Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae
March 2nd, 2009
GFP-fusion proteine sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.
Questa procedura inizia con la preparazione di un array di un CP un GFP facendo prima crescere una linea di cellule e poi fissando l'array su una nuova piastra. Allo stesso tempo, prepara una nuova copia del DMA. Successivamente accoppiamo l'array ACP one GFP al DMA e selezioniamo i diploidi, che vengono poi sporulati sui mezzi di sporulazione.
Cinque giorni dopo, la progenie miotica viene germinata su terreni LRK, sui quali crescerà solo l'haplos MAT A. Attraverso due ulteriori cicli di selezione, recuperiamo le cellule aplo che trasportano sia ACP, una GFP che un gene eliminato sulla micina can. Infine, possiamo prelevare i singoli ceppi direttamente dalla piastra e osservare la morfologia dei mitocondri mediante microscopia confocale.
Ciao, sono il capitano T del Law Lab del Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo dell'Istituto di Scienze della Vita dell'Università della British Columbia. Ciao, sono Jesse Chao, anche lui del Loan Lab. Oggi vi mostreremo un metodo ad alto rendimento per incorporare marcatori GFP in vari background mutanti nel lievito utilizzando un sistema robotico.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la morfologia di organelli come D, reticolo endoplasmatico e mitocondri. Quindi iniziamo. Per questo protocollo, utilizziamo due diversi ceppi di lievito.
Una GFP CP one è un ceppo con una marcatura GFP C terminale di ACP one, che è generata dalla ricombinazione omologa mediata da A PCR utilizzando il plasmide PKT 1 28. Il fondo della varietà è BY 7 0 4 3. Utilizziamo anche il ceppo DMA o l'array mutante di delezione, che è un array di circa 5.000 mutanti di delezione di geni non essenziali.
Tutti questi geni non essenziali sono stati eliminati su G 4 18. Il fondo di deformazione dell'array è BY 47 41. Per iniziare a far crescere Alan di cellule GFP ACP one versando cinque millilitri di coltura GFP ACP one overnight su una piastra sibilante.
Lasciare asciugare sufficientemente la piastra a fiamma o in una cappa biologica. Una volta asciutta, incubare la piastra a 30 gradi Celsius per una notte. Dopo l'incubazione, utilizzare un robot per disporre il ceppo A CP one GFP in 1.536 colonie per piastra.
Allo stesso tempo, preparare una nuova copia del DMA fissandola con una replica su YPDG quattro piastre da 18. Successivamente, incubare le piastre a 30 gradi Celsius per una notte dopo che i ceppi sono cresciuti. Ha realizzato il ceppo A CP one GFP con il DMA replicando il pinning e sovrapponendo le colonie su piastre YPD, incubando le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte.
Dopo l'incubazione della piastra replica, le colonie sotto SD sibilano G quattro piastre da 18 al fine di selezionare le cellule dispiegate, incubano le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte. Per iniziare la sporulazione e la germinazione della prima piastra di replica, i diploidi su YPDG quattro piastre da 18 per aumentare l'efficienza della sporulazione nella fase successiva. Dopo l'incubazione a 30 gradi Celsius per una piastra di replica di un giorno, i diploidi su un terreno di sporulazione potenziato, che contiene livelli ridotti di fonti di carbonio e azoto per indurre la formazione di spore miotiche.
Successivamente, incubare le piastre a 25 gradi Celsius per un minimo di cinque giorni. Dopo l'incubazione germinare il tappetino, una progenie miotica replicando le colonie su terreni di LRK. Questo terreno indurrà la germinazione di cellule tabloid dalle spore, incuberà le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni al fine di selezionare le cellule che trasportano sia l'allele GFP che il singolo allele mutante.
Le cellule Matt A sono replicate placcate sotto il terreno lade G four 18, che seleziona per le cellule aplo che portano la delezione genica, incubano queste piastre a 30 gradi Celsius durante la notte. La prossima piastra di replica, il tappetino, una progenie miotica su L-H-R-K-G quattro 18 terreni da selezionare per la crescita di singoli mutanti. Questo ospita anche ACP un incubato GFP durante la notte a 30 gradi Celsius.
Le piastre possono quindi essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Per visualizzare i mutanti desiderati che esprimono un CP una GFP direttamente dalla piastra, iniziare prelevando le colonie desiderate dalle piastre. Far crescere le cellule a 30 gradi Celsius e i mezzi sibilanti YPD o SD fino alla fase logaritmica iniziale.
