Name: Rilevamento di proteine Ubiquitinazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri come rilevare l'ubiquitinazione delle proteine nelle cellule coltivate e in vitro. Questo metodo consente di studiare le ubiquitin ligasi e i substrati per comprendere i meccanismi cellulari.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH RO1 DC006497, RO1 NS057289 e PO1 ES016738 (alla Z. Zhang), California Institute per la Medicina Rigenerativa concede RS1-00331-1 e RL1-00682-1 (alla Z. Zhang), il Parkinson americano Disease Association (alla Z. Zhang e YS Choo) e la Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research (Z. Zhang).

Rilevazione di ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in coltura <ol><li> Trasfettare cellule in coltura con i plasmidi che esprimono la proteina di interesse e (epitopo-tagged versione) ubiquitina. </li><li> Di dare integrale buffer di lisi cellulare (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con orthovanadate sodio 2mM, 50 mM fluoruro di sodio, e gli inibitori della proteasi. </li><li> Lisare le cellule con 100 microlitri di buffer lisi cellulare per piastra (6 piatto cm). Se una parabola più grande viene utilizzato, regolare il volume di conseguenza. Agitare il piatto con attenzione per lasciare che il tampone di lisi coprire l&#39;intera area di cellule coltivate. </li><li> Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferire i lisati di cellule in una provetta eppendorf da 1,5 ml. Posizionare il tubo su una piastra calda subito a bollire per 10 minuti. </li><li> Taglio le cellule con un dispositivo di sonicazione. </li><li> Aggiungi 900ul di tampone di diluizione (10 Triton mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1%). Incubare i campioni a 4 ° C per 30-60 min con rotazione. </li><li> Spin i campioni diluiti a 20.000 xg per 30 min. Trasferire il surnatante risultante in una nuova provetta Eppendorf. Fare attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine. </li><li> Preparare proteina A o G-agarosio tallone coniugato anticorpi contro la proteina bersaglio in un buffer compatibile (50% liquami). Tagliare la parte più stretta di una punta P-200 pipetta e trasferire 14-20 ml di resina 500-1,500 mcg di lisati cellulari preparato per immunoprecipitazione. Per le celle con efficienza di transfezione alta, 500 mcg sarà sufficiente. Per le celle con efficienza di trasfezione bassa, più proteine ​​possono essere necessari. </li><li> Incubare il lisato-tallone miscela di cellule a 4 ° C per una notte con rotazione. </li><li> Spin giù le perline a 5000 xg per 5 min. Aspirare il sopranatante. Lavare la resina con il tampone di lavaggio (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) due volte. </li><li> Spin le perle per l&#39;ultima volta a 20.000 xg per 30 sec. Aspirare il tampone residuo di lavaggio e far bollire la resina con tampone 2X carico SDS. </li><li> Caricare campioni su un gel SDS-PAGE per l&#39;analisi immunoblotting. </li><li> Rileva ubiquitina e la proteina bersaglio con anticorpi rispettivi proprietari. Per immunoblotting, in genere rilevare ubiquitina prima. La membrana sarà poi utilizzata per rilevare la proteina precipitata. </li></ol> Rilevamento di ubiquitinazione sulla proteina bersaglio attraverso Saggio in vitro ubiquitination <ol><li> Fai tampone 5X ubiquitinazione (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Memorizzarli in piccole aliquote a -20 ° C fino a 6 mesi. Alcuni protocolli anche aggiungere creatina fosfato e di creatin-chinasi nel buffer di 1,2 ATP rigenerazione. </li><li> Per ogni reazione, preparare una miscela contenente quanto segue: <table border="1"><tbody><tr><td> 8 microlitri </td><td> Ubiquitination tampone 5X </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> ubiquitination E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> ubiquitination E2 </td></tr><tr><td> 0,5 mcg </td><td> ubiquitina </td></tr><tr><td> 0,5 mcg </td><td> proteina di interesse </td></tr><tr><td></td><td> acqua a 40 microlitri di volume totale </td></tr></tbody></table> Come controlli, preparare reazioni simili in mancanza di uno E1, E2, o ubiquitina. </li><li> Incubare la miscela a 37 ° C per 1 ora o più. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo SDS-PAGE tampone campione e fate bollire il campione per 10 min. </li><li> Caricare i campioni sul gel SDS-PAGE per l&#39;analisi immunoblotting. </li><li> Rileva ubiquitina e la proteina bersaglio con anticorpi rispettivi proprietari. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

In questa presentazione, abbiamo prima descritto passi che permettono di rilevare la modifica ubiquitina su una proteina di interesse in colture di cellule di mammifero. Al fine di rilevare l&#39;ubiquitinazione in particolare sulla proteina di interesse, non su non covalente delle proteine ​​che interagiscono, abbiamo usato una condizione rigorosi per la lisi cellulare, immunoprecipitazione e lavaggio 1,3. Ubiquitinazione, rilevato da immunoprecipitazione della proteina bersaglio in una condizione dura segui...

