La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia
13 marzo 2009
Un metodo semplice, economico ed efficace per preparare gli embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi è presentato. Il nostro protocollo prevede l'umidità e lo scambio di gas e non comprimere l'embrione di Drosophila. Questo metodo è adatto per GFP-based di immagini dal vivo di embrioni di Drosophila utilizzando uno stereomicroscopio o microscopio composto verticale.
Ciao. Mi chiamo Bruce Reed. Sono professore assistente presso il Dipartimento di Biologia dell'Università di Waterloo a Waterloo, in Ontario, Canada. Oggi stiamo realizzando questo archivio video per documentare una nuova tecnica da noi sviluppata per il preparare embrioni di Drosophila per l'analisi mediante imaging vitale.
Durante l'analisi di imaging in tempo reale utilizzando embrioni di drosophila, impieghiamo frequentemente acquisizioni con lapse temporale, che possono durare diverse ore. È quindi fondamentale disporre di una tecnica in cui gli embrioni siano protetti sia dalla disidratazione che dall'ipossia. Inoltre, desideriamo sviluppare una tecnica che eviti qualsiasi compressione dell'embrione.
Nell'allestimento, abbiamo sviluppato un metodo molto semplice, economico ed efficace che chiamiamo preparazione a goccia sospesa. La preparazione a goccia sospesa è adatta per l'analisi in tempo reale di embrioni mediante microscopia stereoscopica o qualsiasi microscopio composto eretto. Questo filmato in time-lapse mostra otto embrioni esprimenti GFP preparati utilizzando il protocollo della goccia sospesa e analizzati mediante microscopia a fluorescenza in time-lapse.
Questa sequenza di immagini rappresenta oltre quattro ore di tempo trascorso. L'insorgenza del movimento indica che questi embrioni si trovano in condizioni vitali. Ora vi illustreremo una descrizione dettagliata passo dopo passo su come eseguire il protocollo della goccia sospesa.
Gli embrioni vengono raccolti su piastre standard di succo d'uva o con uova. Utilizzando un raccoglitore automatico di uova dsof FLA dell'attrezzatura scientifica Fly max, il dispositivo fornisce raccolte sincronizzate di embrioni a uno stadio di sviluppo predeterminato. In preparazione alla decorazione manuale degli embrioni, un pezzo di nastro adesivo doppio faccia viene attaccato a un vetrino e il rivestimento protettivo del nastro viene rimosso.
Il protocollo della goccia sospesa richiede una camera personalizzata realizzata con un foglio di plastica in policarbonato spesso cinque millimetri. Il foglio viene tagliato alle dimensioni di un vetrino da microscopio e una depressione profonda tre millimetri viene realizzata con un trapano. L'umidificazione della camera per l'acquisizione di immagini in tempo reale viene ottenuta utilizzando un pezzo di tessuto che viene tagliato per adattarsi alla cavità della camera e inumidito con acqua distillata.
L'olio Halo Carbon è ideale per l'immagineggiamento in tempo reale di embrioni di drosophila perché è permeabile ai gas e otticamente trasparente. Mescolando l'olio Halo Carbon serie 700 e serie 56 in rapporto uno a uno si ottiene una viscosità adatta per lavorare con embrioni di Drosophila. Gli embrioni possono essere raccolti dalle piastre in agar al succo d'uva utilizzando pinzette da gioielliere o un pennello molto fine.
Gli embrioni aderiscono gli uni agli altri e alle punte della pinzetta. Si raccolgono facilmente in ammassi, ammassi di embrioni. Aderiscono alla pinzetta.
I puntali vengono abbassati delicatamente sulla superficie adesiva del nastro presente nel vetrino preparato in precedenza. Osservando gli embrioni attraverso un microscopio stereoscopico, spingerli delicatamente o accarezzarli con il lato della pinzetta. È necessario rompere l'involucro esterno senza lacerare la membrana interna di vilina.
