Name: Homarus Americanus Stomatogastric dissezione del Sistema Nervoso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Impara la dissezione fine del sistema nervoso stomatogastrico di Homarus americanus per studi di neurofisiologia. Questo protocollo dettagliato permette di isolare gangli e nervi per analisi funzionali dei circuiti neurali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vogliamo ringraziare il nostro consulente, il dottor Eve Marder. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of concede Salute NS17813 a Eve Marder e NS059255 di AE T.

Prima di iniziare questo protocollo lo stomaco delle aragoste devono essere rimossi dagli animali e preparato come descritto in questo articolo compagno di Giove (Bierman e Tobin, 2009). La maggior parte dei passaggi descritti di seguito devono essere eseguite al microscopio di dissezione. Parte I-Isolare i gangli commissurali <ol><li> Orientare l&#39;antenna in modo che l&#39;estremità anteriore (dal labbro) è lontano da voi e la fine posteriore (per il piloro) è verso di voi. </li><li> Assicurarsi che lo stomaco è appuntata in modo che si trova più piatta possibile sul piatto. <ol><li> Definire con precisione l&#39;esofago su ogni lato del labbro. </li><li> Se necessario, riorganizzare gli altri piedini posto durante la dissezione lordo. </li></ol></li><li> Rimuovere il ipoderma. <ol><li> Afferra il ipoderma vicino al gm2/gm3 muscoli, staccare da questi muscoli e tirare delicatamente nella direzione anteriore. </li><li> Separare il ipoderma dal grasso sottostante snipping qualsiasi collegamento. Maggiore uso attenzione intorno l&#39;arteria centrale, che racchiude una parte fondamentale del sistema nervoso stomatogastric. Lasciare l&#39;ipoderma intatto all&#39;interno di un raggio di 0,5 cm del ganglio stomatogastric, che si trova tra i muscoli gm1b. </li><li> Tagliare ipoderma separati. </li></ol></li><li> Staccare il cervello dal tessuto sottostante. <ol><li> Identificare i due nervi grandi commissurali quel progetto bilaterale dalla parte anteriore del cervello ai gangli commissurali nella parte anteriore dello stomaco. </li><li> Lasciando questi nervi intatti, sollevare delicatamente il cervello con una pinza e tagliare per separare il cervello dal resto del tessuto. Fare attenzione a come si esegue questa operazione, in quanto il nervo stomatogastric è sotto il cervello e deve essere mantenuta intatta. </li></ol></li><li> Separare i gangli commissurali dal tessuto circostante. <ol><li> Seguire una commissurali i nervi ad uno dei gangli commissurali. </li><li> Identificare lo ione e figlio - questi nervi devono rimanere intatti. Il ganglio commissurali avrà molti nervi che si irradiano. Tagliare la maggior parte di loro (tranne lo ione e figlio), ma lasciare un nervo più attaccato a tenere il ganglio commissurali in posizione mentre finisci la dissezione. </li><li> Ripetere con il ganglio altri commissurali. </li></ol></li><li> Pulire lo ione e il figlio da laterale a mediale. Lasciare intatto il nervo labiale per ancorare il sistema nervoso allo stomaco. Il ganglio esofageo si siede erano i s ione si intersecano. È possibile cancellare sotto afferrando il nervo inferiore ventricolare e tirando fino a tagliare sotto. </li></ol> Parte II-Isolare il ganglio Stomatogastric (STG) e nervi rimanenti. <ol start="7"><li> Separare il STG dal tessuto circostante. <ol><li> La STG si trova all&#39;interno di una arteria che corre tra i muscoli gm1b e giù per l&#39;, gm2a muscoli b. Cercare la fine taglio dell&#39;arteria vicino al gm2a muscoli b. </li><li> Tirare l&#39;estremità taglio delle arterie e anteriormente, per esporre la DVN. Continuare a tirare fino a raggiungere il livello del ipoderma rimanenti. Una volta separati, l&#39;arteria può essere tagliato al livello in cui tocca la ipoderma rimanenti. </li><li> Tagliare il lembo del muscolo che si trova nella tribuna della aragosta. </li><li> Sollevare il ipoderma sopra l&#39;arteria, osservando che l&#39;arteria fa un tunnel dentro il grasso sopra l&#39;STG. Mettere un filo d&#39;vostre forbici dentro l&#39;arteria e tagliare il muscolo sopra di esso. Verificare che si può vedere la DVN come si taglia per essere sicuri di sicuro, oltre le STG. Continuare a tagliare anteriormente, seguendo l&#39;arteria. Come si taglia al di sopra della STG, sarete in grado di vedere la stn emanati anteriormente dal STG e giù per le immersioni nel muscolo. Continuare a tagliare anteriormente a separare completamente il muscolo sopra la STG. </li><li> Cancella qualsiasi tessuto lontano dal stn. </li></ol></li><li> Separare il AGN s dal tessuto circostante. (Anche se non avete intenzione di registrare dalla AGN, avrete bisogno di una porzione del nervo intatto da definire il ganglio per le registrazioni intracellulari.) <ol><li> Per meglio vedere la s AGN, rimuovere il ipoderma rimanente e un sottile strato del muscolo sottostante. </li><li> Appena posteriore al STG, individuare un tunnel buio nel grasso e nel muscolo su entrambi i lati della DVN. </li><li> Stick una lama forbice all&#39;interno del tunnel e tagliare il tessuto sopra il nervo. Continuare a tagliare lateralmente, seguendo il nervo, di isolarla. (Un paio di millimetri è sufficiente per appuntare il ganglio, ma esporre almeno 5 mm del AGN se si prevede di registrare da esso.) </li><li> Staccare il AGN dal muscolo che innerva tagliando i collegamenti. </li><li> Ripetere sull&#39;altro lato per isolare il AGN altri. </li><li> Una volta che entrambi agn s sono stati sezionati, tagliati tutti i muscoli e tessuto connettivo della STG allo stomaco. </li></ol></li><li> Isolare la s. mvn Si tratta di una coppia bilaterale dei nervi che si diramano le piccole e LVN attraversando lateralmente sotto il grasso. <ol><li> Utilizzare due pinze o forbici per tagliare il grasso da una parte della DVN, vicino a dove si dirama in due LVN s. Qui sono ben lungi dall&#39;essere la s mvn e non rischio di taglio loro. </li><li> Sollevare lo strato di grasso, e identificare le sotto mvn piccolo. Questi nervi eseguire mediale lateralmente appena posteriormente al livello dei muscoli gm1b. </li><li> Rimuovere lo strato di grasso sopra