Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione
25 marzo 2009
Montare tutto ibridazione in situ è una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.
Questa procedura ci permette di determinare i modelli di espressione genica negli embrioni di pesce zebra ad alta risoluzione; una sonda ribo antisenso viene ibridata all'mRNA bersaglio complementare. La sonda Ribo marcata è riconosciuta da un anticorpo coniugato a un enzima perossidasi a cui è aggiunto un fluoro quattro coniugato aramide negli embrioni, e la perossidasi converte l'IDE in un composto altamente reattivo. Ciò porta al deposito stabile del fluoro quattro; l'IDE non legato viene eliminato con lavaggi, rivelando il dettagliato modello subcellulare di distribuzione dell'mRNA.
L'espressione di un secondo gene può essere osservata utilizzando una sonda marcatore distinta e un diverso fluorocromo, consentendo un confronto dettagliato dell'espressione. Ciao, sono Tim Brent del laboratorio di Scott Holly del Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo dell'Università di Yale. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'ibridazione fluorescente in situ doppia ad alta risoluzione su preparati interi di embrioni di pesce zebra in laboratorio.
Utilizziamo questa procedura per studiare la segmentazione del pesce zebra. Cominciamo. Iniziare la procedura con embrioni fissati durante la notte al freddo in paraformaldeide.
L'uso di una soluzione appena scongelata di paraformaldeide per questa fissazione è fondamentale per una colorazione riuscita. Rimuovere la soluzione fissante e lavare gli embrioni a temperatura ambiente due volte per cinque minuti ciascuna in PBS. Successivamente, rimuovere il corione degli embrioni.
Gli embrioni vengono posizionati in piastre di vetro con cavità. Utilizzando pinzette da orologiaio, rimuovere il Corian da questo momento in poi. Usare una pipetta di Pasteur in vetro levigata a fiamma per trasferire gli embrioni.
Altrimenti, gli embrioni aderiranno alle normali punte in polipropilene. Gli embrioni declorinati vengono trasferiti attraverso una serie di lavaggi con concentrazioni crescenti di metanolo. L'ultimo lavaggio viene effettuato in metanolo al 100%.
Infine, gli embrioni vengono posti in metanolo fresco e conservati a meno 20 gradi durante la notte. Il giorno successivo, trasferire gli embrioni attraverso una serie di lavaggi con concentrazioni decrescenti di metanolo e due lavaggi con tampone PBST di cinque minuti ciascuno. Successivamente, fissare gli embrioni con paraformaldeide per 20 minuti.
Terminare la fissazione breve con due lavaggi di cinque minuti ciascuno con PBST. Ora siamo pronti a rendere permeabili gli embrioni. Gli embrioni fissati diventano permeabili incubandoli con la proteina ACE K. Assicurarsi di posizionare il tubo da microcentrifuga di lato.
La durata del passaggio di digestione dipende dall'età dell'embrione. Ad esempio, gli embrioni allo stadio di agenesia somatica vengono incubati per tre o quattro minuti. Risciacquare brevemente in PBST e lavare una volta in PBST per cinque minuti.
Fissare gli embrioni in paraformaldeide. Infine, lavare gli embrioni due volte in PBST per cinque minuti. Gli embrioni sono ora pronti per l'ibridazione con le sonde di RNA.
Ora che abbiamo fissato e reso permeabili gli embrioni, iniziamo il processo di ibridazione con un'incubazione di cinque minuti ad alta concentrazione di formammide a 65 gradi Celsius. Ricordare di preriscaldare la soluzione HIIN prima dell'uso. Successivamente, incubare gli embrioni in alta concentrazione di formammide per un'ora.
Ricordarsi nuovamente di preriscaldare la soluzione high plus. Ora rimuovere la maggior parte della soluzione hip plus, lasciandone 50 microlitri, assicurandosi che gli embrioni siano completamente immersi. Aggiungere un microlitro di ogni sonda e mescolare agitando delicatamente il tubo.
Coprire i tubi con carta d'alluminio da questo momento in poi. Poiché la fluoresceina è sensibile alla luce, incubare tutta la notte a 65 gradi Celsius; in questo modo l'ibridazione viene completata. Procediamo quindi a rimuovere i sonde in eccesso da questo momento in poi.
Il detergente viene eliminato per migliorare la colorazione. Tuttavia, si noti che gli embrioni diventano appiccicosi in assenza di detergente. Lavare due volte con soluzione di 50% formammide in 2xSSC per 30 minuti ogni volta.
Lavare una volta con soluzione XSSC due volte per 15 minuti. Infine, lavare due volte con SSC 0,2 volte per 30 minuti ogni volta. Successivamente, visualizzeremo ogni sonda.
Ora possiamo iniziare il rilevamento delle sonde ibridate. Rilevare prima la sonda marcata con fluoresceina poiché è meno stabile e più debole rispetto alla sonda marcata con digossigenina. Bloccare innanzitutto con 500 microlitri di reagente bloccante al 2% in tampone acido malico per un'ora a temperatura ambiente.