Questo richiede mano ferma, pazienza e un po' di pratica. Una volta che la corona esterna è stata rotta, l'embrione declorinato tende ad aderire alla pinzetta. Fare attenzione a non far toccare all'embrione declorinato la superficie appiccicosa del nastro.
È molto difficile recuperarlo dal nastro; trasferire rapidamente gli embrioni declorinati nell'alone. Gocce di olio al carbonio sul vetrino. È consigliabile tenere questo a portata di mano toccando la punta della pinzetta sulla superficie della goccia di olio al carbonio.
L'embrione viene staccato dalla pinzetta nell'olio; il trasferimento dell'embrione può essere confermato a occhio nudo utilizzando uno sfondo nero e una sorgente di illuminazione a fibra ottica posizionata a un angolo obliquo, prima di clorinare l'embrione successivo. È utile asciugare l'olio dalle pinzette a causa della loro galleggiabilità nell'olio alaloforo. Gli embrioni coordinati galleggiano sulla superficie della goccia d'olio.
È possibile controllare la posizione e l'orientamento degli embrioni spingendoli sul fondo della goccia d'olio e capovolgendo rapidamente il vetrino nel protocollo della goccia sospesa. Si capovolge il vetrino sopra la cavità umidificata della camera per l'acquisizione di immagini in tempo reale. Quando il vetrino viene capovolto, gli embrioni si appoggiano sulla superficie inferiore del vetrino.
Le posizioni di riposo degli embrioni possono essere verificate al microscopio stereoscopico. Se non soddisfacenti, la procedura può essere ripetuta. Una volta che gli embrioni si trovano nella posizione desiderata, il vetrino coprioggetto viene fissato alla camera per l'acquisizione di immagini in tempo reale con del nastro adesivo.
La camera viene aerata praticando dei fori nel nastro. Gli embrioni sono ora pronti per essere sottoposti a imaging.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo semplice ed efficace per preparare embrioni di Drosophila per l'analisi mediante imaging in tempo reale. Il protocollo garantisce un'adeguata umidità e scambio gassoso, prevenendo al contempo la compressione degli embrioni, rendendolo adatto all'imaging basato sulla GFP.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- L'analisi di imaging in tempo reale di embrioni di Drosophila è comunemente eseguita mediante acquisizione a intervalli di tempo.
- Gli embrioni sono vulnerabili alla disidratazione e all'ipossia durante sessioni di imaging prolungate.
- Una tecnica che eviti la compressione degli embrioni è essenziale per un imaging accurato.
- L'imaging basato su GFP richiede condizioni specifiche per risultati ottimali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per proteggere gli embrioni di Drosophila dalla disidratazione.
- Garantire un adeguato scambio gassoso durante l'acquisizione delle immagini.
- Evitare la compressione degli embrioni durante l'acquisizione di immagini in tempo reale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di embrioni di Drosophila per l'analisi in vivo.
- Applicazione del controllo dell'umidità durante le sessioni di acquisizione immagini.
- Utilizzo di un microscopio stereoscopico o di un microscopio composto eretto per l'acquisizione delle immagini.
- Applicazione di tecniche di acquisizione basate su GFP.
Risultati principali
- Il metodo mantiene efficacemente l'umidità e lo scambio gassoso per gli embrioni.
- Gli embrioni rimangono senza compressione, consentendo una migliore qualità di imaging.
- L'imaging basato su GFP fornisce risultati chiari per periodi prolungati.
- La tecnica è semplice ed economica per i ricercatori.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la qualità dell'immagine in vivo di embrioni di Drosophila.
- Fornisce un approccio affidabile per i ricercatori del settore.