il mvn, lasciando intatto il nervo per ora in modo da non impigliarsi. Che si dividerà la sua fine laterale da fuori lo stomaco alla fine della dissezione. </li><li> Ripetere la procedura sul lato opposto per isolare il mvn altri. </li></ol></li><li> Isolare la LVN s ei nervi posteriori. <ol><li> Partenza in cui il ramo LVN s lateralmente al largo della DVN, seguono un LVN tagliando il grasso sopra di esso. A seconda della preparazione, a volte l&#39;intero livello di grasso sopra il nervo può essere tirato fuori. </li><li> Continua rivelando il LVN fino al punto in cui i rami psn off. </li></ol></li><li> Isolare la pyn. <ol><li> Individuare il pyn, è un nervo viaggio posteriormente oltre il piloro. </li><li> Rimuovere la sottile membrana che copre questa regione. </li><li> Isolare l&#39;pyn tagliando una piccola sezione del piloro, allegata al pyn. </li><li> Sollevare delicatamente la sezione del piloro e tagliare il tessuto su entrambi i lati della pyn fino a raggiungere il ramo che si collega al PDN. </li></ol></li><li> Isolare il PDN. <ol><li> Individuare il PDN, è un nervo viaggio posteriormente al muscolo dilatatore pilorica. </li><li> Tagliare una piccola sezione del muscolo dilatatore pilorica, presso il PDN. </li><li> Sollevare delicatamente il piloro sezione muscolo dilatatore, tagliare il tessuto su entrambi i lati del PDN fino a raggiungere il ramo che si collega al pyn. </li></ol></li><li> Isolare il LVN ventrale, che collega la pyn e PDN al LVN. <ol><li> Al punto di diramazione triangolare dove la pyn e PDN connettersi al LVN ventrale, isolare qualsiasi piccola sezione del nervo che si dirama dalla LVN ventrale, come il vpln. Questo sarà usato come una maniglia per tirare il LVN ventrale. </li><li> Sollevare la maniglia e tagliare il tessuto su entrambi i lati della LVN ventrale, lavorando nella direzione anteriore fino a raggiungere il punto in cui i rami psn off. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi 10 - 13 a isolare i nervi LVN e posteriore sul lato opposto. </li><li> Staccare il sistema nervoso stomatogastric dallo stomaco. <ol><li> Per staccare completamente la LVN dallo stomaco, tirare il PSN e tagliare tutti i tessuti ed i nervi attaccato al LVN e LVN ventrale, ad eccezione del PDN e pyn. Ripetere questa operazione sull&#39;altro lato. </li><li> Tagliare l&#39;estremità laterale di ogni mvn. Sollevare l&#39;estremità laterali e tagliare gli eventuali allegati estranei tra il nervo ed il tessuto dello stomaco sottostante. </li><li> Alla fine anteriore, tagliare gli allegati estraneo ai gangli commissurali, e tagliare il nervo labiale su ogni lato. </li><li> Visivamente la scansione del sistema stomatogastric sistema nervoso per identificare e poi tagliare gli eventuali allegati aggiuntivi al tessuto dello stomaco. </li><li> Afferrare l&#39;estremità anteriore di entrambi i nervi commissurali, sopra i gangli commissurali, e la buccia del sistema nervoso stomatogastric fuori dello stomaco e passare al lato del piatto. Come si esegue questa operazione, tagliare tutti gli allegati rimanente per liberare il sistema nervoso. </li></ol></li><li> Preparare il piatto piccolo Sylgard. <ol><li> Strofinare alcuni tessuti dello stomaco a fondo sulla superficie del Sylgard nel piatto di piccole dimensioni. Questo diminuirà la idrofobicità del Sylgard, in modo che salino distribuirà in modo uniforme in tutto il piatto. </li><li> Sciacquare e riempire il piatto Sylgard con soluzione fisiologica fredda. </li></ol></li><li> Trasferire il sistema nervoso per il piatto preparato Sylgard afferrando l&#39;estremità anteriore di entrambi i nervi commissurali, sollevando il sistema nervoso fuori dal piatto di grandi dimensioni, e che ha nel piatto di piccole dimensioni. </li><li> Perno del STNS nel piatto piccolo utilizzando una combinazione di pin minuten e più sottile perni tagliati dal filo di tungsteno. <ol><li> Garantire che la preparazione è parte dorsale fino controllando che il nervo ventricolare inferiore è rivolta in direzione opposta alla Sylgard. </li><li> Togliere il cervello ed i nervi commissurali pin. </li><li> Tirare delicatamente il sistema nervoso stretto e piatto tirando ciascuna delle s psn posteriormente e lateralmente, ed unendoli in giù. </li><li> Rimuovere il muscolo pilorico dilatatore dalla s PDN e il perno s. PDN </li><li> Rimuovere ilsegmento pilorica dalla s pyn, e appuntare s. pyn </li><li> Definire con precisione ogni nervi rimasti isolati come i nervi labiale, il mvn s e AGN s. </li></ol></li><li> Desheath la STG. <ol><li> Assicurarsi che la STG è piatto contro la Sylgard e messa in tensione da laterale AGN s, la stn anteriore e il posteriore DVN. </li><li> Disporre l&#39;illuminazione per permettere la visualizzazione degli assoni all&#39;interno della DVN. </li><li> Usando un piccolo spillo o un ago di tungsteno fine, fare un piccolo foro poco profondo nella guaina che circonda la DVN, appena posteriore al STG. </li><li> Tirare l&#39;ago attraverso la DVN, dorsale per gli assoni, per creare uno strappo orizzontale nella guaina del nervo. </li><li> Afferra il lembo della guaina del nervo posteriore alla STG anteriormente e tirare per rimuovere la guaina dal lato dorsale del STG. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Abbreviazioni: </td></tr><tr><td> STNS </td><td> Stomatogastric sistema nervoso </td></tr><tr><td> STG </td><td> Ganglio Stomatogastric </td></tr><tr><td> CoG </td><td> Ganglio commissurali </td></tr><tr><td> stn </td><td> nervo stomatogastric </td></tr><tr><td> mvn </td><td> ventricolare nervo mediale </td></tr><tr><td> ione </td><td> esofageo inferiore del nervo </td></tr><tr><td> figlio </td><td> superiore del nervo esofageo </td></tr><tr><td> AGN </td><td> anteriore del nervo gastrico </td></tr><tr><td> DVN </td><td> ventricolare nervo dorsale </td></tr><tr><td> LVN </td><td> ventricolare nervo laterale </td></tr><tr><td> PSN </td><td> stomaco nervo posteriore </td></tr><tr><td> vpln </td><td> ventrale del nervo laterale posteriore </td></tr><tr><td> pyn </td><td> nervo pilorica </td></tr><tr><td> PDN </td><td> dilatatore nervo pilorica </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