Successivamente, aggiungere l'anticorpo secondario anti-fluoresceina coniugato con perossidasi in un rapporto di diluizione 1:500 nella soluzione di blocco. Incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Assicurarsi di posizionare il tubo da microcentrifuga di lato.
Successivamente, avviare il rilevamento utilizzando il sistema di amplificazione del segnale tyrom o TSA. TYROM IDE è coniugato a un fluoroforo quattro. La perossidasi del rafano (horse radish peroxidase) presente sull'anticorpo converte TY IDE in un intermedio altamente reattivo. L'intermedio TY IDE reattivo forma un legame covalente con i residui situati in prossimità dell'anticorpo, determinando il deposito localizzato del fluoroforo quattro.
Iniziare con quattro lavaggi di 20 minuti ciascuno con tampone acido malico 1x a temperatura ambiente, lavati due volte in PBS. Il TY IDE con fluoresceina era stato precedentemente disciolto in DMSO per la conservazione. Centrifugare brevemente questo substrato per TSA.
Successivamente, diluire il substrato TSA da uno a 50 nel tampone di diluizione per l'amplificazione. Aggiungere la soluzione agli embrioni e incubare per 45 minuti. Posizionare il tubo da microcentrifuga su un lato.
Durante questo passaggio di incubazione, trasferire gli embrioni attraverso una serie di lavaggi di 10 minuti con concentrazioni crescenti di metanolo. L'ultimo lavaggio prevede 10 minuti in metanolo al 100%, seguiti da un'incubazione di 30 minuti in una soluzione di perossido di idrogeno all'1% per inattivare la perossidasi presente sull'anticorpo. In caso contrario, potrebbe interferire con la rilevazione dell'ossigeno dig.
Trasferire gli embrioni attraverso una serie di lavaggi con concentrazioni decrescenti di metanolo e con due lavaggi di 10 minuti ciascuno con tampone PBS. Questo garantisce la rimozione completa del metanolo. L'etichettatura con anticorpi del dig xigen e della sonda inizia con un blocco, come nel caso dell'anticorpo precedente.
Successivamente, aggiungere l'anticorpo anti digossigenina in una diluizione di uno a 1000. Posizionare il tubo da microcentrifuga in posizione orizzontale e incubare tutta la notte in ambiente freddo; il giorno successivo, lavare a temperatura ambiente con tampone acido malico.
Quindi, con PBS quickpin, il substrato tyrom SCI cinque. Diluirlo uno a 50 e aggiungerlo agli embrioni. Incubare per 45 minuti posizionando il tubo di lato.
Infine, lavare tre volte in PBST. Un'ultima colorazione con ioduro di propidio evidenzia i nuclei. Iniziare con due lavaggi di cinque minuti ciascuno in due XSSC.
Successivamente, trattare con RNAs per 30 minuti a 37 gradi. Lavare sei volte in due XSSC a temperatura ambiente, quindi aggiungere la soluzione di ioduro di propidio e colorare per otto minuti. Lavare sei volte in due XSSC.
Fissare gli embrioni in paraformaldeide per 20 minuti. E infine, due lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBST. Il montaggio degli embrioni per l'osservazione inizia con due incubazioni di 10 minuti in glicerolo al 25% e al 50%.
Successivamente, mettere i campioni in glicerolo al 75% e incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius. Questo passaggio di chiarificazione notturno facilita la dissezione degli embrioni. Infine, dissezionare e rimuovere il tuorlo dagli embrioni.
Per ridurre la fluorescenza di fondo, montare in piano gli embrioni su un vetrino da microscopio ed esaminarli al microscopio. Queste immagini mostrano una singola sezione confocale attraverso l'estremità posteriore di un embrione di pesce zebra allo stadio 10 So mite. La colorazione rossa mostra l'mRNA di delta C rilevato con una sonda marcativa con dig ossigeno e il reagente TSA sci-fi.
La colorazione verde rappresenta il suo mRNA rilevato con una sonda marcata con fluoresceina. E il reagente TSA fluoresceina, i nuclei colorati con ioduro di propidio sono colorati di blu in un embrione doppio colorato.
È possibile determinare in modo univoco le regioni con espressione distinta o sovrapposta. Questa procedura rivela la localizzazione subcellulare dell'mRNA, come si osserva in queste immagini ravvicinate della colorazione di her1. La trascrizione attiva del gene è indicata da punti di colorazione nel nucleo.
Altre cellule mostrano una localizzazione citoplasmatica dell'mRNA. Nell'embrione colorato in doppio, possiamo osservare cellule che trascrivono entrambi i geni o uno solo dei due geni.
Separatamente, vi abbiamo appena mostrato come eseguire un'ibridazione fluorescente in situ doppia ad alta risoluzione su embrioni di zebrafish in montaggio intero. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che dobbiamo prima testare le nostre sonde utilizzando sonde di colorazione standard mediate da fosfatasi alcalina: quelle che producono un segnale pulito e forte funzioneranno bene anche in fluorescenza in situ.
Abbiamo inoltre utilizzato con successo l'immunolocalizzazione della beta catenina al posto della colorazione con ioduro di propidio. Quando eseguiamo questa variazione, conduciamo le reazioni di ibridazione a 55 gradi Celsius invece che a 65. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo di ibridazione fluorescente in situ doppia ad alta risoluzione per l'analisi dei modelli di espressione genica negli embrioni di pesce zebra. Il metodo consente di determinare l'overlapping dei domini di espressione di due geni, utilizzando una colorazione contrastante nucleare con ioduro di propidio per migliorare la visualizzazione dell'organizzazione tissutale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Analisi dell'espressione genica
- Tecniche di imaging fluorescente
Sfondo
- L'ibridazione in situ su preparati interi è ampiamente utilizzata in biologia dello sviluppo.
- Questa tecnica consente di visualizzare l'espressione genica negli embrioni.
- L'imaging ad alta risoluzione è fondamentale per comprendere le interazioni geniche.
- Le tecniche di contrastazione migliorano la chiarezza dell'organizzazione tissutale.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'ibridazione fluorescente in situ doppia.
- Analizzare i profili di espressione di geni singoli e sovrapposti.
- Potenziare la visualizzazione della distribuzione dell'mRNA negli embrioni di pesce zebra.
Metodi Utilizzati
- Ibridizzazione di sonde ribo antisense all'mRNA bersaglio.
- Utilizzo di anticorpi coniugati con perossidasi per la rilevazione.
- Applicazione di fluoro four coniugato con aramide per la visualizzazione.
- Lavaggio dell'IDE non legato per rivelare i modelli subcellulari di mRNA.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei modelli di espressione genica negli embrioni di pesce zebra.
- Capacità di confrontare l'espressione di due geni utilizzando sonde distinte.
- L'imaging ad alta risoluzione rivela una distribuzione subcellulare dettagliata.
- Efficacia dimostrata del protocollo in un contesto di laboratorio.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'analisi dell'espressione genica.
- L'imaging ad alta risoluzione è essenziale per gli studi di biologia dello sviluppo.
- Applicazioni future potrebbero includere studi comparativi della funzione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'ibridazione fluorescente in situ doppia ad alta risoluzione nel pesce zebra consente una mappatura spaziale precisa dell'espressione genica, supportando la scoperta precoce e la validazione di bersagli nei modelli di sviluppo e di malattia. La capacità del protocollo di risolvere domini di espressione genica sovrapposti e distinti a risoluzione subcellulare aumenta la fiducia predittiva nell'analisi dei percorsi e nella riduzione dei rischi meccanicistici. Questa capacità è fondamentale per la selezione del portafoglio e per far progredire la ricerca traslazionale nei sistemi vertebrati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della sovrapposizione dell'espressione genica e delle relazioni tra percorsi in embrioni integri.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio rivelando i modelli di localizzazione subcellulare dell'mRNA.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici mediante analisi spaziale ad alta risoluzione dei geni candidati.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella selezione dei bersagli in contesti di sviluppo complessi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara modelli validati di pesce zebra per lo screening successivo della funzione genica e della modulazione.
- Fornisce output quantitativi riproducibili di imaging per la standardizzazione dei saggi.
- Consente il rilevamento multiplex dell'espressione genica, supportando flussi di lavoro di screening scalabili.
- Fornisce letture robuste per la valutazione degli effetti dei composti sui domini di espressione genica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il mappaggio dell'espressione genica a modelli vertebrati pertinenti alle malattie per garantire continuità traslazionale.
- Supporta la scoperta di biomarcatori correlando la localizzazione dell'mRNA con esiti funzionali.
- Facilita decisioni di avanzamento corrette per il rischio chiarificando la funzione genica in vivo.
- Migliora il valore predittivo per la selezione e la validazione di modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso di scoperta, dall'iniziale verifica delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, sfruttando il pesce zebra come sistema rilevante per le malattie.
- Biologia della scoperta: Fornisce dati spaziali ad alta risoluzione per la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi.
- Screening: Fornisce output di imaging quantitativi e riproducibili per la preparazione dei saggi.
- Analisi: Permette il confronto diretto dei domini di espressione genica e del loro sovrapporsi mediante microscopia confocale.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla ricerca preclinica mappando l'espressione genica in embrioni vertebrati interi.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e riutilizzabile per l'analisi dell'espressione genica in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle target.
- Valore operativo: Standardizza l'acquisizione di immagini e l'analisi per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e migliora l'efficienza del capitale chiarificando precocemente i rischi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di asset nella fase di scoperta, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio dei zebrafish, nella progettazione delle sonde e nell'immagine confocale.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per microscopia a fluorescenza e analisi delle immagini.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la validazione delle sonde e i protocolli di imaging.
- L'adattamento ad altri modelli vertebrati potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- La specificità del segnale e la riduzione del rumore di fondo sono fondamentali per un'interpretazione affidabile.
