Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae
2 marzo 2009
GFP-fusion proteine sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.
Questa procedura inizia con la preparazione di un array di un CP one GFP, coltivando prima una linea di cellule e successivamente trasferendo l'array su una piastra fresca. Allo stesso tempo, preparare una copia fresca di DMA. Successivamente, si incrociano l'array ACP one GFP con il DMA e si selezionano i diploidi, che vengono poi sporulati su terreno di sporulazione.
Cinque giorni dopo, la progenie Myotic viene germinata su terreno LRK, sul quale solo gli aploidi MAT A saranno in grado di crescere. Attraverso ulteriori due cicli di selezione, recuperiamo cellule aploidi che portano sia ACP uno GFP sia un gene knockout sulla canamicina. Infine, possiamo isolare ceppi individuali direttamente dalla piastra e osservare la morfologia dei mitocondri mediante microscopia confocale.
Ciao, sono Chap T del Laboratorio Law del Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo presso l'Istituto di Scienze della Vita dell'Università della British Columbia. Ciao, sono Jesse Chao, anch'io del Laboratorio Loan. Oggi vi mostreremo un metodo ad alto rendimento per l'inserimento di marcatori GFP in diversi ceppi mutanti di lievito, utilizzando un sistema robotico.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la morfologia di organelli come D, reticolo endoplasmico e mitocondri. Cominciamo dunque. Per questo protocollo, utilizziamo due ceppi di lievito diversi.
Un CP one GFP è un ceppo con una marcatura GFP al C-terminale di ACP one, generato mediante ricombinazione omologa mediata da PCR utilizzando il plasmide PKT 1 28. L'background del ceppo è BY 7 0 4 3. Utilizziamo inoltre il ceppo DMA o array di mutanti per delezione, che consiste in un array di circa 5.000 mutanti per delezione di geni non essenziali.
Tutti questi geni non essenziali sono stati eliminati su G quattro 18. L'ceppo di partenza dell'array è BY 47 41. Per iniziare, coltivare colonie di cellule ACP one GFP seminando cinque millilitri di coltura ACP one GFP da incubazione notturna su una piastra con hiss.
Lasciare asciugare sufficientemente la piastra mediante fiamma o in una cappa biologica. Una volta asciutta, incubare la piastra a 30 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo l'incubazione, utilizzare un robot per distribuire il ceppo A CP one GFP in 1.536 colonie per piastra.
Nello stesso momento, preparare una copia fresca del DMA effettuando il replica pinning su quattro piastre YPDG 18. Successivamente, incubare le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte dopo che i ceppi sono cresciuti. Ottenere un ceppo A CP one GFP con il DMA mediante replica pinning e sovrapponendo le colonie su piastre YPD, quindi incubare le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte.
Dopo l'incubazione della piastra di replica, le colonie sulle piastre SD hiss G quattro 18 vengono selezionate per isolare le cellule trasformate; incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tutta la notte. Per avviare la sporulazione e la germinazione sulla prima piastra di replica, trasferire i diploidi su piastre YPDG quattro 18 per aumentare l'efficienza della sporulazione nel passaggio successivo. Dopo aver incubato a 30 gradi Celsius per un giorno, effettuare una replica dei diploidi su terreno di sporulazione migliorato, che contiene livelli ridotti di fonti di carbonio e azoto per indurre la formazione di spore meiotiche.
Successivamente, incubare le piastre a 25 gradi Celsius per un minimo di cinque giorni. Dopo l'incubazione, far germinare il mat, una progenie mitotica, tramite replica plating delle colonie su terreno LRK. Questo terreno indurrà la germinazione delle cellule tabuloidi dalle spore; incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni al fine di selezionare le cellule portatrici sia dell'allele GFP sia dell'allele mutante singolo.
Le cellule Matt A vengono replica placcate su mezzo Lade G quattro 18, che seleziona le cellule aploidi portatrici della delezione genica, e si incubano le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, si replica la piastra con la progenie mitotica di mat a su mezzo L-H-R-K-G quattro 18 per selezionare la crescita di mutanti singoli che contengono anche ACP uno GFP, e si incuba durante la notte a 30 gradi Celsius.
Le piastre possono quindi essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Per visualizzare i mutanti desiderati che esprimono una CP-GFP direttamente dalla piastra, iniziare prelevando le colonie desiderate dalle piastre. Far crescere le cellule a 30 gradi Celsius in terreno YPD o SD hiss fino alla fase esponenziale iniziale.
Infine, visualizzare i mutanti utilizzando la microscopia confocale con il filtro GFP: in questa immagine confocale, un mutante e un tipo selvatico contenenti il marcatore ACP1-GFP sono stati analizzati mediante microscopia confocale per studiare la morfologia mitocondriale. Questo particolare mutante mostra un fenotipo mitocondriale alterato ed è pertanto un buon candidato per ulteriori indagini. Abbiamo dimostrato come incorporare in modo efficiente un marcatore multiclonale, l'ACP1-GFP, nell'array di mutanti di delezione utilizzando un sistema robotico.
Quando si esegue questa procedura, è importante preparare frescamente il terreno e lasciare che il posto abbia tempo sufficiente per asciugarsi. Se è troppo umido, si formerà della condensa, aumentando il rischio di contaminazione. Inoltre, è necessario verificare attentamente che tutti i terreni selettivi siano stati preparati correttamente, poiché sono fondamentali per questo protocollo.
