Name: Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Impara a preparare culture aggregate di cervello di ratto per studiare lo sviluppo neuronale e gliale. Questo metodo consente di osservare la differenziazione dei progenitori multipotenti in neuroni, astrociti e oligodendrociti.

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Questo studio è stato finanziato in parte da fondi di start-up della Texas A &amp; M University

Preparazione prima della dissezione Strumenti chirurgici: sterilizzare tutti forbici e pinze da dissezione autoclave Coprioggetto pulizia: <ol><li> Immergere tutti coprioggetto (15 mm di diametro per 24-pozzetti) in 1L bicchiere erba nel 33% di HCl per almeno 24 ore </li><li> Lavare con acqua corrente per 10 minuti con scuotere occasionali per rimuovere tutti i residui di HCl </li><li> Risciacquare con acqua Millipore </li><li> Scaricare l&#39;acqua fuori </li><li> Mettere a bagno in coprioggetto 95-98% di etanolo </li><li> Coprioggetto trasferimento in un tessuto pulito in un piatto piano e aria secca i coprioggetti </li><li> Trasferimento coprioggetto ad un bicchiere di vetro, coprite con un foglio di alluminio e autoclave Nota: Vetrini coprioggetto possono essere memorizzati in questa fase </li><li> Luogo coprioggetto individuali in piastre di coltura. Pronto per la verniciatura </li></ol> Coprioggetto rivestimento: <ol><li> Prelevare 100 x magazzino di poli-D-lisina (PDL, 10 mg / ml in 0,5% di BSA in PBS, immagazzinato come aliquote a -20 ° C) con PBS e filtro-sterilizzare (0,22 micron) </li><li> Coprioggetto cappotto con 1 soluzione x PDL (~ 0,15 ml / cm 2) per 2 ore a 37 ° C in un incubatore </li><li> Rimuovere la soluzione PDL e lavare 3 volte con sterili DDH 2 O e coprioggetto asciugare completamente </li></ol> Nota: Cappotto abbastanza lamelle / piastre per ogni dissezione. PDL rivestite coprioggetto può essere conservato per un paio di settimane a 4 ° C. Mezzi di comunicazione e soluzioni Medio dissezione (DM): Utilizzare soluzione equilibrata sale sterili ghiacciata di Hank (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14175) integrata con 10 mM HEPES (Invitrogen 15.630). Terreni di coltura di aggregazione: Il mezzo DMEM/NBB27 contiene DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM di piruvato di sodio, 0,75 mm GlutaMAX, 60μg/ml N-acetilcisteina, 5 mcg / ml insulina, 10nm d-biotina e 1% di penicillina / streptomicina. Per fare 100 ml di terreno di coltura aggregato, miscelare 50 ml di DMEM (w / o piruvato / glutammina, Invitrogen 11960), 50 ml di mezzo Neurobasal (Invitrogen 211.034), 375 microlitri GlutaMax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg di sodio piruvato (Sigma P2256), 2 ml di B27 (Invitrogen 17.504), 6,3 mg di N-Acetilcisteina (Sigma A8199), 1 ml di brodo Sato (100 x magazzino, vedi sotto), 25 l di d-Biotina magazzino (4000 x magazzino, 40 mM in PBS memorizzati come aliquote a -20 ° C. Sigma B4639), 100 ml di insulina (1000 x stock, 5 mg / ml di HCl 0.01N memorizzati come aliquote a -20 ° C, Sigma 16634) e 1 ml di penicillina / streptomicina (100 x stock, Invitrogen 15.140), filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Sato 100 x soluzione di riserva: Per 40 ml dello stock: mescolare 40 Neurobasal ml con 400 mg di apo-transferrina (Sigma T2252), 400 mg di BSA (Sigma A9647), 10 ml di progesterone (25 mg / ml di etanolo, memorizzati come aliquote a -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescina (Sigma P7505), e 40 l di sodio selenite (30 mM in PBS, immagazzinato come aliquote a -20 ° C, Sigma S5261). Sterilizzare filtro della soluzione madre Sato, e conservare come aliquote a -20 ° C. Neurone medio placcatura (PM): Medio Neurobasal, 2% B27, 2mM Glutammina (stock 100x, aliquote conservati a -20 ° C, Invitrogen 25.030), a 25 micron acido glutammico (100 stock, aliquote conservati a -20 ° C) e 1% penicillina / streptomicina. Neuron terreno di coltura (CM): Medio Neurobasal, 2% B27, 2mM Glutammina (stock 100x, aliquote conservati a -20 ° C) e 1% di penicillina / streptomicina. 5-FDU magazzino: magazzino 100x, 1mm 5-fluoro-2&#39;-deossiuridina (Sigma F0503) and1mM uridina (Sigma U3003) in un mezzo Neurobasal. Sterilizzato per filtrazione e memorizzati come aliquote a -20 ° C. Papaina soluzione di digestione (fare ogni volta prima dissezione): <ol><li> Sciogliere 3,2 mg L-cisteina (Sigma C-7352) in 4ml DM </li><li> Regolare il pH a circa 7,4 con NaOH 1N (test su strisce reattive pH) e posto in bagno d&#39;acqua a 37 ° C Nota: eseguire il passo successivo a destra prima di digestione dei tessuti (vedi sotto). </li><li> Aggiungi papaina ad una concentrazione finale di 20 unità / ml </li><li> Filtro sterilizzare (0,22 millimetri), e posto in bagno d&#39;acqua a 37 ° C </li></ol> Soluzione di tripsina inibitore (fare ogni volta prima dissezione): <ol><li> Sciogliere 0,2 g di inibitori della tripsina (Sigma T7295) a 20ml di DM </li><li> Controllare il pH e aggiustare il pH a ~ 7.4 con 1 N NaOH </li><li> Filtro sterilizzare, e posto in bagno d&#39;acqua a 37 ° C </li></ol> La dissezione del cervello Setup: <ul><li> Pinze e forbici sterilizzate </li><li> Etanolo al 70% </li><li> Fazzoletto di carta pulito e DIAPer pad sulla panchina </li><li> Petri dieci centimetri di ghiaccio-freddo DM per utero e feto sulla panchina </li><li> Piattaforma di ghiaccio al microscopio dissezione </li><li> 2-3 piatti con DM 6 centimetri sul ghiaccio </li><li> PM caldo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C </li></ul><ol><li> Euthanize una donna incinta ratto Sprague-Dawley (E16) secondo una procedura approvata dal Animal Care istituzionali e Us Committee (IACUC) </li><li> Posare il ratto sulla rampa di pannolino e l&#39;alcool spay sulla regione addominale </li><li> Utilizzare una pinzetta per tenere la cute addominale e un paio di forbici per fare una incisione forma a V taglio solo la pelle </li><li> Allargate la pelle e utilizzare un altro pinzette sterilizzate e forbici per tagliare lo strato muscolare </li><li> Estrarre la catena delle sacche dell&#39;embrione e trasferirli in un piatto di 10 centimetri contenente ghiacciata DM </li><li> Utilizzando un paio di forbici microdissezione, rimuovere con attenzione ogni embrione dal sacco e il cervello da ogni embrione, e il luogo liberato cervello in un piatto pulito, con DM 10 centimetri su una piattaforma di ghiaccio </li><li> In una cappa laminare e al microscopio dissezione, rimuovere mesencefalo / rombencefalo sezioni, e utilizzare una pinza sottile per rimuovere meningi, e trasferire le cortecce pulito / ippocampo di un nuovo piatto con DM 6 centimetri su un impacco di ghiaccio Nota: in questa fase, il tessuto è pronto per la digestione enzimatica. </li><li> Fai la papaina e la soluzione di inibitori della tripsina e filtro sterilizzare </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di DM da cortecce / dell&#39;ippocampo </li><li> Aggiungere 4 ml della soluzione preparata digestione papaina </li><li> Trasferire tutto il contenuto in una provetta da 50 ml e posizionare il tubo Falcon in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per esattamente 5 minuti </li><li> Rimuovere soluzione papaina con pipetta </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione di inibitori della tripsina, agitare il tubo, e posto in un bagno di acqua a 37 ° C per 2-3 minuti </li><li> Rimuovere soluzione inibitore della tripsina </li><li> Ripetere il punto 13 e 14 tre volte </li><li> Aggiungere 20ml PM caldo </li><li> Triturare fino a quando tutti i grumi sono scomparsi (~ 20-30 volte) </li><li> Centrifugare a 100xg per 7min </li><li> Risospendere il pellet in 10ml PM e lavare due volte per centrifugazione </li><li> Risospendere il pellet in 10ml PM per le culture dei neuroni regolari o in NBB27/DMEM per aggregare culture </li><li> Passaggio delle cellule attraverso un setaccio cellula 70μm </li><li> Contare le cellule vive </li><li> Procedere alle culture aggregato come descritto di seguito o la targa delle celle per le culture dei neuroni regolare Nota: A questo punto, altamente arricchito culture neurone può essere ottenuto placcatura cellule dissociate sul PDL-rivestimento piastre a densità di 200-640 cellule / mm 2 a seconda dello scopo degli esperimenti. Dopo che le cellule hanno attaccato (~ 2-4h), sostituire medio con PM caldo. Se coltura per lunghi periodi di tempo, il giorno 4, sostituire la metà dei media con CM caldo. Per altamente purificato culture neuronali, inibitore della 5-mitotico FDU (concentrazione finale 10 micron) possono essere aggiunte in DIV2 per inibire la non proliferazione delle cellule neuronali (cioè durante DIV2-3). Dopo il recupero di CM per 2 giorni, le cellule sono impulsi nuovamente trattati con 5-FDU per altri 2 giorni (DIV 6-7) seguito da un cambiamento di terreno completo. In seguito, sostituire la metà della media con fresco, CM calda ogni 3-4 giorni. I neuroni sono vitali per un massimo di 4 settimane. </li></ol> Aggregati preparazione e placcatura <ol><li> Sospendere le cellule dissociate in media NBB27/DMEM contenente 1x Sato, 10ng/ml CNTF e 10μM forskolina ad una densità di 2x10 6 cellule / ml </li><li> Trasferimento 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una non rivestito da 6 pozzetti </li><li> Cultura per 3 notti. Ogni giorno, risospendere delicatamente le cellule una volta con un Pipetman P1000 Nota: Le cellule iniziano a formare aggregati (Figura 1). </li><li> Il giorno prima della placcatura aggregato, cappotto piastra / coprioggetto con Matrigel: <ul><li> Diluire la Matrigel (fattore di crescita ridotta, BD Biosciences 354230) 1:20 con DMEM freddo sul ghiaccio Nota: aliquote Matrigel devono essere preparati per ogni protocollo del produttore. Tutte le punte, tubi Eppendorf e soluzioni per rendere aliquote dello stock dovrebbe essere fredda per evitare la polimerizzazione Matrigel. Aliquote di Matrigel sono conservati a -80 ° C e scongelato a 4 ° C. </li><li> Cappotto in precedenza PDL rivestite coprioggetto con 300μl/well della soluzione diluita Matrigel durante la notte a 37 ° C incubatore </li><li> Lavare con PBS caldo, quindi lavare con piastra calda sterile DDH 2 O e lasciare le piastre in incubatrice. </li></ul></li><li> 3 giorni dopo la formazione di aggregati, risospendere delicatamente le cellule di nuovo e setaccio la sospensione attraverso una maglia 200μm in un tubo da 50 ml Falcon. Lasciare aggregati di depositarsi sul fondo della provetta per gravità (~ 3-5min) </li><li> Rimuovere con cura surnatante </li><li> Aggiungere mezzo, risospendere delicatamente gli aggregati e lasciarli depositare di nuovo. Ripetere questa operazione più volte per rimuovere le cellule morte, le singole cellule e detriti. Usa microscopio per verificare se il supernatante contengono ancora non aggregata cellule e detritis </li><li> Risospendere delicatamente gli aggregati nel medio NBB27/DMEM stesso (Figura 1) e numero di aggregati </li><li> Regolare la densità di aggregati per circa 25-30 aggreggats/50ul </li><li> Aliquote di trasferimento (500-1000μl) della sospensione aggregato di 2ml provette Eppendorf per la placcatura Nota: poiché aggregati tendono a stabilirsi sul fondo dei tubi, è fondamentale per rendere più tubi della sospensione aggregato per la placcatura. Risospendere delicatamente gli aggregati spesso prima di loro semina su vetrini rivestiti o piastre di coltura per assicurare numero simile di aggregati placcato su ogni vetrino. </li><li> Estrarre la piastra di coltura contenente Matrigel rivestite coprioggetti dai incubatrice. Rimuovere la soluzione da ogni pozzetto, lavare i coprioggetti con caldo PBS e DDH 2 O, e poi brevemente a secco. Essi sono ora pronti per la semina aggregato </li><li> Invertire una provetta contenente sospensione aggregata per consentire loro di essere distribuiti in modo uniforme prima della semina. Carico 50μl di sospensione aggregato al centro di ogni coprioggetto, e gentilmente messo la piastra posteriore per incubatrice senza alcun disturbo per consentire ulteriori aggregazioni di collegare in modo uniforme alla coprioggetto Nota: La densità degli aggregati è fondamentale. Se aggregati sono seminati troppo vicini gli uni agli altri o se la densità di semina è alta, tendono a fondersi man mano che crescono. </li><li> Aggiungi DMEM/NBB27medium aggiuntivi (500 microlitri) in ogni pozzetto 4-6 ore più tardi o la mattina presto </li><li> Per mantenere la cultura aggregato, la metà cambiare mezzo ogni 3-4 giorni. Quando il cambiamento medio, fare attenzione a non disturbare gli aggregati e questo è fatto da dolci aggiungendo medio lungo la parete del pozzo. Nota: Poche ore dopo aggregati attaccato alla piastra, crescita dei neuriti dagli aggregati possono essere osservati. Assoni crescere rapidamente nelle prime due settimane e formare connessioni abbondante tra gli aggregati (Figura 2). Progenitori gliali migrano radialmente fuori degli aggregati e si differenziano nel tempo in astrociti e oligodendrociti maturi. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Contrasto di fase immagini di cellule che formano aggregati in giorni diversi e aggregati dopo il lavaggio. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Contrasto di fase le immagini di una cultura aggregato 2 e 12 giorni dopo seminato su Matrigel rivestite coprioggetto.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Primi studi riportavano la formazione di sinapsi e mielina maturo in rotazione-mediata culture senza aggregato galleggianti 1. L&#39;aggregato SNC sistema di coltura qui descritto combina senza siero crescita delle cellule progenitrici multipotenti aggregati in tre dimensioni con la comodità di culture tradizionali in 2D per facilitare le analisi dello sviluppo delle cellule, la migrazione e la differenziazione in vitro. Il sistema può essere modificato e utilizzato per precursore neuronali ricerca s...