rilevamento di proteine ​​ubiquitinazione

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinazione, l&#39;attacco covalente del ubiquitina polipeptide a bersaglio le proteine, è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Essi comprendono l&#39;attivazione di enzimi ubiquitina-E1, ubiquitina-coniugando enzima E2 ed E3 ubiquitina ligasi. A differenza di E1 ed E2, E3 ubiquitina ligasi visualizzare specificità di substrato. D&#39;altra parte, numerosi enzimi deubiquitylating hanno un ruolo nella trasformazione delle proteine ​​polyubiquitinated. Ubiquitinazione può risultare in cambio di stabilità proteica, localizzazione cellulare, e l&#39;attività biologica. Le mutazioni di geni coinvolti nella ubiquitinazione / deubiquitination percorso o alterata funzione del sistema ubiquitina sono associati a molte malattie umane come vari tipi di cancro, neurodegenerazione e disordini metabolici. Il rilevamento di ubiquitinazione alterata o normale di proteine ​​bersaglio può fornire una migliore comprensione della patogenesi di queste malattie. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in coltura<em&gt; In vivo</em&gt; E provette<em&gt; In vitro</em&gt;. Questi protocolli sono utili anche per individuare altri ubiquitina-come piccola modifica molecola come sumolyation e neddylation.

Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in coltura<em&gt; In vivo</em&gt; E provette<em&gt; In vitro</em&gt;.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

L'ubiquitinazione, l'attacco covalente del polipeptide ubiquitina a proteine bersaglio, è una modifica post-traduzionale fondamentale condotta da un set di...

Ciao, sono Chu del laboratorio di Jo presso l'Istituto di Ricerca Medica di Birmingham. Oggi vi mostreremo un procedimento per rilevare la nuova uazione proteica. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il parkin o i ligandi UBI tre e il loro substrato.Iniziamo. Per iniziare questo protocollo, trasfettare le cellule con plasmidi che esprimono sia la proteina bersaglio sia una versione dell'ubiquitina marcata con un epitopo. Lasciare crescere le cellule per circa 40 ore, quindi spostarsi al banco del laboratorio per lisare le cellule: aspirare il mezzo liquido e lavare le cellule due volte con PBS.Successivamente lisare le cellule aggiungendo 100 microlitri di buffer per la lisi cellulare, che contiene SDS al 2%, per ogni piastra da sei centimetri. Ruotare delicatamente ogni piastra in modo che il buffer ricopra completamente le cellule. Successivamente, utilizzare una spatola per cellule per raccogliere le cellule lisate e trasferirle in una provetta eppendorf da 1,5 millilitro.Posizionare immediatamente il tubo su un blocco termico e far bollire le cellule lisate per 10 minuti per denaturare ulteriormente e sciogliere le proteine. Dopo l'ebollizione, utilizzare un dispositivo a sonica per frammentare le cellule e il loro DNA. Questo passaggio rende i lisati cellulari meno viscosi.Dopo la sonica, aggiungere 900 microlitri di tampone di diluizione e lasciare ruotare i campioni a quattro gradi Celsius per 30-60 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni diluiti a 20.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere le proteine solubili. Quindi, senza disturbare il pellet, trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo einor.Infine, misurare la concentrazione proteica nel surnatante mediante un metodo come il saggio di Lowry modificato che stiamo utilizzando qui. A questo punto, siete pronti a utilizzare un'immunoprecipitazione per isolare la proteina di interesse dalle altre presenti nel surnatante. Il primo passaggio nell'immunoprecipitazione consiste nel preparare le perle coniugate con anticorpi diretti contro la proteina di interesse.È possibile utilizzare perle con anticorpo coniugato disponibili in commercio oppure preparare il proprio anticorpo immobilizzato utilizzando agenti di cross-linking. Come illustrato in questo caso, preparare l'anticorpo immobilizzato in un buffer compatibile per ottenere una sospensione al 50% da utilizzare per impostare la reazione di precipitazione dell'amino. Tagliare l'estremità stretta di una punta per pipetta P200 e trasferire da 14 a 20 microlitri di resina in da 500 a 1500 microgrammi di lisati cellulari preparati.Regolare la quantità di lisato cellulare utilizzato in base all'efficienza di trasfezione delle cellule. Lasciare la miscela di lisato cellulare e perle in rotazione a quattro gradi Celsius durante la notte. Durante questo periodo, l'anticorpo coniugato alle perle si legherà in modo specifico alla proteina bersaglio.Il giorno successivo, centrifugare le perle a 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il pellet della proteina. Dopo che la proteina sarà legata alle perle, aspirare il soprannatante e lavare la resina due volte con il tampone di lavaggio ad alto contenuto salino centrifugando a 5.000 G per cinque minuti. A quattro gradi Celsius, centrifugare le perle un'ultima volta a 20.000 G per 30 secondi ed aspirare il tampone di lavaggio residuo.Ora che hai purificato la proteina di tuo interesse, è il momento di separarla su un gel SDS-PAGE. Per prima cosa, fai bollire la resina con due volumi di buffer di caricamento SDS per denaturare le proteine e conferire loro una carica negativa. Carica i campioni preparati su un gel SDS-PAGE.Trasferire le proteine da un gel a una membrana seguendo il protocollo del vostro laboratorio per il western blot. Quindi sottoporre la membrana a sonda con anticorpi diretti contro l'ubiquitina o contro la proteina bersaglio e sviluppare la membrana su pellicola per visualizzare le proteine ubiquitinate. Abbiamo appena illustrato come rilevare l'ubiquitinazione delle proteine in cellule in coltura.Questo stesso esperimento può essere eseguito in vitro in un tubo da saggio. La reazione ha un volume totale di 40 e può essere effettuata in un tubo per PCR. Preparare ogni reazione come segue.Per prima cosa, aggiungere cinque volte il buffer di UBIQUITINAZIONE, che contiene un TP e l'agente riducente DIO tre etolo, DTT. Successivamente, aggiungere gli enzimi di ubiquitinazione E1 ed E2. Aggiungere i substrati, ubiquitina e proteina bersaglio.Portare il volume totale della reazione a 40 microlitri con acqua come controlli. Preparare reazioni simili in assenza di ubiquitina E1, E2 o della proteina bersaglio. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora o più a lungo.Interrompere la reazione aggiungendo il buffer campione per SDS-PAGE. Far bollire il campione per 10 minuti. Caricare i campioni su un gel SDS-PAGE e procedere con l'analisi di immunoblotting come fatto per l'esperimento in vivo.Di seguito è riportato un esempio di risultato ottenuto con questo protocollo. Parkinson. Una proteina associata alla malattia di Parkinson è la proteina di interesse in questo caso. E la corsia quattro mostra la parina ubiquitinata.Le tipiche bande forti o a scala sono mostrate al di sopra del peso molecolare della parina non modificata per confrontare diverse condizioni sperimentali, i livelli cellulari di espressione della proteina bersaglio non modificata, parina e ubiquitina che devono essere considerati per ciascuna condizione. Questo è un esempio di ubiquitinazione in vitro di parina: la parina purificata per affinità è stata sottoposta a saggio di ubiquitinazione in vitro in presenza di E1 ricombinante, E2 e ubiquitina marcati con biotina; la parina ubiquitinata con biotina è stata rilevata mediante streptavidina HRP. La parina ubiquitinata appare come bande a scala al di sopra del peso molecolare della parina non modificata; le lane uno, due e quattro sono controlli che non contengono rispettivamente ubiquitina, E1, E2 e parkina.Noi, abbiamo appena mostrato come rilevare la proteina della nuova vaccinazione nelle cellule coltivate. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preparare il lisato cellulare in condizioni altamente tampone e di diluire il lisato cellulare prima di aggiungere gli anticorpi mobilizzati. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Biologia

