Name: Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Impara a visualizzare l'esocitosi delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina di pesce rosso usando la microscopia TIRF. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori in tempo reale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH di Grant EY 14990.

Parte 1: Dissection e cella di isolamento bipolare <ol><li> Preparare le soluzioni di cui alla tabella 2; Il pH delle suonerie &#39;(esterni) le soluzioni devono essere regolato a 7,4 con NaOH e il pH della soluzione interna deve essere regolato a 7,2 con CsOH. Proteggere la soluzione dalla luce interna con foglio di alluminio e conservarlo a 4 ° C fino all&#39;utilizzo; </li><li> Dark-adattare un pesce rosso per almeno 30 minuti prima della dissezione; </li><li> Mentre l&#39;animale scuro si adatta, preparare 5 ml di ialuronidasi (ialuronidasi tipo V, 1100 unità / mL in basso Ca 2 + Ringer, Sigma, St. Louis, MO) e 10 mL di L-cisteina (0,5 mg / mL in basso Ca 2 + Ringer) soluzioni e pesare la papaina (polvere liofilizzata, 40 unità / ml; Sigma, St. Louis, MO) per 5 ml di soluzione digestione; </li><li> Euthanize il pesce rosso per decapitazione veloce con le forbici chirurgiche e distruggere il cervello e il midollo spinale con una lama di bisturi # 11; </li><li> Rimuovere gli occhi distruggendo i muscoli extraoculari con l&#39;aiuto di una pinza # 7 curve Dumont e il taglio del nervo ottico con le forbici iris; </li><li> Mettere una lampadina occhio su un pezzo di carta da filtro e forare il limbo sclerale con la punta della lama di un bisturi # 11; </li><li> Introdurre la lama di un paio di forbici Vännäs all&#39;interno del tutto forato e tagliato l&#39;intero segmento anteriore lontano; </li><li> Posizionare un piccolo pezzo di carta da filtro in cima alla coppa rimanenti ottica ed esercitare una certa pressione al fine di avere la carta bagnare con vitreo; </li><li> