Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

Presentiamo un sistema per la coltura di progenitori neuroepiteliali del sistema nervoso centrale mentre si sviluppano e si differenziano in neuroni e glia maturi. La procedura inizia con l'isolamento di quattro cervelli da feti di ratto al giorno E16 e la loro digestione con proteasi. I tessuti vengono sospesi in una sospensione di singole cellule, filtrati, contati e distribuiti in una piastra a sei pozzetti.

Le cellule della piastra sono risospese delicatamente una volta al giorno per due o tre giorni per favorire la formazione di aggregati. Gli aggregati vengono quindi raccolti e filtrati attraverso una maglia da 200 micrometri e i piccoli grumi e i detriti cellulari sono rimossi mediante lavaggio. Infine, gli aggregati vengono contati e seminati su coprislip rivestiti con matrigel.

Ciao, sono Coto del laboratorio del Dottor John L del Dipartimento di Scienze Bioscienze Veterinarie Integrate della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per colture di aggregati cerebrali. Utilizziamo questo procedimento nel nostro livello tre per studiare la linea endocitica, lo sviluppo cellulare e le interazioni accelerate.

Iniziamo. Prima di cominciare, preparate sul bancone strumenti sterilizzati, etanolo al 70%, un tappetino assorbente su cui lavorare e piastre di Petri da 10 centimetri per la dissezione. Mezzo di coltura sul ghiaccio.

Nella cappa, preparare un microscopio stereoscopico con una piattaforma di ghiaccio e diverse capsule Petri da 10 centimetri contenenti mezzo di dissezione, anch'esse poste sul ghiaccio. Infine, preparare le soluzioni da utilizzare e riscaldare il mezzo di semina a 37 gradi in un bagno termico. Si inizia questo protocollo isolando embrioni al giorno embrionale 16 (E16) da un ratto Sprague Dawley.

Prima di tutto, eutanasia una femmina gravida seguendo una procedura approvata dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Posiziona il ratto eutanasizzato su un tappetino assorbente e spruzzane l'addome con alcol per pulirlo. Successivamente, utilizza una pinzetta per sollevare la cute addominale e, con l'altra mano, usa le forbici per tagliare soltanto la cute, allarga la cute stessa, quindi utilizza un altro paio di pinzette e forbici sterili per tagliare attraverso lo strato muscolare.

Successivamente, rimuovere l'utero e trasferirlo in una piastra da 10 centimetri contenente mezzo di dissezione freddo di ghiaccio. Il passaggio successivo avviene nella cappa utilizzando forbici da dissezione microchirurgiche. Rimuovere con attenzione ogni embrione dall'utero.

Ora è il momento di raccogliere e iniziare. Lavorare con i cervelli embrionali. Prelevare il cervello da ciascun embrione e posizionare i cervelli isolati in una piastra pulita da 10 centimetri contenente mezzo di dissezione, posta su una piattaforma di ghiaccio. Al microscopio stereoscopico, completare la dissezione dei cervelli.

Rimuovere le sezioni del mesencefalo e del romboencefalo. Utilizzare pinzette fini per rimuovere le meningi e trasferire ciò che resta del proencefalo in un tubo falcon da 50 millilitri contenente mezzo di dissezione. Ora il tessuto è pronto per il passaggio successivo.

Dissociazione delle cellule mediante digestione enzimatica. Poco prima di iniziare la digestione, preparare soluzioni fresche di inibitore della proteasi e inibitore della tripsina. Sterilizzarle e riscaldarle a 37 gradi Celsius in un bagno termico.

Rimuovere il mezzo in eccesso dai cervelli dissezionati. Quindi aggiungere quattro millilitri della soluzione di digestione al propano preparata al tubo da 50 millilitri. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius esattamente per cinque minuti.

Quando il tempo è scaduto, utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione di propano. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di soluzione di inibitore della tripsina appena preparata e rimettere il tubo nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per altri due o tre minuti. Quando il tempo è scaduto, rimuovere la soluzione di inibitore della tripsina.

Ripetere l'incubazione con la soluzione di inibitore della tripsina altre tre volte. Dopo aver rimosso la soluzione di inibitore della tripsina per l'ultima volta, aggiungere 20 millilitri di mezzo di piastramento pm temperato al tubo.