Questa procedura può essere utilizzata anche per altri tipi di marcatori. Ad esempio, per visualizzare er, utilizziamo abitualmente il marcatore air 11 e GSP. È tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per l'inserimento di marcatori GFP per organelli in circa 5.000 geni non essenziali nel lievito, semplificando il processo di visualizzazione della morfologia degli organelli. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono esaminare in modo efficiente le mutazioni che influenzano la struttura degli organelli.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica
Sfondo
- Le proteine di fusione GFP sono strumenti essenziali per la visualizzazione delle strutture cellulari.
- I metodi tradizionali per lo screening delle mutazioni sono laboriosi.
- Il lievito è un organismo modello per studi genetici.
- La microscopia confocale permette un'analisi dettagliata degli organelli.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'incorporazione simultanea di marcatori degli organelli.
- Facilitare lo screening di mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli.
- Potenziare l'efficienza degli studi genetici nel lievito.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un array CP one GFP da cellule in coltura.
- Incrocio dell'array GFP con un DMA per selezionare i diploidi.
- Sporulazione dei diploidi su terreni specifici.
- Osservazione della morfologia mitocondriale mediante microscopia confocale.
Risultati principali
- Incorporazione riuscita di marcatori organellari-GFP nei geni del lievito.
- Recupero efficiente di cellule aploidi con modifiche genetiche desiderate.
- Visualizzazione della morfologia degli organelli mediante microscopia confocale.
- Procedura semplificata per lo screening di mutazioni genetiche.
Conclusioni
- Il metodo riduce in modo significativo il tempo necessario per lo screening genetico.
- Fornisce un framework robusto per lo studio della funzione degli organelli.
- Questo approccio può essere applicato a vari studi genetici nel lievito.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo ad alto rendimento per la morfologia degli organelli del lievito consente un'analisi sistematica della funzione genica nella biogenesi degli organelli, supportando la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta. Integrando la manipolazione robotizzata di matrici con una selezione a doppio marcatore, fornisce dati fenotipici scalabili e riproducibili per la riduzione del rischio meccanicistico dei risultati genetici. L'approccio accelera la mappatura dei percorsi e la priorizzazione degli obiettivi che influenzano la funzione mitocondriale o del reticolo endoplasmatico nei programmi preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la valutazione su scala genomica delle delezioni geniche sulla morfologia mitocondriale per convalidare bersagli coinvolti nell'ereditarietà degli organelli.
- Valore operativo: Utilizza il pinning robotizzato per processare in modo efficiente 4.672 mutanti, riducendo il lavoro manuale e aumentando la produttività.
- Valore predittivo: Identifica modificatori genetici della struttura degli organelli per ridurre i rischi associati ai bersagli nelle fasi iniziali del processo di scoperta.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera parametri quantificabili della morfologia degli organelli mediante microscopia confocale, per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Produce ceppi con delezioni omozigoti e marcatori GFP integrati, garantendo un'espressione costante del reporter nell'intero array.
- Prontezza del saggio: Fornisce mutanti aploidi in array pronti per lo screening di composti o la mappatura di interazioni genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega i fenotipi degli organelli del lievito a vie conservate rilevanti per i modelli di malattie umane.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce la funzione genica nella biogenesi degli organelli per supportare la selezione di target nella validazione preclinica.
- Chiarimento delle vie: Mappa le reti genetiche che regolano la dinamica mitocondriale per informare lo screening di composti basato sui meccanismi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta fino all'identificazione del capostazione, fornendo dati sulla morfologia degli organelli che informano sulla fiducia nel bersaglio e sulla rilevanza del percorso prima dello screening dei composti.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione genica nella formazione degli organelli attraverso un profilo morfologico sistematico.
- Screening: Permette l’imaging di organelli basato su matrice, riproducibile, per lo screening ad alto contenuto di perturbazioni genetiche o chimiche.
- Analisi: Fornisce letture fenotipiche basate sull’imaging che consentono il confronto tra condizioni mutanti e controlli di tipo selvatico.
- Ricerca Translazionale: Collega i difetti degli organelli nel lievito a processi cellulari conservati, con possibili implicazioni per modelli preclinici di malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening fenotipico su scala di organelli, mediante diversi marcatori marcati con GFP.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi collegando genotipo a fenotipo organellare su larga scala.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso un trattamento robotizzato standardizzato e un flusso di lavoro a doppia selezione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la valutazione parallela di migliaia di contesti genetici.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione degli obiettivi corretta per il rischio in base ai fenotipi di morfologia organellare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica del lievito, accoppiamento, sporulazione e microscopia fluorescente.
- Si basa su sistemi robotici di trasferimento con puntine e su ambienti di incubazione controllati per la manipolazione delle matrici.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione dei mezzi di coltura e per la selezione, al fine di evitare contaminazioni e garantire il recupero dei mutanti.
- Richiede considerazioni adattative quando si applica il metodo a marcatori di diversi organelli (ad esempio, reticolo endoplasmatico vs. mitocondri).
- Limitato a ceppi con geni non essenziali; per i geni essenziali sono necessarie approcci alternativi, come alleli condizionali o CRISPRi.
