Name: Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri come preparare campioni cerebrali per il criostato e implementare un campionamento sistematico nel brain banking. Questo metodo garantisce la conservazione del materiale biologico per analisi stereologiche non distorte.

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Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico.

Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti <ol><li> Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). </li><li> Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, e il volume determinato 2. Il tessuto deve quindi essere crioprotetti in soluzioni di saccarosio classificato con una concentrazione finale di 30% di saccarosio in tampone fosfato. Blocchi di tessuto deve essere congelato in isopentano a -65 ° C e conservati a -80 ° C fino a quando si è pronti a fetta. </li></ol> Parte 2: campionamento sistematico <ol><li> Campionamento sistematico si basa su un piano adeguato prima di sezionamento. L&#39;intera regione di interesse in entrambe le estensioni rostrale-caudale e dorso-ventrale deve essere ben definito. Un atlante stereotassico delle specie in uso è utile per definire la regione di interesse e per determinare la lunghezza della regione di interesse. Una volta che la lunghezza della regione di interesse è determinato, è necessario stabilire l&#39;intervallo di campionamento. Per esempio, dal atlante stereotassico si stabilisce che l&#39;intero rostro-caudale estensione della regione di interesse è di circa tre millimetri di lunghezza Durante il taglio nel piano coronale. Quindi decide di impostare il criostato alla sezione a 50 micron, di questo passo si avrà 60 sezioni che coprono il rostrale-caudale estensione della regione di interesse. Per un tipico studio imparziale stereological 6-10 sezioni sistematicamente campioni sono necessari per ottenere risultati attendibili. In questo esempio 10 sezioni equidistanti in tutto il rostro-caudale risultato misura in un intervallo di campionamento di 1 / 6 sezioni. </li></ol> Parte 3: Creazione della banca del cervello <ol><li> Una volta che la frequenza di campionamento sezione è stato determinato, il passo successivo è quello di determinare che le macchie verrà eseguita immediatamente. Per esempio, se siete colorazione con violetto cresolo potrete catturare 1 / 6 sezioni su una diapositiva. Questo sarà serie 1. Se sai che forse diversi anticorpi potenziale che si desidera eseguire, ma entrambi vogliono vedere i dati che fornisce il vostro principale macchia o semplicemente non hanno il tempo per eseguire l&#39;immunoistochimica, posto il restante 5 serie di sezioni nell&#39;ordine in cui sono sono stati tagliati a preservare pozzetti contenenti antigeni (1 pirrolidone polivinile%, glicole etilenico al 50% in o.1M PBS, pH 7,4). La seguente tabella fornisce uno schema di campionamento composto da 1 scivolo e 1 piastra (standard piastra da 48 pozzetti) di sezioni come parte di una banca del cervello (Tabella 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. La frequenza di campionamento sezione qui è 1 / 6. La prima sezione è posto su un vetrino per la colorazione violetto cresolo e il prossimo 5 sezioni sono poste in antigene preservare. Numero della sezione 7 è poi catturato sulla diapositiva e le sezioni 9-12 sono collocati in antigene preservare. Questo ciclo viene ripetuto fino a quando la regione di interesse o il blocco dei tessuti è esaustivo sezionato. </li><li> Il passo successivo è quello di sezione esaurientemente il blocco di tessuto. Mettere una piccola quantità di incorporare medio sul mandrino e farlo congelare. Posizionare il mandrino nella testa microtomo e radere abbastanza del mezzo congelato di avere una superficie piana. Rimuovere il mandrino dalla testa microtomo e luogo pianeggiante all&#39;interno del criostato. Versare incorporare medio sul mandrino e saldamente posto il blocco cervello con il lato stereotaxically taglio posizionato categoricamente sul mandrino. Incorporare lentamente e completamente il cervello in montaggio di media. Posizionare il mandrino con il cervello nella testa microtomo e la sezione con il pre-determinati parametri per la frequenza di campionamento sezione. </li><li> Una volta che il blocco di tessuto è stata esaurientemente sezionato e le sezioni sono collocati in pozzi, coprire la piastra con il coperchio, avvolgere il coperchio con parafilm, e mettere in un congelatore di -20 ° C. Registro il numero totale delle sezioni adottate per ciascuna serie, la sezione-intervallo di campionamento, e il numero di serie per ogni animale. Questo registro sarà vitale per tenere traccia di successiva rimozione di sezioni dalla banca cervello per immunoistochimica futuro. </li></ol> Parte 4: Risultati Rappresentante: Campionamento sistematico in questo modo è stata una pratica standard nel nostro laboratorio negli ultimi 3 anni. Abbiamo avuto un grande successo di immunoistochimica eseguire sul materiale che è stata conservata in antigene preservare tre anni dopo è stato tagliato senza deterioramento del segnale (Figura 1). Inoltre, come parte della nostra banca cervello che abbiamo registrato vicino a 20.000 sezioni sistematica della non-umanocervello dei primati (Figura 2) come parte della nostra piani a lungo termine della ricerca. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figura 1. Questa è una sezione dal polo occipitale del primate non umano immunostained per NeuN mostrando sia VI livello e interstiziale neuroni della sostanza bianca. Questa particolare sezione è stato immagazzinato in antigene conservare a -20 ° C per un periodo di 2 anni. Barra di scala = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La nostra banca cervello cercopiteco ora è composta di quasi 20.000 sezioni sistematico da oltre 30 scimmie.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Campionamento sistematico è un metodo poco costoso scopo di massimizzare il materiale di ricerca. Questa strategia di campionamento è stato progettato per rispettare le regole di stereologia imparziale che richiede il campionamento sistematico in tutta la regione. E &#39;fondamentale che l&#39;ordine delle sezioni per ogni serie è mantenuta. Nel nostro laboratorio abbiamo utilizzato con successo questo metodo per il settore bancario sia criceto e non umani sezioni cervello dei primati. Finora abbiamo raccolto sezioni ce...

