Name: La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Impara la preparazione di embrioni di Drosophila per imaging in vivo con il protocollo goccia sospesa. Questo metodo semplice ed economico previene disidratazione e ipossia, garantendo scambi gassosi ottimali per imaging GFP di lunga durata.

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Siamo grati per il sostegno al BHR tramite una sovvenzione Discovery e Strumenti di ricerca e Grant strumento dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC). Riconosciamo inoltre H. Oda e il Centro di Bloomington Drosophila magazzino per la fornitura di scorte genetiche che sono state usate nelle sequenze di immagini dal vivo esempio.

Preparazione <ol><li> Raccogliere embrioni su standard di succo di uva piastre di agar 4. E &#39;conveniente usare un sistema automatizzato Drosophila Egg Collector (flymax scientifico apparecchiature Ltd.). Utilizzando sincrono messo in scena le collezioni embrione ridurrà il numero di dechorionations che devono essere eseguite in modo da ottenere un numero adeguato di embrioni allo stadio di sviluppo desiderato. </li><li> Preparare una diapositiva dechorionation allegando un pezzo di nastro biadesivo ad un vetrino da microscopio, rimuovere il supporto dal nastro. </li><li> Preparare la camera di immagini dal vivo, tagliando un pezzo di tessuto per adattarsi nel pozzo della camera. Posizionare il tessuto nel bene e bagnato con acqua distillata. </li><li> Mix alocarburi olio (Halocarbon Products Corp.) serie 700 viscosità e serie 56 con un rapporto di 1:1. La miscela possono essere memorizzati e utilizzati a tempo indeterminato. </li><li> Luogo diverse piccole gocce di olio alocarburi sulla superficie di un coprioggetto (22 x 40 mm, n. 2). Il volume non è critica, ma dovrebbe essere nell&#39;ordine dei microlitri 20-40. </li></ol> Procedura <ol><li> Con l&#39;aiuto di uno stereomicroscopio, raccogliere gli embrioni dal succo d&#39;uva-agar piastre utilizzando una pinza da gioielliere (n. 5) o un pennello molto fine. Gli embrioni tendono ad attaccarsi l&#39;un l&#39;altro e per le pinze punte &#39;, sono facilmente riuniti in gruppi. </li><li> Con l&#39;aiuto di uno stereomicroscopio, abbassare delicatamente le macchie di embrioni che hanno aderito alle punte della pinza sulla superficie del nastro sul vetrino dechorionation. </li><li> Anche in questo caso con lo stereomicroscopio, delicatamente spingere o ictus gli embrioni con il lato della pinza in modo da rompere il corion esterno ceroso senza rottura della membrana interna vitellina (l&#39;embrione esploderà se la membrana vitellina è rotto). </li><li> Una volta che il corion esterno è stato rotto, stuzzicare l&#39;embrione dal corion, l&#39;embrione dechorionated tende ad aderire alla superficie della pinza. Fare attenzione a non toccare l&#39;embrione dechorionated alla superficie del nastro. </li><li> Non appena un embrione è dechorionated, rapidamente trasferimento alla goccia di olio precedentemente preparato alocarburi sul vetrino. Toccare la punta della pinza portando l&#39;embrione dechorionated alla superficie della goccia di olio alocarburi - questo sloggia l&#39;embrione dal forcipe nell&#39;olio. </li><li> Confermare il trasferimento di un embrione alla goccia di petrolio. Questo può essere fatto a occhio nudo, a condizione che si lavora su uno sfondo nero e utilizzare una fibra ottica fonte di illuminazione fissata a un angolo obliquo. </li><li> Prima di tentare di dechorionate un altro embrione, pulire qualsiasi tipo di olio dalla pinza. Pinza rivestiti in olio hanno meno di acquisto sulla superficie corion, dechorionation rendendo più difficile. </li><li> Dechorionated embrioni sono vivace nell&#39;olio alocarburi. Uso di pinze o un pennello e durante la visualizzazione attraverso uno stereomicroscopio, spingere l&#39;embrione alla parte inferiore della goccia di olio e sistemare nella posizione desiderata. </li><li> Rapidamente invertire il coprioggetto sopra il pozzo della camera di immagini dal vivo. Confermano che gli embrioni sono a riposo contro il vetrino con l&#39;orientamento desiderato. Grazie alla loro galleggiabilità in olio, gli embrioni ora galleggiano sulla superficie inferiore del coprioggetto. Fissare il coprioggetto alla camera di imaging dal vivo con del nastro adesivo. Ventilare la camera da taglio buchi nel nastro nella zona in cui il nastro si estende il divario tra la fine del vetrino e la fine del pozzo della camera di immagini dal vivo. </li><li> Un microscopio a fluorescenza in posizione verticale o uno stereomicroscopio a fluorescenza possono ora essere utilizzati per l&#39;immagine degli embrioni. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Descriviamo un nuovo metodo di preparazione di embrioni di Drosophila per l&#39;analisi di immagini dal vivo, che noi chiamiamo il protocollo goccia. Purtroppo, non è possibile utilizzare il protocollo goccia se si lavora con un microscopio invertito. In questo caso la tecnica del sandwich (come descritto nel già astratto) deve essere utilizzato e la compressione degli embrioni rimane una preoccupazione. Negli esperimenti in cui vengono misurate la forma delle cellule e dimensione al fine di...