L&#39;anatomia dello stomaco aragosta e STNS è stata ben descritta in precedenza 5,6, e le variazioni di questa procedura dissezione sono state utilizzate in numerosi studi. Si consiglia di acquisire familiarità con l&#39;anatomia dello stomaco 5-7 e STNS 5,8 prima di dissezioni all&#39;inizio. Tale familiarità diminuisce il rischio di danni accidentali ai nervi e tessuti. Per mantenere la salute della preparazione, è fondamentale per mantenere la preparazione a temperatura fresca. Questo è facilmente ottenibile scambiando le saline ogni 30 minuti con 4 ˚ C salina conservato in frigorifero. Quando immerso in soluzione fisiologica fredda, la preparazione isolato STNS è vitale per molte ore. Registrazioni nei relativi gammarus Homarus hanno dimostrato stabile attività ritmica dalla STG tutto 5 giorni in vitro 9; robustezza simile è stato visto in H. americanus (pers. obs.). Ingresso di modulazione alla STG dai gangli commissurali è tenuto a conservare gli schemi motori in corso. Pertanto, per mantenere una normale attività ritmica questi gangli e il figlio di ioni e nervi stn deve essere mantenuta intatta. La dissezione descriviamo conserva nervi motori diversi (contenente gli assoni dei motoneuroni): il s AGN (contenente Mulino gastrica (GM) assoni), il mvn s (contenente gastrica laterale (LG) e Inferiore cardiaca (IC) assoni), il pyn s (contenente pilorica neurone (PY) assoni), la s PDN (contenente dilatatore pilorica (PD) assoni), e la s LVN (contenente pilorica laterale (LP), gastrica mediale (MG), gli assoni GPL così come quelli di GM, PD e PY). Da dissezione aggiuntivi (o diverso) i nervi, gli altri gli assoni dei neuroni motori possono essere registrate. Ogni singola tipologia di assoni dei motoneuroni possono essere registrate individualmente da dissezione e la registrazione dal nervose che innervano il muscolo a cui quel tipo di progetti neurone. Questa preparazione può essere utilizzato per una varietà di studi si sono concentrati sulla funzione del sistema nervoso. L&#39;attività dei neuroni può essere registrata usando intracellulare, registrazioni elettrodo affilato da somata o assoni, o registrando impulsi elettrici extracellulare dai nervi. Molti canali ionici nei neuroni STG sono state parzialmente clonato e mRNA può essere misurata dal manualmente tirato somata 10,11.