preparazione delle culture del cervello di ratto aggregati per neuron e studi sullo sviluppo glia

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Un sistema in vitro che ricapitola lo sviluppo e la differenziazione dei progenitori in neuroni maturi e glia nel sistema nervoso centrale (SNC) potrebbe fornire una piattaforma potente per i neuroscienziati di indagare AXO-gliali interazioni, le proprietà e la differenziazione di cellule progenitrici multipotenti, e la progressione della oligodendrogliale cellule lignaggio a livello cellulare e molecolare. Descriviamo qui un aggregato SNC sistema di coltura da forebrains ratto embrionale, che può essere mantenuta in un mezzo privo di siero fino a 3-4 settimane ed è utilizzato nel nostro laboratorio come modello per lo studio dei neuroni-glia l&#39;interazione e la mielinizzazione del SNC. Questo video verrà illustrato come isolare e coltivare queste aggregato SNC culture E16 cervello di ratto. Inoltre, dalla dissezione del cervello stesso, altamente arricchito regolare culture neuronali dissociate possono essere ottenuti facilmente e utilizzati per vari studi sui neuroni del SNC o utilizzato per co-culture con altre cellule.

Un protocollo per un sistema embrionale del cervello di ratto cultura globale è descritto. Progenitori multipotenti negli aggregati in grado di sviluppare e differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti.

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

Un sistema in vitro che recapitola lo sviluppo e la differenziazione dei progenitori in neuroni e glia maturi nel sistema nervoso centrale (SNC) ...