<table><tbody><tr><td>Glicole etilenico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Poli(vinilpirrolidone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di inclusione Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cervello banking: utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in una data area di interesse<sup&gt; 1</sup&gt;. Per raggiungere questo obiettivo 60-10 sezioni sistematica dovrebbe essere sondato che copre l&#39;intera struttura. Tipicamente si tratta di elaborazione 1 / 5 sezioni che lascia una notevole quantità di materiale non trasformato. Al fine di massimizzare il materiale, vi proponiamo un metodo poco costoso per conservare tessuto fissato come parte di un piano a lungo termine di stoccaggio di ricerca. Come tessuto è tagliato e lavorato per il desiderato macchia o anticorpi, si alternano sezioni dovrebbero essere sistematicamente messo in antigene conservare a -20 ° C per elaborazioni future. Utilizzando piastre da 24 pozzetti, le sezioni possono essere messi in ordine per il recupero futuro. Utilizzando questo metodo, i tessuti possono essere conservati e trattati per immunoistochimica nel corso degli anni.

Banche del cervello e campionatura sistematica di materiale biologico costituisce la base per stereologia imparziale e massimizza il potenziale dei dati ottenuti da ogni campione.

Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

La stereologia non distorta (unbiased stereology) è un metodo per stimare in modo accurato ed efficiente il numero totale di neuroni (o di altri tipi cellulari) in una determinata area di interesse1. Per...