<table><tbody><tr><td>Filo fine in tungsteno (diametro 0,001 in)</td><td>Strumento</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>Tagliare in pezzi da 1-2 mm da utilizzare come minutini fini.</td></tr><tr><td>Pinzette #5</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Minutini</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Moria (lame da 7 mm)</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Queste sono le migliori disponibili. La stessa azienda offre modelli più economici di forbici a molla.</td></tr><tr><td>Piatto di Petri (100x15 mm)</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Riempire con 2-4 mm di Sylgard 182.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Altro</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Portaminutini</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Facoltativo. La dissezione della guaina può essere eseguita solo con forbici e pinzette fini.</td></tr><tr><td>Pinzette finissime #5SF</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Aghi in tungsteno</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Facoltativo. La dissezione della guaina può essere eseguita con forbici o con minutini ricavati da filo fine in tungsteno.</td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

homarus americanus stomatogastric dissezione del sistema nervoso

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Con l&#39;obiettivo di comprendere come i sistemi nervoso produrre attività e rispondere con l&#39;ambiente, i neuroscienziati rivolgersi a sistemi di modelli che presentano le attività di interesse e sono accessibili e suscettibili di metodi sperimentali. Il sistema nervoso stomatogastric (STNS) della aragosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;, È stato anche conoscere l&#39;aragosta atlantica o Maine) è stata stabilita come sistema modello per studiare il ritmo generare reti e neuromodulazione delle reti. Il STNS è composta da 3 gangli anteriori (2 gangli commissurali e un ganglio esofageo), che contiene i neuroni che modulatori progetto centrale per il ganglio stomatogastric (STG). La STG contiene circa 30 neuroni che formano due reti disegno centrale generazione, le reti pilorica e gastriche che sono alla base comportamenti alimentari nei crostacei<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Mentre è possibile studiare questo sistema<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt;, Il STNS continua a produrre la sua attività ritmica quando isolato<i&gt; In vitro</i&gt;. Isolamento fisico della STNS in un piatto permette un facile accesso al somata nei gangli di registrazioni elettrofisiologiche intracellulari e ai nervi del STNS per le registrazioni extracellulari. Isolare il STNS è un processo in due parti. La prima parte, sezionare lo stomaco dall&#39;animale, è descritto in un articolo che accompagna il video<sup&gt; 4</sup&gt;. In questo articolo video, tecniche di dissezione fini sono utilizzati per isolare il STNS dallo stomaco. Questa procedura si traduce in una preparazione del sistema nervoso che è disponibile per le registrazioni elettrofisiologiche.