- Il protocollo può essere facilmente adottato in diverse impostazioni di laboratorio.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging in tempo reale di organismi modello è fondamentale per la validazione degli obiettivi e per lo screening fenotipico nelle fasi iniziali della scoperta. Il protocollo a goccia sospesa affronta limitazioni chiave come la disidratazione, l'ipossia e la compressione meccanica, che compromettono la vitalità dell'embrione e la qualità dei dati durante l'imaging a intervalli prolungati. Consentendo un imaging non compresso e fisiologicamente rilevante di embrioni di Drosophila, questo metodo supporta una valutazione meccanicistica del rischio associato a interventi genetici e farmacologici in un formato scalabile ed economicamente sostenibile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della regolazione genetica in processi dinamici come la morfogenesi dei tessuti e l'adesione cellulare, senza artefatti meccanici derivanti dalla compressione.
- Valore operativo: Mantiene la vitalità dell'embrione per oltre quattro ore, permettendo osservazioni longitudinali della funzione genica e della dinamica delle vie di segnalazione.
- Valore predittivo: Riduce i falsi positivi derivanti da fenotipi indotti da stress, migliorando l'affidabilità dei saggi di validazione degli obiettivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per l'immagine in tempo reale basata su GFP che minimizza la variabilità ambientale.
- Valore operativo: Utilizza materiali economici e facilmente reperibili (olio alogeno, camera in policarbonato, nastro) adatti per adattamenti ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Sfrutta la galleggiabilità dell'embrione nell'olio per mantenere la stabilità posizionale, riducendo gli spostamenti e migliorando la coerenza del segnale nell'acquisizione a intervalli di tempo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Permette l'analisi di processi dello sviluppo conservati, rilevanti per i modelli di malattie umane, facilitando l'estrapolazione tra specie.
- De-risking meccanicistico: Consente l'osservazione di comportamenti cellulari (ad esempio, morte cellulare, adesione) in condizioni fisiologiche, migliorando l'affidabilità predittiva per modelli preclinici successivi.
- Sistema rilevante per le malattie: Embryoni di Drosophila che esprimono reporter GFP associati a malattie possono essere utilizzati per monitorare la modulazione di percorsi biologici in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il protocollo della goccia sospesa si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, in particolare per saggi che richiedono un'immagine dinamica e non compressa di reporter codificati geneticamente.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la visualizzazione diretta degli effetti dell'abbattimento o della sovraespressione genica sulla morfogenesi embrionale.
- Screening: Fornisce letture quantitative di fluorescenza risolte nel tempo, essenziali per confrontare gli effetti di composti o condizioni genetiche.
- Analisi: Genera dati temporali stabili e di alta qualità adatti all'analisi morfometrica e alla quantificazione fenotipica.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati genetici ottenuti in Drosophila a vie conservate, orientando la selezione di bersagli per modelli vertebrati.
- Riutilizzo aziendale: La semplicità e il basso costo del protocollo ne permettono un'ampia adozione tra diversi gruppi di lavoro come metodo standardizzato di preparazione per l'acquisizione di immagini.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva eliminando gli artefatti di compressione e mantenendo le condizioni fisiologiche durante l'acquisizione delle immagini.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso un controllo standardizzato dell'umidità, dello scambio gassoso e della manipolazione degli embrioni.
- Valore strategico: Riduce il rumore biologico nelle campagne di screening, aumentando la sensibilità del saggio e riducendo i tassi di falsi positivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni più affidabili di tipo go/no-go nella validazione degli obiettivi fornendo dati fenotipici di maggiore fedeltà.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione degli embrioni di Drosophila e nelle tecniche di dechorionazione.
- Presuppone l'accesso a oli alogenati e a strumenti di base per la microfabbricazione necessari per la preparazione della camera.
- Necessita della standardizzazione dell'età degli embrioni, del genotipo e della coerenza nel montaggio tra diversi utilizzatori.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere un'ottimizzazione della spinta di galleggiamento dell'olio e della geometria della camera.
- Limite pratico: è più indicato per embrioni che rimangono galleggianti nell'olio alogenato; non applicabile a tipi cellulari più densi o adesivi.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
