Le registrazioni di attivazione circuito neurale in Liberamente Comportarsi Animali
22 luglio 2009
Misurazioni non invasive di schemi di attività neurale nel comportarsi liberamente gli animali sono ottenuti combinando registrazioni neurofisiologiche con videografia ad alta velocità.
Per la registrazione dei potenziali di campo neurale e muscolare. Le registrazioni elettroniche di una coppia di elettrodi da bagno sono sincronizzate con le registrazioni video ad alta velocità e visualizzate sul monitor di un laptop. Un giovane gambero viene posto in un piccolo acquario e lasciato acclimatare per cinque minuti.
L'animale viene toccato con una sonda portatile dallo sperimentatore dopo che le registrazioni sono state avviate e le risposte comportamentali e fisiologiche risultanti vengono misurate e successivamente analizzate. Ciao, sono il dottor Y Savaha del Dipartimento di Psicologia dell'Università del Maryland College Park. Oggi vi mostreremo una procedura per registrare in modo non invasivo i potenziali di campo neurale e muscolare in animali che si comportano liberamente.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per identificare i circuiti neurali che vengono attivati durante le risposte di fuga nei giovani gamberi. Quindi iniziamo. Per iniziare a costruire gli elettrodi di registrazione, non vengono strappati da 0,5 a un millimetro di isolamento da un'estremità di un filo di rame isolato.
Questo processo viene ripetuto su un secondo filo identico per creare una coppia di elettrodi di registrazione utilizzando colla atossica. Gli elettrodi di registrazione sono fissati all'interno di una camera di registrazione in vetro a parete sottile. Gli elettrodi di registrazione sono posizionati uno di fronte all'altro al centro di entrambi i lati corti della camera.
Successivamente, il filo di terra viene realizzato spogliando da due a tre centimetri di isolamento di un'estremità e venduto. Durante questa estremità a un pezzo di filo più lungo. L'elettrodo di terra è posizionato su uno dei lati lunghi della camera di registrazione, perpendicolarmente agli elettrodi di registrazione.
La camera di registrazione deve essere lunga 8,5 centimetri per due centimetri di larghezza per cinque centimetri di altezza. Successivamente, una sonda stimolante è costituita da un perpet di vetro dotato di una coppia di elettrodi a filo sottile. Le punte degli elettrodi sono esposte per produrre un segnale elettronico quando l'animale viene toccato dalla sonda.
Ciò consente una misurazione precisa del tempo di stimolazione. Gli elettrodi di registrazione a bagno, la sonda e il filo di terra sono collegati a un amplificatore extracellulare. Quindi, per prima cosa, sto collegando gli elettrodi da bagno all'amplificatore.
Successivamente, sto collegando la sonda all'amplificatore. E infine, sto mettendo a terra il basso e la sonda attraverso la massa dell'amplificatore. Le uscite dell'amplificatore sono collegate a una breakout box e a una scheda di acquisizione dati tramite cavi BNC.
La camera è riempita di ghiaia per fornire trazione all'animale. La camera è ora riempita con acqua deionizzata. Risultati ottimali si ottengono quando si utilizza acqua ad alta resistenza, circa 18 mega ohm, con la costruzione degli elettrodi di registrazione, del filo di terra e della sonda di stimolazione completata.
Possiamo vedere come condurre registrazioni sperimentali prima di iniziare l'esperimento. Una videocamera ad alta velocità è posizionata perpendicolarmente alla camera di registrazione per fornire una vista laterale utilizzando un illuminatore a collo d'oca. La luminosità all'interno della camera di registrazione viene regolata tramite una breakout box e una scheda di acquisizione dati.
La videografia è sincronizzata con le registrazioni elettroniche. Quando lo sperimentatore è pronto per iniziare la registrazione, un interruttore manuale esterno inizia a sincronizzare l'acquisizione di video e dati. Per iniziare l'esperimento, un singolo animale viene introdotto nella camera e lasciato acclimatare per cinque minuti.
Una volta che l'animale si è acclimatato, l'acquisizione sincronizzata del video e dei dati viene avviata dal grilletto dell'interruttore manuale esterno. I video registrati a una frequenza di fotogrammi di 1000 fotogrammi al secondo e i potenziali di campo elettronici vengono registrati a una frequenza di 25 kilohertz. E quindi stiamo guardando qui.