Descriviamo la dissezione di precisione del sistema nervoso stomatogastric dallo stomaco del aragosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Homarus Americanus Stomatogastric dissezione del Sistema Nervoso

Con l'obiettivo di comprendere come i sistemi nervosi generino attività e rispondano all'ambiente, i neuroscienziati ricorrono a sistemi modello che esibiscono il...

La procedura per isolare il sistema nervoso gastrico ST della razza può essere suddivisa in due parti: la dissezione macroscopica e quella fine. Questo video illustra la dissezione fine del sistema nervoso gastrico somatico proveniente dallo stomaco, inclusi il ganglio gastrico stearico, indicato come STG, e i gangli comessurali, indicati come COGs. Fondamentalmente, i nervi e i gangli devono essere separati dai tessuti circostanti, iniziando dall'isolamento dei CGS, seguito dall'isolamento del STG. Il risultato di questa procedura è il sistema nervoso gastrico sistemato in una bacinella e fissato con puntine, pronto per essere utilizzato in una varietà di studi incentrati sulla funzione del sistema nervoso.Ciao, sono Annalise Tobin del laboratorio della dottoressa Eve Martyr del dipartimento di biologia dell'Università di Brandeis. Ciao, sono Hillary Burman, anch'io del Laboratorio Martyr. Oggi vi mostreremo un protocollo per isolare il sistema nervoso gastrico somatico dallo stomaco dell'astice Homarus americanus per osservare come lo stomaco è stato rimosso.Si prega di consultare il nostro protocollo video associato su JoVE. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la funzione dei neuroni in piccoli circuiti neurali coinvolti nella produzione di comportamenti ritmici. Cominciamo dunque.Per iniziare, è necessaria una preparazione dello stomaco dell'aragosta per osservare come viene eseguita questa procedura. Guardare prima il video allegato in cui Beerman e Tobin orientano la preparazione in modo che l'estremità interna, vicina alla bocca, sia rivolta lontano da voi e l'estremità posteriore sia rivolta verso di voi. Questa parte della procedura inizia con un fissaggio più preciso della preparazione.Fissare l'esofago su ciascun lato del labbro e, se necessario, riorganizzare gli altri spilli posizionati durante la dissezione macroscopica in modo che lo stomaco giaccia piatto. Successivamente, rimuovere l'ipoderma afferrandolo prima vicino ai muscoli gm, due muscoli GM tre, staccandolo da questi muscoli e tirandolo delicatamente in direzione anteriore. Separare l'ipoderma dal tessuto adiposo sottostante recidendo eventuali connessioni, facendo attenzione al grasso presente attorno all'arteria centrale, che racchiude parte del sistema nervoso gastrico somatico; lasciare l'ipoderma intatto.In un raggio di circa 0,5 centimetri attorno al ganglio gastrico somatico, situato tra i muscoli GM uno B, l'ipoderma separato può ora essere reciso. Il passo successivo consiste nel staccare il cervello dal tessuto sottostante. Iniziare identificando i due grandi nervi commissurali che si estendono bilateralmente dalla porzione anteriore del cervello ai gangli commissurali nella porzione anteriore dello stomaco.Lasciando intatti questi nervi, sollevare delicatamente il cervello con una pinzetta e tagliare per separare il cervello dal resto del tessuto. Procedere con attenzione, poiché il nervo gastrico somatico si trova al di sotto del cervello e deve essere mantenuto intatto. Per separare i gangli comissurali dal tessuto circostante, localizzarli innanzitutto seguendo uno dei nervi com fino a un ganglio.Ora identificare il nervo ION e SON. Questi nervi devono rimanere integri. Ogni ganglio comissurale avrà numerosi nervi che si irradiano verso l'esterno.Recidere la maggior parte di essi, eccetto l'ION e il SON. Lasciare un nervo aggiuntivo collegato per mantenere il ganglio comissurale in posizione mentre si completa la dissezione. Ora individuare e sezionare i nervi dall'altro ganglio comissurale nello stesso modo.Successivamente, pulire l'ION e il SON da laterale a mediale. Lasciare intatto il nervo labiale per ancorare il preparato allo stomaco. Il ganglio esofageo si trova all'incrocio con l'iOS.