Per iniziare questa procedura, il blocco cerebrale deve essere preparato per il criostato e deve essere determinata la frequenza di campionamento delle sezioni. Successivamente, devono essere preparati l'antigene e i vetrini. Il blocco cerebrale deve essere posizionato sul mandrino all'interno del criostato.Una volta che il cervello è stato fissato in modo sicuro sul mandrino a uno spessore prestabilito, si devono ottenere sezioni sistematiche in modo che la serie uno venga posizionata su un vetrino, mentre le serie successive vengano collocate in pozzetti precedentemente riempiti con soluzione conservante per l'antigene. Una volta esaurito il blocco, si deve posizionare la piastra in un congelatore a meno 20 gradi Celsius come parte della propria banca del cervello. Salve, sono il dottor Mark Burke del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal.Ciao, sono la dottoressa Shahin Zur, anch'io del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Salve, sono il dottor Mo Petto, direttore del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Oggi vi mostreremo una procedura per la conservazione sistematica del tessuto cerebrale in forma antigenicamente preservata.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per massimizzare il materiale di ricerca e come base per condurre una teologia imparziale. Cominciamo dunque. Questo protocollo descrive come campionare in modo sistematico il tessuto cerebrale che è stato fissato, sezionato stereotassicamente in fette spesse un centimetro e congelato.Per visualizzare nel dettaglio questi passaggi precedenti, consultare il nostro recente articolo su JoVE che illustra la dissezione del cervello di primati non umani nello spazio stereotassico. Il primo passo nel campionamento sistematico consiste nel creare il proprio schema di campionamento, decidendo come sezionare il tessuto, come suddividere tali sezioni in serie o campioni, e come organizzare e tenere traccia di questi campioni. Innanzitutto, consultare un atlante stereotassico secondo necessità.Definire chiaramente la regione di interesse sia nelle dimensioni rostrale-caudale che dorso-ventrale e scegliere il piano di sezionamento. Successivamente, decidere lo spessore dei propri sezioni e calcolare quanti sezioni possono essere ottenuti dalla regione di interesse. Ad esempio, in base all'atlante stereotassico, si determina che l'estensione rostro-caudale completa della propria regione è lunga circa tre millimetri.Si decide quindi di impostare il criostato per sezionare a 50 micrometri, e a questo ritmo si otterranno 60 sezioni coronali che coprono l'intera regione. A questo punto, è possibile stabilire l'intervallo di campionamento. Per uno studio teologico tipico non distorto, sono necessarie da sei a dieci sezioni campionate sistematicamente per ottenere risultati affidabili.In questo esempio, 10 sezioni equidistanti lungo tutta l'estensione del Ros coddle producono un intervallo di campionamento di una sezione ogni sei. Una volta stabilita questa frequenza di campionamento delle sezioni, si dovrà decidere successivamente quali colorazioni eseguire. Si procederà immediatamente a montare le sezioni da colorare direttamente su vetrini, mentre si seziona il tessuto.Ad esempio, se si esegue la colorazione con, diciamo, violetto di cresile, si acquisirà una delle sei sezioni su un vetrino. Questa sarà la serie uno. Le sezioni rimanenti verranno conservate in piastre contenenti antigene preserve per future immunocitochimiche.Lo schema di campionamento mostrato qui comprende due vetrini e una piastra standard a 24 pozzetti di sezioni, come parte di una banca del cervello, per un totale di sei serie per questo blocco di tessuto. Il passaggio successivo consiste nel sezionare completamente il blocco di tessuto utilizzando il microtomo criostatico. Per prima cosa, è necessario montare il campione di tessuto congelato sulla parte chiamata mandrino, che si inserisce nella testa del microtomo e funge da piattaforma per il campione.Per iniziare, applicare una piccola quantità di mezzo di inclusione sul mandrino e lasciarla congelare. Inserire il mandrino nella testa del microtomo e asportare una quantità sufficiente del mezzo congelato per ottenere una superficie piana per il campione. Rimuovere il mandrino dalla testa del microtomo e posizionarlo in piano all'interno del criostato.Versare il mezzo di inclusione sul mandrino in modo uniforme e compatto. Posizionare lentamente e completamente il blocco cerebrale con la superficie tagliata rivolta verso il basso sul mandrino. Includere il pezzo di cervello nel mezzo di montaggio.Posizionare il mandrino, ora montato con il cervello, nella sezione della testa del microtomo utilizzando la frequenza predeterminata di campionamento delle sezioni. Dopo aver realizzato una sezione, montarla su un vetrino oppure aggiungerla a una serie specifica nella piastra contenente il conservante per l'antigene, avendo molta cura di mantenere le sezioni in ordine. Le si taglia in modo da poter successivamente tornare alla banca del cervello ed eseguire un altro campionamento sistematico.Dopo aver sezionato completamente il tessuto e posizionato le sezioni nei pozzetti, coprire la piastra con il coperchio, avvolgere il coperchio con paraffina e collocare in un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Registrare il numero totale di sezioni in ciascuna serie, l'intervallo di campionamento delle sezioni e il numero di serie per animale. Questo registro sarà fondamentale per tenere traccia delle sezioni quando le si preleverà dalla banca del cervello per esperimenti futuri.Campionare sistematicamente in questo modo è stata una pratica standard nel nostro laboratorio. Negli ultimi tre anni, abbiamo ottenuto un notevole successo nell'esecuzione di immunoidistochemica su materiale conservato in antigen preserve per tre anni, senza alcun deterioramento del segnale. Inoltre, come parte del nostro biobanca cerebrale, abbiamo registrato circa 20.000 sezioni sistematiche del cervello di primati non umani.Come parte dei nostri piani di ricerca a lungo termine, abbiamo appena illustrato come campionare sistematicamente un campione biologico e conservarlo nell'ambito dei vostri piani di ricerca a lungo termine. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di tenere un registro dettagliato del numero totale di serie prelevate e del numero totale di sezioni per ogni serie. Inoltre, se una sezione viene persa o danneggiata, registrare il numero di tale sezione nel registro al fine di mantenere una procedura di campionamento sistematico.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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