Presentiamo un sistema per la coltura di progenitori neuroepiteliali del sistema nervoso centrale mentre si sviluppano e si differenziano in neuroni e glia maturi. La procedura inizia con l'isolamento di quattro cervelli da feti di ratto al giorno E16 e la loro digestione con propano. I tessuti vengono sospesi in una sospensione di singole cellule, filtrati, contati e distribuiti in una piastra a sei pozzetti.Le cellule della piastra sono risospese delicatamente una volta al giorno per due o tre giorni per favorire la formazione di aggregati. Gli aggregati vengono quindi raccolti e filtrati attraverso una maglia da 200 micrometri e i piccoli grumi e i detriti cellulari sono rimossi mediante lavaggio. Infine, gli aggregati vengono contati e seminati su coprislip rivestiti con matrigel.Ciao, sono Coto del laboratorio del Dottor John L del Dipartimento di Scienze Bioscienze Veterinarie Integrate della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per colture di aggregati cerebrali. Utilizziamo questo procedimento nel nostro livello tre per studiare la linea endocitica, lo sviluppo cellulare e le interazioni accelerate.Iniziamo. Prima di cominciare, preparate sul bancone strumenti sterilizzati, etanolo al 70%, un tappetino assorbente su cui lavorare e piastre di Petri da 10 centimetri per la dissezione. Il mezzo deve essere tenuto sul ghiaccio.Nella cappa, preparare un microscopio stereoscopico con una piattaforma di ghiaccio e diverse capsule Petri da 10 centimetri contenenti mezzo di dissezione, anch'esse poste sul ghiaccio. Infine, preparare le soluzioni da utilizzare e riscaldare il mezzo di semina a 37 gradi in un bagno termico. Si inizia questo protocollo isolando embrioni al giorno embrionale 16 (E16) da un ratto Sprague Dawley.Prima di tutto, eutanasia una femmina gravida seguendo una procedura approvata dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Posiziona il ratto eutanasizzato su un tappetino assorbente e spruzza alcol sull'addome per pulirlo. Successivamente, utilizza una pinzetta per sollevare la cute addominale e, con l'altra mano, usa le forbici per tagliare soltanto la cute, allarga la cute separandola, quindi utilizza un altro paio di pinzette e forbici sterili per tagliare attraverso lo strato muscolare.Successivamente, rimuovere l'utero e trasferirlo in una piastra da 10 centimetri contenente mezzo di dissezione freddo di ghiaccio. Il passaggio successivo avviene nella cappa utilizzando forbici da dissezione microchirurgiche. Rimuovere con attenzione ogni embrione dall'utero.Ora è il momento di raccogliere e iniziare. Lavorare con i cervelli embrionali. Estrarre il cervello da ciascun embrione e posizionare i cervelli isolati in una piastra pulita da 10 centimetri contenente mezzo di dissezione, posta su una piattaforma di ghiaccio. Al microscopio stereoscopico, completare la dissezione dei cervelli.Rimuovere le sezioni del mesencefalo e del romboencefalo. Utilizzare pinzette fini per rimuovere le meningi e trasferire ciò che resta del proencefalo in un tubo falcon da 50 millilitri contenente mezzo di dissezione. Ora il tessuto è pronto per il passaggio successivo.Dissociazione delle cellule mediante digestione enzimatica. Poco prima di iniziare la digestione, preparare soluzioni fresche di inibitore della proteasi e inibitore della tripsina. Sterilizzarle e riscaldarle a 37 gradi Celsius in un bagno termico.Rimuovere il mezzo in eccesso dai cervelli dissezionati. Quindi aggiungere quattro millilitri della soluzione digestiva di propano preparata al tubo da 50 millilitri. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius esattamente per cinque minuti.Quando il tempo è scaduto, utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione di propano. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di soluzione fresca di inibitore della tripsina e rimettere il tubo nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per altri due o tre minuti. Quando il tempo è scaduto, rimuovere la soluzione di inibitore della tripsina.Ripetere l'incubazione con la soluzione di inibitore della tripsina altre tre volte. Dopo aver rimosso la soluzione di inibitore della tripsina per l'ultima volta, aggiungere 20 millilitri di mezzo di piastramento pm temperato al tubo.Ora è il momento di ripetere l'operazione e lavare le cellule. Ripetere l'operazione sulle cellule con una pipetta da 10 millilitri fino alla scomparsa di tutti i grumi, per circa 20-30 volte. Quindi centrifugare a cento ×g per sette minuti.A questo punto, le cellule dovrebbero essere ben separate l'una dall'altra. Dopo sette minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo di piastramento per lavare le cellule.Poi centrifugarli nuovamente. Rimuovere il soprannatante e ripetere il lavaggio e la centrifugazione. Procedere dopo il secondo lavaggio.Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura per aggregati, far passare le cellule attraverso un setaccio cellulare da 70 micrometri. Infine, contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro.Ora si è pronti a permettere alle cellule cerebrali dissociate di formare aggregati. Dopo il conteggio, sospendere le cellule dissociate nel mezzo di coltura per aggregati a una densità di due volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Trasferire due millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti non rivestita.Le cellule vengono risospese delicatamente ogni giorno per tre notti. Una volta utilizzata una pipetta P1000, le cellule inizieranno a formare aggregati nel giorno della semina degli aggregati. Dopo che le cellule sono cresciute per tre notti, risospendere nuovamente le cellule delicatamente e filtrare la sospensione attraverso un setaccio da 200 micrometri in un tubo falcon da 50 millilitri.Lasciare sedimentare gli aggregati sul fondo del tubo per circa tre-cinque minuti. Rimuovere quindi con attenzione il soprannatante, aggiungere mezzo di coltura, risospendere delicatamente gli aggregati e lasciarli sedimentare nuovamente. Ripetere questa procedura diverse volte.Per rimuovere le cellule morte, le cellule singole e i detriti, utilizzare il microscopio per verificare se i soprannatanti contengono ancora cellule non aggregate e detriti. Dopo aver lavato accuratamente gli aggregati, risospendere delicatamente questi ultimi nello stesso mezzo e contare gli aggregati per determinarne la concentrazione. Successivamente, regolare la densità degli aggregati a circa 25-30 aggregati per 50 microlitri.Ora è il momento di seminare gli aggregati sui coverslip. Trasferire aliquote da 1000 microlitri della sospensione di aggregati in provette eppendorf da due millilitri; poiché gli aggregati tendono a depositarsi sul fondo delle provette, è fondamentale preparare più provette della sospensione di aggregati per la semina. I coverslip utilizzati in questo passaggio sono rivestiti con matrigel, un substrato per colture cellulari, mediante un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.Dopo aver preparato Alec watts della sospensione aggregata, prelevare la piastra di coltura contenente i coverslip rivestiti con matrigel dall'incubatrice. Rimuovere la soluzione da ciascun pozzetto, lavare i coverslip con PBS caldo e quindi con H2O DD.Sono ora pronti per la semina di aggregati, con cui si seminano i coverslip con gli aggregati. Capovolgere il tubo della sospensione di aggregati per mescolare e distribuire uniformemente gli aggregati. Quindi aggiungere 50 microlitri di sospensione di aggregati al centro di ogni coverslip.Rimettere delicatamente la piastra nell'incubatore senza ulteriori disturbi, in modo che gli aggregati si attacchino uniformemente al coverslip. La densità degli aggregati è cruciale: se gli aggregati sono posizionati troppo vicini tra loro o se la densità di semina è elevata, tendono a fondersi man mano che crescono, quattro-sei ore dopo il posizionamento iniziale. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura in ogni pozzetto.Per mantenere la coltura di aggregati, effettuare un cambio parziale del mezzo ogni tre o quattro giorni. Quando si cambia il mezzo, aggiungerlo lungo la parete laterale della pozzetta per evitare di disturbare gli aggregati. Alcune ore dopo che gli aggregati si sono attaccati al vetrino, si possono osservare fuoriuscite di neuriti dagli aggregati.Gli assoni crescono rapidamente nelle prime due settimane e formano numerose connessioni tra gli aggregati. I progenitori di Ggl migrano radialmente dagli aggregati e nel tempo si differenziano in astrociti e oligodendrociti maturi. Vi abbiamo appena mostrato come coltivare l'aggregato CS.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di indicare correttamente la capacità e di distribuire uniformemente l'aggregato. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Questo articolo descrive il protocollo per la coltura a bassa densità primari neuroni ippocampali crescono su vetrini invertiti su un monostrato gliale. Gli strati neuroni e gliali sono separati da perline di cera di paraffina. I neuroni coltivati ​​con tale metodo adatto per imaging ottico ad alta risoluzione e saggi funzionali.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Questo articolo descrive l'isolamento e la tatura dei neuroni simpatici del ratto embrionale dai gangli cervicali superiori. Fornisce anche protocolli dettagliati per la colorazione immunocitomica e per la preparazione di estratti neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.

Ticare i neuroni simpatici dei ratti da Ganglia cervicale superiore embrionale per l'analisi morfologica e proteomica

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Impara a preparare culture aggregate di cervello di ratto per studiare lo sviluppo neuronale e gliale. Questo metodo consente di osservare la differenziazione dei progenitori multipotenti in neuroni, astrociti e oligodendrociti.

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

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