È possibile liberare la zona sottostante afferrando il nervo ventricolare inferiore e tagliando verso l'alto al di sotto di esso. Il passo successivo consiste nel separare il STG dal tessuto circostante. Il STG si trova all'interno di un'arteria che si estende tra i muscoli GM uno B e i muscoli GM due a B.Cercare l'estremità tagliata dell'arteria vicino al gm. Due muscoli AB tirano l'arteria verso l'alto e in direzione interna per esporre il DVN. Continuare a tirare verso l'alto fino al resto dell'ipoderma.Dopo la separazione, l'arteria può essere rifinita fino al punto in cui tocca l'ipoderma residuo. Ora rimuovere la falda muscolare situata nel rostro dell'astice. Successivamente, sollevare l'ipoderma sopra l'arteria.L'arteria forma un tunnel all'interno del tessuto adiposo. Sopra il muscolo STG. Inserire una lama delle forbici all'interno dell'arteria e tagliare il muscolo sovrastante.Verificare di poter vedere il DVN durante il taglio per assicurarsi di operare in sicurezza. Sopra il STG, continuare il taglio in direzione anteriore seguendo l'arteria. Tagliando al di sopra del STG, sarà possibile osservare il STN che si estende anteriormente dal STG e si dirige verso il basso all'interno del muscolo.Continuare a tagliare in senso anteriore per separare completamente il muscolo sopra il STG. Rimuovere eventuali tessuti dal STN. Ora possiamo procedere all'isolamento di diversi altri nervi.I prossimi nervi da separare dal tessuto circostante sono i nervi gastrici anteriori (AGN). Anche se non si prevede di effettuare registrazioni dall'AGN, sarà necessaria una porzione di esso per fissare il ganglio. Per visualizzare meglio gli AGN, rimuovere l'ipoderma residuo e uno strato sottile del muscolo sottostante appena posteriore al ganglio stomatogastrico (STG).Cercare un tunnel scuro nel tessuto adiposo e muscolare su entrambi i lati del DVN, inserire una lama delle forbici all'interno del tunnel e tagliare il tessuto sopra il nervo. Continuare a tagliare in senso laterale seguendo il nervo per isolare quest'ultimo. Qualche millimetro è sufficiente per fissare il ganglio, ma esporre almeno cinque millimetri del A GN se si prevede di effettuare la registrazione da esso.Staccare un GN dal muscolo che innerva recidendo le connessioni. Ripetere ora questo procedimento sull'altro lato per isolare l'altro GN A. Una volta dissecati entrambi i GN A, recidere tutti i muscoli e i tessuti che collegano lo STG allo stomaco. Successivamente, isolare i vnm M.Sono una coppia bilaterale di piccoli nervi che si diramano dal LVN e decorrono lateralmente al di sotto del tessuto adiposo. Utilizzare le forbici o due pinze per recidere il tessuto adiposo su un lato del DVN in prossimità del punto in cui si divide nei due LVN. In questo punto si è lontani dai M VNS e non si corre il rischio di reciderli.Sollevare lo strato di grasso e cercare al di sotto un piccolo nervo. Il NVM mediale corre lateralmente appena posteriormente al livello dei muscoli GM e B. Rimuovere lo strato di grasso sopra il NVM lasciando intatto il nervo per il momento, in modo che non si aggrovigli.Taglierai la sua estremità laterale e tutti gli attacchi al M VNS alla fine della dissezione del sistema nervoso. Ripeti il procedimento sull'altro lato per isolare l'altro MVN. Successivamente, procedi all'isolamento dei LVN nei nervi posteriori.Partendo dal ramo LVN che si dirama lateralmente dal DVN. Seguire un LVN rimuovendo il tessuto adiposo sovrastante. A seconda del preparato, a volte l'intero strato adiposo sopra il nervo può essere rimosso completamente.Continuare a esporre il nervo grande auricolare fino al punto in cui il nervo auricolotemporale si dirama. Ora individuare il nervo auricolare posteriore. È un nervo che decorre posteriormente sopra i pori.Rimuovere la sottile membrana che ricopre questa regione. Isolare il PYN tagliando una piccola sezione del poro adiacente al contenitore del PYN. Successivamente, sollevare delicatamente la sezione pric e asportare il tessuto su entrambi i lati del PYN fino a raggiungere il ramo che si attacca al PDN.Procedere con l'isolamento del nervo PDNA che decorre posteriormente al muscolo dilatatore delle pinne. Innanzitutto, recidere una piccola sezione del muscolo dilatatore delle pinne attaccata al PDN. Quindi, sollevare delicatamente la sezione del muscolo dilatatore delle pinne.Rimuovere il tessuto su entrambi i lati del PDN fino a raggiungere il ramo che si attacca al PYN. Individuare ora il LVN ventrale che collega il PYN e il PDN al LVN nel punto di biforcazione triangolare in cui il PYN e il PDN si connettono al LVN ventrale; isolare un piccolo tratto di nervo che si dirama dal LVN ventrale, come il VPLN. Questo verrà utilizzato come maniglia per tirare il LVN ventrale sollevando la maniglia.Asportare il tessuto su entrambi i lati del nervo vago ventrale (LVN) procedendo in direzione anteriore fino a raggiungere il punto in cui il nervo splancnico posteriore (PSN) si dirama. A questo punto, i nervi posteriori su un lato dello stomaco sono stati correttamente dissezionati. Ora