Infine, visualizzare un mutante utilizzando la microscopia confocale con il filtro GFP impostato in questa immagine confocale, un mutante e un wild type con il marcatore GFP ACP one sono stati visualizzati mediante microscopia confocale per studiare la morfologia dei mitocondri. Questo particolare mutante presenta un fenotipo mitocondriale alterato ed è quindi un buon candidato per ulteriori indagini. Dobbiamo avervi mostrato come incorporare in modo efficiente un marcatore multiclonale, un CP one GFP nell'array di mutanti di delezione utilizzando un sistema robotico.
Quando si esegue questa procedura, è importante preparare il supporto fresco e lasciare che il luogo abbia il tempo sufficiente per asciugarsi. Se ci sono troppo umidità, si accumulerà condensa aumentando la possibilità di contaminazione. Inoltre, è necessario verificare che tutti i supporti di selezione siano stati eseguiti correttamente perché sono fondamentali per questo protocollo.
Questa procedura può essere utilizzata anche per altri tipi di marcatori. Ad esempio, per visualizzare er, utilizziamo abitualmente il marcatore air 11 e GSP. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per incorporare marcatori organellari-GFP in quasi 5.000 geni non essenziali nei lieviti, semplificando il processo di visualizzazione della morfologia degli organelli. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono esaminare efficacemente le mutazioni che influenzano la struttura degli organelli.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- Le proteine di fusione GFP sono strumenti essenziali per visualizzare le strutture cellulari.
- I metodi tradizionali per lo screening delle mutazioni sono laboriosi.
- Il lievito serve come organismo modello per gli studi genetici.
- La microscopia confocale consente un'imaging dettagliata degli organelli.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'incorporazione simultanea di marcatori organellari.
- Facilitare lo screening delle mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli.
- Migliorare l'efficienza degli studi genetici nel lievito.
Metodi utilizzati
- Preparazione di un array GFP CP one da cellule coltivate.
- Accoppiamento dell'array GFP con un DMA per selezionare i diploidi.
- Sporulazione dei diploidi su un terreno specifico.
- Osservazione della morfologia mitocondriale mediante microscopia confocale.
Risultati principali
- Incorporazione con successo dei marcatori organellari-GFP nei geni del lievito.
- Recupero efficiente di cellule aploidi con le modifiche genetiche desiderate.
- Visualizzazione della morfologia degli organelli mediante microscopia confocale.
- Processo semplificato per lo screening delle mutazioni genetiche.
Conclusioni
- Il metodo riduce significativamente il tempo richiesto per lo screening genetico.
- Fornisce un quadro robusto per studiare la funzione degli organelli.
- Questo approccio può essere applicato a vari studi genetici nel lievito.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This high-throughput yeast organelle morphology method enables systematic interrogation of gene function in organelle biogenesis, supporting target validation in early discovery. By integrating robotic array handling with dual-marker selection, it delivers scalable, reproducible phenotypic data for mechanistic de-risking of genetic hits. The approach accelerates pathway mapping and prioritization of targets affecting mitochondrial or ER function in preclinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables genome-wide assessment of gene deletions on mitochondrial morphology to validate targets involved in organelle inheritance.
- Operational Value: Uses robotic pinning to process 4,672 mutants efficiently, reducing manual labor and increasing throughput.
- Predictive Value: Identifies genetic modifiers of organelle structure to de-risk targets early in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable organelle morphology readouts via confocal microscopy for assay standardization.
- Operational Value: Produces homozygous deletion strains with integrated GFP markers, ensuring consistent reporter expression across the array.
- Assay Readiness: Delivers arrayed haploid mutants ready for compound screening or genetic interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links yeast organelle phenotypes to conserved pathways relevant to human disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene function in organelle biogenesis to support target selection for preclinical validation.
- Pathway Elucidation: Maps genetic networks governing mitochondrial dynamics to inform mechanism-based compound screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification by providing organelle morphology data that informs target confidence and pathway relevance before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in organelle formation through systematic morphological profiling.
- Screening: Enables reproducible, array-based organelle imaging for high-content screening of genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Delivers imaging-based phenotypic readouts that allow comparison of mutant conditions to wild-type controls.
- Translational Research: Connects yeast organelle defects to conserved cellular processes with potential relevance to preclinical disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for organelle-wide phenotypic screening across multiple GFP-tagged markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by linking genotype to organelle phenotype at scale.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized robotic handling and dual-selection workflow.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel evaluation of thousands of genetic backgrounds.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted target prioritization based on organelle morphology phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, mating, sporulation, and fluorescent microscopy.
- Depends on robotic pinning systems and controlled incubation environments for array handling.
- Necessitates standardized media preparation and selection protocols to avoid contamination and ensure mutant recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different organelle markers (e.g., ER vs. mitochondria).
- Limited to non-essential gene backgrounds; essential genes require alternative approaches such as conditional alleles or CRISPRi.