Ora è il momento di ripetere l'operazione e lavare le cellule. Ripetere l'operazione sulle cellule con una pipetta da 10 millilitri fino alla scomparsa di tutti i grumi, circa da 20 a 30 volte. Quindi centrifugare a cento g per sette minuti.

A questo punto, le cellule dovrebbero essere ben separate l'una dall'altra. Dopo sette minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo di piastramento per lavare le cellule.

Poi centrifugarli nuovamente. Rimuovere il soprannatante e ripetere il lavaggio e la centrifugazione. Procedere dopo il secondo lavaggio.

Risospendere il pellet in 10 millilitri di coltura di aggregato. Mezzo, passare le cellule attraverso un setaccio cellulare da 70 micrometri. Infine, contare le cellule vive utilizzando un emocitometro.

Ora siete pronti a permettere alle cellule cerebrali dissociate di formare aggregati. Dopo il conteggio, sospendere le cellule dissociate nel mezzo di coltura per aggregati a una densità di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Trasferire due millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti non rivestita.

Le cellule vengono risospese delicatamente ogni giorno per tre notti. Una volta utilizzata una pipetta P1000, le cellule inizieranno a formare aggregati nel giorno della semina degli aggregati. Dopo che le cellule sono cresciute per tre notti, risospendere nuovamente le cellule delicatamente e filtrare la sospensione attraverso un setaccio da 200 micrometri in un tubo falcon da 50 millilitri.

Lasciare sedimentare gli aggregati sul fondo del tubo per circa tre a cinque minuti. Rimuovere quindi con attenzione il soprannatante, aggiungere mezzo di coltura, risospendere delicatamente gli aggregati e lasciarli sedimentare nuovamente. Ripetere questa procedura diverse volte.

Per rimuovere le cellule morte, le cellule singole e i detriti, utilizzare il microscopio per verificare se i soprannatanti contengono ancora cellule non aggregate e detriti. Dopo aver lavato accuratamente gli aggregati, risospendere delicatamente questi ultimi nello stesso mezzo e contare gli aggregati per determinarne la concentrazione. Successivamente, regolare la densità degli aggregati a circa 25-30 aggregati per 50 microlitri.

Ora è il momento di seminare gli slip di copertura con gli aggregati. Trasferire aliquote di 1000 microlitri della sospensione di aggregati in provette eend da due millilitri; poiché gli aggregati tendono a sedimentare sul fondo delle provette, è fondamentale preparare più provette di sospensione di aggregati per la semina. Gli slip di copertura utilizzati in questo passaggio sono rivestiti con matrigel, un substrato per colture cellulari, mediante incubazione notturna a 37 gradi Celsius.

Dopo aver preparato Alec watts della sospensione aggregata, prelevare la piastra di coltura contenente i coverslip rivestiti con matrigel dall'incubatore. Rimuovere la soluzione da ciascun pozzetto, lavare i coverslip con PBS tiepido e quindi con H2O DD.

Sono ora pronti per la semina di aggregati per seminare il vetrino con aggregati. Capovolgere il tubo della sospensione di aggregati per mescolare e distribuire uniformemente gli aggregati. Quindi aggiungere 50 microlitri di sospensione di aggregati al centro di ogni vetrino.

Rimettere delicatamente la piastra nell'incubatore senza ulteriori disturbi, in modo che gli aggregati si attacchino uniformemente al coverslip. La densità degli aggregati è cruciale: se gli aggregati sono posizionati troppo vicini tra loro o se la densità di semina è elevata, tendono a fondersi man mano che crescono, quattro-sei ore dopo il posizionamento iniziale. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura in ogni pozzetto.

Per mantenere la coltura di aggregati, effettuare un cambio parziale del mezzo ogni tre o quattro giorni. Quando si cambia il mezzo, aggiungerlo lungo la parete laterale della pozzetta per evitare di disturbare gli aggregati. Alcune ore dopo che gli aggregati si sono attaccati al vetrino coprioggetto, è possibile osservare l'espansione di outgrowth dagli aggregati.

Gli assoni crescono rapidamente nelle prime due settimane e formano numerose connessioni tra gli aggregati. I progenitori di Ggl migrano radialmente dagli aggregati e nel tempo si differenziano in astrociti e oligodendrociti maturi. Vi abbiamo appena mostrato come coltivare l'aggregato CS.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di indicare correttamente la capacità e di distribuire uniformemente l'aggregato. È tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.