Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Questa procedura inizia con l'iperespressione del dominio C-terminale ricombinante del recettore Puric P due X o P due X due, ingegnerizzato come proteina fusa GST dopo la lisi batterica. La proteina purificata viene incubata con perle di glutathione seros quattro B e la concentrazione viene determinata mediante il metodo di Bradford. Successivamente, le proteine provenienti da lisato cerebrale di ratto purificato vengono incubate con il dominio C-terminale dei recettori P due X due legato al glutathione su perle seros e i complessi proteici legati al dominio C-terminale dei recettori P due X due vengono isolati mediante elettroforesi su gel SDS-PAGE, escissione della banda e identificati mediante spettrometria di massa.

Ciao, sono Harpring del laboratorio del Dipartimento di Fisiologia JIT K presso l'Università della California di Los Angeles. Ciao, sono Sarah Walburn del laboratorio di Tom Vka del Dipartimento di Anestesiologia presso l'Università della California di Los Angeles. Oggi vi mostreremo la procedura per isolare e purificare i CTS dei recettori P2X2.

Utilizziamo queste proteine per identificare l'origine dal cervello rosso e nel nostro laboratorio usiamo queste proteine per studiare le conseguenze funzionali sui recettori P2X2. Cominciamo dunque. Il dominio citosolico del recettor P2X2 è costituito dai terminali N e C.

Il terminale C del recettore P2X2 verrà utilizzato come esca per il saggio di pull-down, come mostrato anche nella sequenza del terminale C del recettore P2X2 impiegata per questo studio di interazione. Per esprimere l'intera lunghezza del terminale C dei recettori P2X2, utilizzare tecniche convenzionali di biologia molecolare per integrare la sequenza codificante per il terminale C del recettore, residui 353-472, in un plasmide pGE-X4-NT1.

Il plasmide ricombinante viene quindi trasformato in ceppo di e coli BBL 21 per l'espressione. I batteri contenenti il plasmide ricombinante sono coltivati in LB a 37 gradi Celsius. Quando la densità ottica della coltura a 600 nanometri è compresa tra 0,6 e 0,8.

Indurre la coltura con un millimolare di IPTG e incubare per tre ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione di tre ore, prelevare un'aliquota di un millilitro dalla coltura e conservarla per analisi successive. Centrifugare il resto della coltura a 5.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, dopo la centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 20 millilitri di buffer salino Tris EDTA; trasferire il pellet risospeso in un tubo falcon da 50 millilitri.

La sospensione deve ora essere centrifugata a 5.000 G per 15 minuti per raccogliere il pellet semisecco, che viene congelato a meno 70 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, risospendere il pellet congelato in 40 millilitri di buffer di lisi ghiacciato e porre in ghiaccio per 30 minuti mentre il pellet risospeso rimane in ghiaccio. Preparare tre millilitri di perle di glutathione sefaro 4B.

Prima lavare le perle con 20 millilitri di PBS e 20 millilitri di TPBS. Successivamente, lavare le perle con PBS puro e risospendere in un millilitro di PBS. La sospensione batterica nel buffer di lisi viene ora congelata e scongelata con azoto liquido.

Il campione congelato è stato incubato sul ghiaccio per scongelare e nuovamente purgato con azoto liquido. Questo passaggio è stato ripetuto tre volte. Successivamente, sottoporre a sonica la sospensione congelata-scongelata sul ghiaccio.

Dopo la sonificazione, incubare la sospensione batterica con una soluzione contenente 4% Tritton X-114, 10 millimoli di solfato di magnesio e 2 millimoli di ATP per 30 minuti sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare il lisato a 20.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il soprannatante. Prima di scartare il pellet, prelevare un piccolo campione del pellet insieme al soprannatante per analizzare le proteine nel citosol e nelle membrane.

Incubare il sopranatante con le perle per un'ora o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare le perle a 500 ×g per cinque minuti. Eliminare la maggior parte del sopranatante, ma conservare un piccolo campione per rappresentare la frazione di proteine non legate. Lavare le perle pellettizzate cinque volte con 25 millilitri di TPBS, conservando una piccola quantità di ciascun lavaggio per i controlli di lavaggio.