isolare il LVN e i nervi posteriori sull'altro lato.Staccare completamente il nervo vago laterale (LVN) dallo stomaco. Tirare sul nervo splancnico portale (PSN) e recidere tutti i tessuti e i nervi collegati al LVN e al LVN ventrale, ad eccezione del nervo duodenale pancreático (PDN) e del nervo pancreatico y (PYN). Ripetere questa procedura sull'altro lato.Successivamente, recidere l'estremità laterale di ciascun nervo vestibolare mediale (MVN). Sollevare l'estremità laterale e recidere tutti i legamenti al MVN all'estremità anteriore. Recidere tutti i legamenti ai gangli commessurali e il nervo labiale su ciascun lato.Esaminare visivamente il sistema nervoso gastrico somatico per identificare ed eliminare eventuali ulteriori aderenze al tessuto gastrico. Una volta recisi tutti i collegamenti, afferrare l'estremit&agrave; anteriore di entrambi i nervi commissurali al di sopra dei gangli commissurali e staccare il sistema nervoso gastrico somatico dallo stomaco, spostandolo lateralmente nel piatto. Durante questa operazione, recidere qualsiasi ulteriore aderenza per liberare completamente il sistema nervoso.La dissezione è ora completa. Iniziare preparando la piastra Söderberg alla quale verrà fissato il sistema nervoso. Strofinare accuratamente un po' di tessuto gastrico sulla superficie della piastra Söderberg nella piccola capsula.Questo ridurrà l'idrofobicità della piastra in modo che la soluzione salina si distribuisca uniformemente sulla superficie della piastra. Sciacquare e riempire la piastra per sigari con soluzione salina fredda. Trasferire il sistema nervoso nella piastra in sodio preparata afferrando le estremità anteriori di entrambi i nervi commissurali.Sollevare il sistema nervoso dalla piastra grande e posizionarlo nella piastra piccola. Per fissare il sistema nervoso, utilizzare una combinazione di spilli minutia e spilli più sottili. Tagliare prima il filo di tungsteno, assicurandosi che la preparazione sia con il lato dorsale rivolto verso l'alto verificando che il nervo ventricolare inferiore sia orientato lontano dal guardo sile. Ora rimuovere il cervello e fissare i nervi commissurali. Tirare delicatamente il sistema nervoso disteso e appiattito tirando ciascun nervo SNP posteriormente e lateralmente e fissandoli con puntine. Successivamente, rimuovere il muscolo dilatatore del PN dal SNP e fissare questi nervi.Quindi rimuovere il segmento pilorico dai GYN e fissare i GYN. Infine, fissare tutti i nervi isolati rimanenti, come i nervi labiali, i m vns e gli AGNs. Il passo successivo consiste nel de-scheatrare lo S st.Per prima cosa, assicurarsi che l'S st G sia ben appoggiato contro la protezione S e tenuto teso dai nervi AGN laterali. Il nucleo STN anteriore e il nucleo DVN posteriore sono disposti in modo da regolare l'illuminazione per permettere la visualizzazione degli assoni all'interno del DVN. Successivamente, utilizzando un piccolo perno o un sottile ago di tungsteno.Praticare un piccolo foro superficiale nella guaina che circonda il DVN, appena posteriore al STG. Tirare l'ago attraverso il DVN colorato dorsalmente rispetto agli assoni per creare una lacerazione orizzontale nella guaina nervosa. A questo punto afferrare una falda della guaina nervosa posteriore al STG e tirarla anteriormente, quindi tagliare per rimuovere la guaina dal lato dorsale del STG.Dopo la rimozione della guaina, il preparato è pronto per l'esperimento, a condizione che venga mantenuto fresco tra circa 4 e 15 gradi Celsius. Si è osservato che questo preparato rimane sperimentalmente stabile fino a cinque giorni. Il sistema nervoso gastrico gastrico intatto di Sato deve essere fissato a forma di T contro la piastra di Syl.Come mostrato, i nervi devono essere privi di danni ed accessibili per registrazioni extracellulari. I corpi cellulari del STG integro devono essere visibili ed accessibili per registrazioni intracellulari. Vi abbiamo appena mostrato come isolare il sistema nervoso gastrico somatico dell'astice Homa Americana.Quando si esegue questa dissezione, è fondamentale acquisire una conoscenza approfondita dell'anatomia per evitare di danneggiare tessuti e nervi. Inoltre, è essenziale mantenere il preparato a una temperatura fresca compresa tra i quattro e i 15 gradi Celsius. Questo risultato può essere facilmente ottenuto durante la dissezione sostituendo la soluzione salina ogni mezz'ora con soluzione salina fredda, che va tenuta in frigorifero a quattro gradi Celsius quando il preparato deve essere mantenuto fresco.È vitale per ore, fino a giorni. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

