Name: Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri un metodo high-throughput per studiare la morfologia globale degli organelli in Saccharomyces cerevisiae. Questa tecnica consente di incorporare marcatori GFP in quasi 5.000 geni non essenziali, facilitando lo screening di mutazioni che influenzano la struttura cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (sovvenzione 31/C15982), il Canadian Institutes of Health Research, la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo, la Michael Smith Fondazione per la Ricerca sulla Salute (sovvenzione per CJR Loewen), e lotta per la vista.

Materiali e metodi: <ol><li> Ceppi di lievito: <ul><li> Acp1-GFP (GFP:: Il suo): C-terminale GFP-tagging delle Acp1 è stato generato da una PCR-mediata mediante ricombinazione omologa pKT128 plasmide (GFP e contiene HIS5). Trasformanti positivi sono stati confermati mediante microscopia confocale e colonia PCR. Lo sfondo ceppo è stato BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) da Boone laboratorio (Tong e Boone, 2006). </li><li> Cancellazione Array Mutant (DMA) (xxx:: KanR): si tratta di una serie di circa 5.000 mutanti di delezione di geni non essenziali. Tutti questi geni non essenziali sono stati eliminati il ​​G418. Lo sfondo deformazione della matrice è BY4741 (Mata his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Il nostro DMA era originario di Boone laboratorio. </li></ul></li><li> Incorporando Acp1-GFP nel DMA: Il protocollo seguito per fare una serie GFP è adattato dal Analisi sintetica genetica (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) con modifiche. Tutti i passaggi pinning replica sono fatte utilizzando un rotore Singer ad alta densità arraying sistema robotico. In alternativa, manuale pinning o una base liquida ad alta densità di robot arraying possono essere utilizzati. Acronimi: YPD, estratto-peptone-destrosio lievito, SD, di abbandono di sintesi; LRK, Lue / Arg / Lys abbandono dei media; LHRK, Lue / suo / Arg / Lys abbandono dei media Preparazione <ol><li> Crescere un prato di Acp1-GFP cellule versando a 5 ml di notte Acp1-GFP cultura su un piatto YPD. Lasciare seccare la lastra a sufficienza da una fiamma o in una cappa aspirante biologico. </li><li> Incubare la piastra a 30 ˚ C durante la notte. </li><li> Uso di un array di robot Acp1-GFP versare nel 1536 colonie per piastra. Allo stesso tempo, preparare una nuova copia del DMA replica da appuntare al YPD + piastre G418. </li><li> Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte. Accoppiamento e selezione diploide </li><li> I-Mate Acp1 GFP ceppo con la DMA di replica pinning e oltre-che le colonie su piastre YPD. </li><li> Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte. </li><li> Replica piastra le colonie su SD - I suoi piatti G418 + per selezionare le cellule diploidi (Mata / MATalpha). </li><li> Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte. Sporulationg e germinazione </li><li> Replica piastra le colonie diploide su supporti sporulazione maggiore, che contiene livelli ridotti di fonti di carbonio e di azoto per indurre la formazione di spore meiotico. </li><li> Incubare le piastre a 25 ˚ C per un minimo di 5 giorni. </li><li> Germinare la progenie MATA meiotico di replica-plating le colonie su LRK media e incubare le piastre a 30 ˚ C per due giorni. </li><li> Questo supporto sarà indurre la germinazione delle cellule aploidi dalle spore. Dal momento che un LUE2 quadro di lettura di apertura (ORF) è integrato al MATA specifico promotore STE2, tutti i haploids germinato sarà Mata. Selezione di entrambi gli alleli </li><li> Ora è necessario selezionare sia l&#39;allele GFP e il singolo allele mutante. Per fare questo, le cellule sono MATA replica placcata su LRK + G418 media, che sceglie di cellule aploidi che portano la delezione del gene (xxx:: kanR). </li><li> Incubare le piastre a 30 ˚ C durante la