Infine, risospendere le perle in PBS fino a ottenere una sospensione al 50% peso/volume e conservare a quattro gradi Celsius. La concentrazione proteica può essere stimata mediante saggio di Bradford seguendo le istruzioni del produttore e si prevede che sia di 500 microgrammi per millilitro. Per identificare i partner di legame della proteina P due X due CT GST da lisati cerebrali totali, viene effettuato un saggio di pull-down utilizzando CT GST immobilizzato su perle rivestite con glutatione come esca, impiegato come controllo.

Utilizzare GST da solo legato a perle come esca, d'ora in poi indicato come GST Knoll Rat Brainin lisato. Per il saggio di legame della proteina fusa GST è stato utilizzato un protocollo standard e un buffer di lisi, e la concentrazione proteica è stata stimata in 15 milligrammi per millilitro mediante il saggio di Bradford. Prima di iniziare il saggio.

Pre-clarificare il lisato cerebrale scongelato incubandolo con 30 microlitri di perle GST per un'ora a quattro gradi Celsius dopo che il lisato è stato incubato con le perle GST. Centrifugare le perle a 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il soprannatante e mantenere un piccolo volume come controllo.

Ora calcolare il volume di lisato che dovrebbe contenere 100 microgrammi di proteina solubilizzata pre-pulita e combinare questo volume di lisato con 10 microgrammi di perle legate al GST e 10 microgrammi di perle legate al GST P2X2CT. Portare il volume a 200 microlitri utilizzando il buffer di lisi. Incubare il lisato con le perle durante la notte su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, centrifugare le perle a 1000 G per cinque minuti e scartare il soprannatante. Lavare le perle tre volte con un millilitro di buffer di lisi. Quindi aggiungere 50 microlitri di buffer lely modificato alle perle e far bollire le perle in questo buffer per cinque minuti.

Centrifugare i campioni bolliti a 5.000 ×g per cinque minuti ed eseguire l'analisi su un gel SDS-PAGE al 10%. Confrontare le proteine associate a P2X2CT con quelle ottenute utilizzando l'esca GST Nola. L'ultimo passaggio critico dell'analisi consiste nel rimuovere le proteine separate dal gel per la loro identificazione mediante spettrometria di massa a partire da questo punto.

L'assenza di polvere durante tutto il processo è fondamentale per ridurre la contaminazione da cheratina. Iniziare tagliando le bande dal gel con una lama da rasoio pulita. Successivamente, suddividere le bande in tre sezioni più piccole e inserire ciascuna banda in una provetta microcentrifuga etichettata, corrispondente alle regioni del gel nel GST.

Una striscia di gel senza banda deve essere anch'essa escissa nello stesso modo, senza considerare la colorazione della banda. Per assicurare che non vengano perse proteine al di sotto del limite di sensibilità della colorazione, mescolare i frammenti di gel con 200 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare e acetonitrile al 50% in volume. Successivamente vortexare i tubi per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver agitato con il vortex, rimuovere la soluzione di lavaggio e ripetere l'operazione. Rimuovere l'ultima soluzione di lavaggio e disidratare i pezzi di gel aggiungendo 200 microlitri di acetonitrile. I pezzi di gel dovrebbero ridursi di dimensioni e diventare opachi.

Entro due minuti, rimuovere l'acetonitrile e asciugare i pezzetti di gel. I pezzetti di gel asciutti vengono quindi incubati per 10 minuti in un evaporatore sotto vuoto (speed vac) in una soluzione appena preparata di DTT 10 millimolare e TEP 10 millimolare. Il volume della soluzione, solitamente di circa 30 microlitri, deve essere sufficiente a immergere completamente i pezzetti di gel.