Ogni fotogramma qui è lungo un millisecondo e, ancora una volta, la traccia superiore è la risposta neuromuscolare dell'animale. La traccia inferiore è la sonda. Ecco la deflessione nella sonda, che indica che questo è il momento in cui l'animale è stato colpito.
E poi ecco che c'è il segnale dell'animale. Il segnale neurale qui precede la grande deflessione, che è i muscoli e i muscoli si contraggono Utilizzando la sonda di stimolazione, le capriole della coda vengono suscitate da singoli tocchi di diversa intensità alla testa o all'addome. Questo processo viene ripetuto per esaminare i salti mortali durante diversi contesti comportamentali.
Infine, utilizzando il software Photon Motion Tool, i dati ottenuti durante la sessione di registrazione vengono analizzati per determinare la natura del movimento dell'animale risultante da ogni particolare circuito neurale attivato. Ecco uno sguardo a una serie di singoli fotogrammi video ad alta velocità e alle corrispondenti registrazioni del campo elettrico per un capovolgimento della coda di fuga in risposta a uno stimolo tattile inviato alla testa o alla coda di un giovane gambero. In questa traccia, un forte stimolo tattile alla testa ha evocato un capovolgimento della coda controllato dal circuito gigante mediale.
Il picco registrato del neurone gigante e la grande deflessione fasica che ne consegue consentono un'identificazione non ambigua del capovolgimento della coda mediato dall'attività dei neuroni giganti. Il movimento all'indietro mostrato nelle tracce video determina l'identità del circuito neurale attivato. Ecco un tail flip mediato dal circuito gigante laterale.
Dopo un forte stimolo tattile è stato applicato alla coda il movimento verso l'alto e in avanti visto nelle tracce video. Insieme a una traccia elettronica sincronizzata che mostra il picco gigante e la grande deflessione iniziale fasica, determina l'identità del circuito neurale attivato. Questo video mostra un tail flip controllato da circuiti non GI.
Uno stimolo tattile più graduale è stato erogato al torace dell'animale. Mentre il movimento catturato nel video non consente l'identificazione univoca del circuito attivato, la registrazione elettronica manca di un picco gigante e consiste in deflessioni molto più piccole che identificano il circuito attivato. Qui si possono vedere le misurazioni della latenza per tutti e tre i tipi di escape tail flip.
Il tempo tra il contatto con la sonda e la risposta fisiologica è stato misurato per sette animali. I salti mortali mediati dai giganti sono suscitati molto più velocemente dei salti mortali non gastrointestinali. Vi abbiamo appena mostrato come registrare i potenziali di campo neurale e muscolare generati dai giovani pesci grigi quando sfuggono a uno stimolo tattile.
Quando si esegue questa procedura, è importante adattare il protocollo alla domanda di ricerca. Ad esempio, potresti aver bisogno o meno di video ad alta velocità e potresti aver bisogno o meno di sincronizzare il tuo video con le tue registrazioni dei bassi. Quando si testa una nuova specie per la prima volta, è necessaria una misurazione indipendente per verificare le registrazioni degli elettrodi bassi nei gamberi.
Questo può essere fatto impiantando temporaneamente un paio di elettrodi attorno alla corte nervosa ventrale e confrontando le registrazioni degli elettrodi impiantati con le registrazioni degli elettrodi da bagno, è anche importante regolare le dimensioni della camera. La camera di registrazione dovrebbe essere il più piccola possibile, ma non dovrebbe limitare l'animale nel suo comportamento naturale. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio dimostra una procedura per registrazioni non invasive dei potenziali di campo neurali e muscolari in gamberi giovani che si comportano liberamente. Sincronizzando le registrazioni elettroniche con video ad alta velocità, i ricercatori possono analizzare le risposte comportamentali e fisiologiche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Analisi comportamentale
- Eletrofisiologia
Contesto
- Comprendere i modelli di attività neurale è cruciale per la ricerca in neuroscienza.
- Le tecniche non invasive permettono lo studio di animali che si comportano liberamente.
- La videografica ad alta velocità migliora l'analisi delle risposte comportamentali.