notte. </li><li> Infine, la progenie MATA meiotico sono placcati in replica su LHRK + G418 Media per selezionare per la crescita dei singoli mutanti (xxx:: kanR) anche ospitare Acp1-GFP (GFP:: Il suo). Queste placche possono essere conservati a 4 ˚ C per un massimo di 3 mesi. </li></ol> Il protocollo seguito per fare una serie GFP è adattato dal Analisi sintetica genetica (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) con modifiche. Tutti i passaggi pinning replica sono fatte utilizzando un rotore Singer ad alta densità arraying sistema robotico. In alternativa, manuale pinning o una base liquida ad alta densità di robot arraying possono essere utilizzati. Acronimi: YPD, estratto-peptone-destrosio lievito, SD, di abbandono di sintesi; LRK, Lue / Arg / Lys abbandono dei media; LHRK, Lue / suo / Arg / Lys abbandono dei media Preparazione </li><li> Microscopia: <ol><li> Scegli il desiderato mutante (s) che esprime Acp1-GFP direttamente dal piatto. </li><li> Crescere le cellule a 30 ° C in YPD o SD - I suoi mezzi di accedere alla fase precoce. </li><li> Visualizzare al microscopio confocale utilizzando il filterset GFP. Un esempio di risultato atteso è illustrato nella Figura 1. </li></ol></li></ol> SGA media: I media di crescita (YPD) e dei media la selezione (SD) utilizzato in questo protocollo è utilizzato di routine nella biologia molecolare del lievito. Si prega di fare riferimento al metodo di lievito (Amberg et al., 2005) per le descrizioni dettagliate. LRK, LHRK media (per 400 ml totali) <table border="0"><tbody><tr><td> Aggiungi al fine </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Lievito base azotata con solfato di ammonio </td><td> 2,7 g </td></tr><tr><td> Aminoacidomescolare </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> 20% di destrosio </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Raffreddare a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanina </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare, versare 50 ml per piastra </td></tr></tbody></table> LRK, LHRK + G418 media (per 400 ml totali) <table border="0"><tbody><tr><td> Aggiungi al fine </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Lievito base azotata senza solfato di ammonio </td><td> 0,7 g </td></tr><tr><td> Acido mix di aminoacidi </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Glutammato monosodico </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> 20% di destrosio </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Raffreddare a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanina </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml di G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare, versare 50 ml per piastra </td></tr></tbody></table> Arricchito sporulazione media (per 400 ml totali) <table border="0"><tbody><tr><td> Aggiungi al fine </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Acetato di potassio </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> Estratto di lievito </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Sporulazione mix di aminoacidi </td><td> 0,04 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Raffreddare a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 mg / ml di G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare, versare 50 ml per piastra </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Questo metodo può aiutare in modo efficiente incorporare un marcatore mitocondriale, Acp1-GFP in vari contesti mutante. Essa si basa sull&#39;utilizzo di un sistema robotico, e può essere facilmente adottata per l&#39;utilizzo con qualsiasi sistema robotico. Questa procedura può essere utilizzata anche per l&#39;integrazione di altri tipi di marcatori. Ad esempio, per visualizzare ER, si usano abitualmente il marcatore Erg11-GFP. Nelle nostre immagini rappresentative, un mutante e un tipo selvaggio con la Acp1 GFP-creat...