Lasciare che i pezzi di gel vengano ridotti nella soluzione per 30 minuti in un blocco termico a 56 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la soluzione di DTT TEP e sostituirla con una soluzione di lavaggio composta da 100 microlitri di bicarbonato di ammonio 500 millimolare in acetonitrile al 50%, vorticiare per 10 minuti, quindi aspirare il bicarbonato di ammonio dopo aver vorticiato e sostituirlo con 200 microlitri di acetonitrile per disidratare i pezzi di gel. I pezzi di gel dovrebbero restringersi e diventare opachi entro due minuti.

Oltre all'alchilazione, per sostituire l'acetonitrile in presenza di qualsiasi tiolo libero, aggiungere 100 microlitri di una soluzione di acetammide IOTO 100 millimolare appena preparata. Incubare questa miscela per 25 minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di acetammide IOTO e lavare i pezzi di gel con 200 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare e acetonitrile al 50% mediante vortex per cinque minuti.

Questo passaggio di lavaggio viene ripetuto una volta. Rimuovere la soluzione di lavaggio finale e incubare i frammenti di gel in 200 microlitri di acetonitrile per 10 minuti. Rimuovere l'acetonitrile ed essiccare i campioni nel speed vac.

In questa fase, i frammenti di gel sono pronti per la digestione con tripsina. Aggiungere 30 microlitri di soluzione di tripsina a una concentrazione lavorativa di circa 20 nanogrammi per microlitro e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.

I pezzi di gel dovrebbero risultare ben gonfi. Rimuovere l'eccesso di soluzione di tripsina e immergere le particelle di gel reidratate in 30 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare. Lasciare procedere la digestione per 12-16 ore a 37 gradi Celsius, seguita da una digestione prolungata con cinque microlitri di acido formico al 5% per inattivare la tripsina e arrestare la digestione.

Quindi vortexare i tubi per 15 minuti; dopo aver effettuato il vortex, centrifugare brevemente i tubi per far scendere il liquido in fondo al tubo e trasferire questa soluzione contenente i peptidi digeriti in un tubo semimillimetrico pulito e etichettato. Successivamente, coprire i pezzi di gel con circa 30 microlitri di soluzione di estrazione contenente 0,1% di acido formico in acetonitrile al 50% e vortexare per 10-15 minuti. Aggiungere questa soluzione di estrazione al nuovo tubo semimillimetrico.

Ripetere questo passaggio. Trasferire la soluzione di estrazione nel nuovo tubo da mezzo millilitro; il tubo da mezzo millilitro contenente la soluzione di digestione notturna e le due soluzioni di estrazione viene ridotto a circa 30 microlitri nel speed vac. La soluzione peptidica è ora pronta per l'analisi mediante L-C-M-S-M-S.

Separare le proteine mediante cromatografia liquida nano in fase inversa, utilizzando una colonna C18 in fase inversa, acquisire gli spettri in modalità dipendente dai dati con l'orbitrap impiegato per le analisi MS e l'LTQ per le analisi MS-MS. Identificare le proteine cercando i dati nel database IPI di ratto utilizzando l'algoritmo Sequest integrato nel pacchetto software Bioworks, quindi esaminare manualmente gli spettri solo per le proteine presenti in ciascuno dei quattro replicati del campione e assenti durante il controllo con GST. Le proteine non rilevate negli esperimenti di pull-down non devono essere considerate per ulteriori analisi.

Qui è mostrato il gel della colorazione Cipro con uno spettro di proteine putative che interagiscono con il dominio C-terminale dei recettori P due X due. Fusi con GST, indicati dalla linea di controllo blu per GST da solo, indicata dal riquadro giallo, e da glutathione. Sono mostrati anche i risultati ottenuti con le perle di glutathione solfato da sole.

Le frecce indicano esempi di bande uniche che sono state escisse per un'ulteriore analisi mediante spettrometria di massa. Vi abbiamo appena mostrato come esprimere e purificare i CTO dei recettori P due X due. Vi abbiamo inoltre mostrato come eseguire il saggio di pull-down acido e identificare gli interattori proteici.

È importante ricordare, durante l'esecuzione di questa procedura, di indossare guanti e rete per capelli per ridurre la contaminazione da cheratina nei campioni. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna per i vostri esperimenti.