Dotazione di serie e materiali necessari per la preparazione di embrioni per la live-immagine che utilizzano il protocollo goccia comprendono le seguenti voci: vetrini da microscopio, coprioggetto (22 x 40 mm, n. 2), nastro biadesivo, gioiellerie forcipe (Dumont stile n. 5 ), alocarburi olio serie 56 e serie 700 (Halocarbon Products Corp.), un taglierino o singola lama di rasoio bordo, carta velina, forbici, acqua distillata, nastro scopo generale, e una pipetta adatta per la consegna di microlitri 20-40. Il protocollo di imaging dal vivo richiede anche una misura da camera dal vivo imaging. Si prepara il taglio di 5 mm pensare foglio di plastica in policarbonato alle dimensioni di un vetrino da microscopio standard (75 x 25 mm) e l&#39;utilizzo di un rotore per creare una depressione 3 millimetri nel profondo della diapositiva (20 X 55 mm). L&#39;accesso a uno stereomicroscopio (dissezione microscopio) e una fibra ottica fonte di illuminazione è anche necessario.

la preparazione di drosophila gli embrioni per live-imaging utilizzando il protocollo goccia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Proteina fluorescente verde (GFP)-base timelapse live-imaging è una tecnica potente per lo studio della regolazione genetica dei processi dinamici come la morfogenesi dei tessuti, l&#39;adesione cellula-cellula, o morte cellulare. Embrioni di Drosophila che esprimono GFP sono prontamente ripreso utilizzando la microscopia confocale o stereoscopica. Un obiettivo di vivere-imaging protocollo è quello di minimizzare gli effetti dannosi, come la disidratazione e ipossia. Precedenti protocolli per la preparazione di embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi hanno coinvolto messa embrioni dechorionated in olio alocarburi e sandwich di loro tra un alocarburi gas-permeabile membrana e un coprioggetto<sup&gt; 1-3</sup&gt;. L&#39;introduzione di compressione attraverso embrioni di montaggio in questo modo rappresenta una complicazione indesiderabile per qualsiasi analisi basata biomeccanica della morfogenesi. Il nostro metodo, che noi chiamiamo il protocollo goccia, i risultati ottimi della redditività degli embrioni durante immagini dal vivo e non richiede che gli embrioni da comprimere. In breve, il protocollo goccia comporta il posizionamento di embrioni in una goccia di olio Halocarbon che è sospeso da un coprioggetti, che è, a sua volta, fissa all&#39;altezza desiderata in una camera umida. Oltre a fornire lo scambio di gas e prevenire la disidratazione, tale sistema sfrutta la galleggiabilità di embrioni in olio Halocarbon per evitare che finiscano fuori posizione durante l&#39;acquisizione Timelapse. Questo video descrive in dettaglio come raccogliere e preparare gli embrioni di Drosophila per l&#39;imaging dal vivo utilizzando il protocollo goccia. Questo protocollo è adatto per gli embrioni di imaging dechorionated utilizzando stereomicroscopia o verticale microscopio a fluorescenza composto.