<table><tbody><tr><td>Mezzi SGA</td><td></td><td></td><td>I mezzi di crescita (YPD) e i mezzi sintetici di dropout (SD), inclusi LRK e LHRK, e il mezzo arricchito per la sporulazione utilizzati in questo protocollo sono comunemente impiegati nella biologia molecolare del lievito. Per descrizioni dettagliate, consultare Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).</td></tr></tbody></table>

un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in s. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput metodi per esaminare la localizzazione di proteine ​​o morfologia organello è uno strumento efficace per studiare le interazioni delle proteine ​​e può aiutare a raggiungere una comprensione completa delle vie molecolari. In Saccharomyces cerevisiae, con lo sviluppo del non essenziali serie gene cancellazione, siamo in grado di studiare a livello globale la morfologia degli organelli diversi, come il reticolo endoplasmatico (ER) e la GFP mitocondri utilizzando (o variante)-marcatori in geni diversi contesti. Tuttavia, i marcatori GFP incorporando in ogni singolo mutante è individualmente un lavoro processo ad alta intensità. Qui, descriviamo una procedura che viene normalmente utilizzato nel nostro laboratorio. Utilizzando un sistema robotico per gestire array ad alta densità di lievito e le tecniche di selezione dei farmaci, siamo in grado di ridurre significativamente il tempo richiesto e migliorare la riproducibilità. In sintesi, attraversiamo un GFP-tagged marcatore mitocondriale (Apc1-GFP) ad un alta densità serie di 4.672 mutanti delezione del gene non essenziale dalla robotica replica pinning. Attraverso la selezione diploide, sporulazione, germinazione e la selezione marcatore duale, abbiamo recuperare entrambi gli alleli. Come risultato, ogni mutante aploide singolo contiene Apc1-GFP incorporato al suo locus genomico. Ora, possiamo studiare la morfologia dei mitocondri in tutti i non essenziali sfondo mutante. Utilizzando questo approccio high-throughput, possiamo comodamente studiare e delineare i percorsi e geni coinvolti nella eredità e la formazione di organelli in un genoma impostazione.

GFP-fusion proteine ​​sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

I metodi ad alto rendimento per esaminare la localizzazione proteica o la morfologia degli organelli rappresentano uno strumento efficace per studiare le interazioni proteiche e possono aiutare a...

Questa procedura inizia con la preparazione di un array di un CP one GFP, coltivando prima una linea di cellule e successivamente trasferendo l'array su una piastra fresca. Allo stesso tempo, preparare una copia fresca di DMA. Successivamente, si incrociano l'array ACP one GFP con il DMA e si selezionano i diploidi, che vengono poi sporulati su terreno di sporulazione.Cinque giorni dopo, la progenie Myotic viene germinata su terreno LRK, sul quale solo gli aploidi MAT A saranno in grado di crescere. Attraverso ulteriori due cicli di selezione, recuperiamo cellule aploidi che portano sia ACP uno GFP sia un gene knockout sulla canamicina. Infine, possiamo isolare ceppi individuali direttamente dalla piastra e osservare la morfologia dei mitocondri mediante microscopia confocale.Ciao, sono Chap T del Laboratorio Law del Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo presso l'Istituto di Scienze della Vita dell'Università della British Columbia. Ciao, sono Jesse Chao, anch'io del Laboratorio Loan. Oggi vi mostreremo un metodo ad alto rendimento per l'inserimento di marcatori GFP in diversi ceppi mutanti di lievito, utilizzando un sistema robotico.Utilizziamo questa procedura nel n

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Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari...

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Un valido approccio per monitorare la fornitura dei organelli al lume acida del vacuolo lievito per il degrado e il riciclaggio è descritto. Il metodo si basa sulla etichettatura specifica di organelli bersaglio geneticamente codificato con un dual-emissione di fluorescenza pH biosensore, e la visualizzazione delle singole cellule mediante microscopia a fluorescenza.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

Microscopia 4D del lievito

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

I fenotipi di crescita del lievito sono misurati con precisione attraverso l'imaging time-lapse altamente parallelo di cellule immobilizzate che crescono in microcolonie. Allo stesso tempo, la tolleranza allo stress, l'espressione proteica e la localizzazione delle proteine possono essere monitorate, generando set di dati integrati per studiare come le differenze ambientali e genetiche, così come l'eterogeneità gene-espressione tra le cellule isogeniche, modulano la crescita.

Imaging live ad alta produttività di microcolonie per misurare l'eterogeneità nella crescita e nell'espressione genica

Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Scopri un metodo high-throughput per studiare la morfologia globale degli organelli in Saccharomyces cerevisiae. Questa tecnica consente di incorporare marcatori GFP in quasi 5.000 geni non essenziali, facilitando lo screening di mutazioni che influenzano la struttura cellulare.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

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