Questo video descrive un metodo per estrarre e purificare peptidi ubiquitinilati contenenti residui di peptidi di-glicina da una miscela di peptidi complessi. Il metodo presentato può aiutare a identificare i siti di ubiquitinazione originali nella proteina.

Estrazione basata sull'immunoaffinità di peptidi ubiquitinilati: una tecnica per estrarre selettivamente peptidi marcati con ubiquitina da frazioni peptidiche purificate

Dettagli Il protocollo attuale un metodo per misurare l'attività degli enzimi funzionalmente omologo deubiquitinating. Sonde specializzate covalentemente modificano l'enzima e consentono il rilevamento. Questo metodo ha il potenziale di identificare nuovi bersagli terapeutici.

Metodo per la misurazione dell&#39;attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

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Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Il presente protocollo evidenzia un metodo modificato per rilevare e quantificare i legami incrociati DNA-proteina (DPC) e le loro modificazioni post-traduzionali (PTM), tra cui l'ubiquitilazione, la SUMOilazione e l'ADP-ribosilazione indotte da inibitori della topoisomerasi e dalla formaldeide, consentendo così lo studio della formazione e della riparazione delle DPC e dei loro PTM.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con tecnologie di sonda per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole della medicina tradizionale cinese e bersagli proteici.

Screening di composti della medicina tradizionale cinese per l'inibizione dell'attività di UCHL3 basati sulla tecnologia delle sonde enzimatiche molecolari e deubiquitinanti

L'ubiquitinazione è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delle proteine. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato nelle cellule dei mammiferi e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione. La sovraespressione proteica nelle cellule di HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria, mentre proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi western blot.

Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello

Scopri come rilevare l'ubiquitinazione delle proteine nelle cellule coltivate e in vitro. Questo metodo consente di studiare le ubiquitin ligasi e i substrati per comprendere i meccanismi cellulari.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

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