homarus-americanus-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il sistema nervoso stomatogastric (STNS) del granchio Giona...

Cancro Borealis Stomatogastric dissezione del Sistema Nervoso

Descriviamo la dissezione lordo dello stomaco del aragosta americana...

Dissezione lordo dello Stomaco del Gambero, Homarus Americanus</em

Lo scopo principale di questo esperimento è quello di capire in che modo i neuroni sensoriali primari trasmettere informazioni di movimenti e posizioni comuni, come informazioni propriocettive per un animale. Un ulteriore obiettivo di questa relazione è presente l'anatomia della preparazione di dissezione e la visualizzazione dei neuroni sotto un microscopio da dissezione.

Receptor Organi muscolare all&#39;addome gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti in propriocezione

Qui vi presentiamo la metodologia per una rapida e ad alta risoluzione fluorescenti tensione-sensibili di imaging tintura di attività dettagliata dei neuroni del ganglio stomatogastric granchio.

Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti

Descriviamo la dissezione del sistema nervoso della marina mare...

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

Lamprede recuperare locomozione dopo una lesione completa del midollo spinale. Tuttavia, alcuni neuroni spinali-proiezione sono buoni recuperatori e altri non lo sono. Questo documento illustra le tecniche per la lampreda di mare abitazioni larve (e adulti recentemente trasformati), producendo completi transezioni midollo spinale e la preparazione di cervelli wholemount e midolli spinali per l'ibridazione in situ.

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

Qui descriviamo la dissezione del cordone nervoso addominale del gambero. Dimostriamo anche una tecnica elettrofisiologica per registrare la locomozione fittizia dai motoneuroni nuotatori.

Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

I saggi comportamentali forniscono potenti strumenti per comprendere la funzione neuronale. Qui presentiamo diversi protocolli per quantificare il comportamento alimentare predatorio trovato nel nematode modello Pristionchus pacificus e nei suoi parenti. Inoltre, forniamo metodi per analizzare gli adattamenti all'alimentazione predatoria, comprese le strutture della bocca e i denti.

Saggio comportamenti alimentari predatori in<em&gt; Pristionchus</em&gt; E altri nematodi

Qui presentiamo un protocollo per la parte chirurgica minimamente invasiva dei muscoli intrinseci all'apparato alimentare del mollusco marino Aplysia californica per comprendere i ruoli di questi muscoli durante il comportamento di alimentazione.

Una tecnica di lesione mini-invasiva per i muscoli intrinseca all'odontoia di Aplysia californica

Questo protocollo presenta un metodo per l'imaging dell'attività della popolazione neuronale con risoluzione a singola cellula in specie di invertebrati non transgenici utilizzando coloranti sensibili alla tensione di assorbanza e un array di fotodiodi. Questo approccio consente un flusso di lavoro rapido, in cui l'imaging e l'analisi possono essere perseguiti nel corso di un solo giorno.

Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici

Impara la dissezione fine del sistema nervoso stomatogastrico di Homarus americanus per studi di neurofisiologia. Questo protocollo dettagliato permette di isolare gangli e nervi per analisi funzionali dei circuiti neurali.

Homarus Americanus Stomatogastric dissezione del Sistema Nervoso

Esplora altri video