- I gamberi servono come organismo modello per studiare le risposte neurali e muscolari.
Obiettivo dello studio
- Registrare potenziali di campo neurali e muscolari in modo non invasivo.
- Analizzare la relazione tra attività neurale e comportamento.
- Stabilire un metodo per sincronizzare i dati video e elettrofisiologici.
Metodi utilizzati
- I gamberi giovani sono collocati in un piccolo acquario per l'acclimatazione.
- Le registrazioni elettroniche sono effettuate utilizzando elettrodi da bagno.
- Le registrazioni video ad alta velocità sono sincronizzate con i dati elettrofisiologici.
- Le risposte comportamentali sono evocate utilizzando una sonda manuale.
Risultati principali
- Sincronizzazione di successo delle registrazioni neurali con i dati video.
- Misura delle risposte comportamentali e fisiologiche agli stimoli.
- Analisi della relazione tra attività neurale e comportamento.
- Dimostrazione di un metodo non invasivo per studiare le dinamiche neurali.
Conclusioni
- Il metodo fornisce informazioni sulle risposte neurali e muscolari in animali che si comportano liberamente.
- Le tecniche non invasive possono migliorare la nostra comprensione dei meccanismi neurali.
- Questo approccio può essere applicato a vari studi in neuroscienza.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Establishing causal links between neural circuit activity and natural behavior remains a critical challenge in target validation for CNS drug discovery. This non-invasive electrophysiological approach enables unambiguous identification of specific neural circuits driving defined behavioral outputs in unrestrained models, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. By correlating precise neural signatures with ethologically relevant behaviors, the method enhances predictive confidence in early discovery stages where behavioral phenotypes inform target selection and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking defined neural circuit activation to specific escape behaviors in juvenile crayfish.
- Operational Value: Provides unambiguous identification of neural circuits mediating distinct behavioral responses through synchronized electrophysiological and video recordings.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by validating target engagement in freely behaving animals under naturalistic conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable field potential measurements that serve as objective physiological readouts for neural circuit activation.
- Reproducibility: Standardized electrode placement and stimulation protocols enable consistent recording of neural and muscular responses across trials.
- Scalability: Synchronized high-speed video and electrophysiological data collection supports scalable analysis of behavioral contexts and stimulus parameters.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Establishes a disease-relevant system for studying neural mechanisms underlying naturally occurring behaviors, facilitating cross-species extrapolation.
- Mechanistic De-risking: Allows validation of circuit-specific interventions by measuring corresponding changes in field potential signatures and behavioral outcomes.
- Predictive Confidence: Enables assessment of target modulation effects on both neural activity and ethologically relevant behavior in the same experimental paradigm.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanistic insights that bridge neural activity measurements with behavioral phenotyping, informing target validation and lead identification decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling correlation of specific neural circuit activation patterns with defined behavioral outputs in unrestrained animals.
- Screening: Delivers quantitative electrophysiological readouts that can be used to assess compound effects on neural circuit function in behavioral contexts.
- Analytics: Provides synchronized temporal data on neural field potentials and behavioral responses, enabling precise measurement of response latency and circuit-specific activation dynamics.
- Translational Research: Connects neural mechanism discovery to behavioral phenotypes, supporting biomarker alignment for circuit-specific therapeutic effects.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable electrophysiological platform for evaluating neural circuit modulation across different behavioral paradigms and stimulus conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity between neural activity and behavioral expression in unrestrained models.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized electrode configuration, stimulation protocols, and synchronized data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic evidence of target engagement in ethologically relevant behavioral contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated circuit-behavior relationships in physiologically relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, behavioral neuroscience, and synchronized data acquisition systems.
- Dependent on extracellular amplifiers, breakout boxes, data acquisition boards, and high-speed video equipment capable of 25 kHz sampling and 1000 fps recording.
- Necessitates cross-team standardization of electrode placement, stimulation intensity protocols, and behavioral scoring criteria for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for chamber dimensions, electrode materials, and water resistivity to accommodate different species while preserving natural behavior.
- Limited to measurable field potentials from superficial neural and muscular sources; deep brain structures may require complementary invasive techniques for validation.
