. Al termine della filtrazione, spegnere la pompa e scollegare i filtri Stax. Per conservare i filtri.Prima espellere qualsiasi residuo di acqua utilizzando una siringa da 30 a 60 millilitri. Con una pipetta, aggiungere 1,8 millilitri di buffer di lisi al filtro, lasciando circa 200 microlitri di spazio libero nel filtro. Per aggiunte successive di reagenti, sigillare la parte inferiore e superiore del filtro Stex con un piccolo pezzo di pellicola parafilm e etichettare i filtri con la data e l'identificativo del campione.Conservare i filtri in un tubo Falcon da 50 millilitri pre-etichettato a meno 80 gradi Celsius. Rimuovere i filtri dall'unità di alloggiamento e posizionarli in tubi Falcon da 50 millilitri etichettati contenenti due millilitri di buffer di lisi. Conservare questi a meno 80 gradi Celsius.Per la pulizia finale, posizionare il tubo che era all'interno dell'auto in un matraccio contenente acido cloridrico 0,1 molare. Indirizzare il tubo che porta al matraccio da quattro litri all'interno dell'auto originale. Accendere la pompa e farla funzionare per tre volte, raccogliendo il flusso in uscita nell'auto originale.Infine, risciacquare il tubo con acqua per autoclave. Ogni carrello da 20 litri produce due filtri Stax, ciascuno contenente biomassa microbica con dimensioni comprese tra 0,22 e 2,7 micron, ottenuta da circa 10 litri di acqua di mare. Inoltre, la biomassa di dimensioni superiori a 2,7 micron viene raccolta e concentrata sui prefiltri GFD.Questi filtri e prefiltri sono conservati nel buffer di lisi e sono pronti per l'estrazione del DNA. Se si effettuano ulteriori passaggi di lavorazione, il filtrato da 0,2 micron può essere concentrato per raccogliere anche la frazione virale. È stato appena descritto un metodo di pompaggio peristaltico per la filtrazione di grandi volumi di biomassa planctonica con dimensioni comprese tra 0,22 micron e 2,7 micron di diametro.Quando si esegue questa procedura, è importante pulire banconi e pompe con un panno umido dopo l'uso, al fine di rimuovere qualsiasi residuo di acqua salata. In caso contrario, l'acqua potrebbe causare la corrosione dell'equipaggiamento. Sebbene la procedura sia semplice, il tempo richiesto può essere considerevole a seconda della concentrazione di biomassa o di detriti nel campione da filtrare.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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