Un metodo semplice, economico ed efficace per preparare gli embrioni di Drosophila per il live-imaging analisi è presentato. Il nostro protocollo prevede l&#39;umidità e lo scambio di gas e non comprimere l&#39;embrione di Drosophila. Questo metodo è adatto per GFP-based di immagini dal vivo di embrioni di Drosophila utilizzando uno stereomicroscopio o microscopio composto verticale.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

L'imaging live in timelapse basato sulla proteina fluorescente verde (GFP) è una tecnica potente per studiare la regolazione genetica di processi dinamici quali...

Ciao. Mi chiamo Bruce Reed. Sono professore assistente presso il Dipartimento di Biologia dell'Università di Waterloo a Waterloo, in Ontario, Canada. Oggi stiamo realizzando questo archivio video per documentare una nuova tecnica da noi sviluppata per il preparare embrioni di Drosophila per l'analisi mediante imaging vitale.Durante l'analisi di imaging in tempo reale utilizzando embrioni di drosophila, impieghiamo frequentemente acquisizioni con lapse temporale, che possono durare diverse ore. È quindi fondamentale disporre di una tecnica in cui gli embrioni siano protetti sia dalla disidratazione che dall'ipossia. Inoltre, desideriamo sviluppare una tecnica che eviti qualsiasi compressione dell'embrione.Nell'allestimento, abbiamo sviluppato un metodo molto semplice, economico ed efficace che chiamiamo preparazione a goccia sospesa. La preparazione a goccia sospesa è adatta per l'analisi in tempo reale di embrioni mediante microscopia stereoscopica o qualsiasi microscopio composto eretto. Questo filmato in time-lapse mostra otto embrioni esprimenti GFP preparati utilizzando il protocollo della goccia sospesa e analizzati mediante microscopia a fluorescenza in time-lapse.Questa sequ

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Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

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Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l&#39;imaging dal vivo

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

Questo video descrive come eseguire microiniezioni che rilasciano reagenti in embrioni vivi di Drosophila. I ricercatori possono utilizzare questo metodo per introdurre composti esogeni come acidi nucleici e proteine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale. Il protocollo presentato dimostra come impostare ed eseguire la procedura per l'iniezione di qualsiasi reagente solubile, in questo caso una proteina fluorescente per esperimenti di imaging dal vivo.

Microiniezione di embrioni vivi di Drosophila: consegna precoce dei reagenti all'embrione in via di sviluppo

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Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

Questo protocollo presenta un metodo efficiente per l'imaging del neuroepitelio dell'occhio pupale di Drosophila. Questo metodo compensa il movimento dei tessuti e la topologia irregolare, migliora la visualizzazione dei confini cellulari attraverso l'uso di più proteine di giunzione marcate con GFP e utilizza un impianto di imaging facilmente assemblabile.

Live-imaging del Drosophila Pupa Eye

Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è lo strumento più prezioso nella biologia dello sviluppo. Uno dei principali problemi degli studi comparativi è la varianza ambientale. Il nostro protocollo descrive un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo di più campioni e, pertanto, affronta questo problema in modo pro-attivo.

Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Impara la preparazione di embrioni di Drosophila per imaging in vivo con il protocollo goccia sospesa. Questo metodo semplice ed economico previene disidratazione e ipossia, garantendo scambi gassosi ottimali per imaging GFP di lunga durata.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

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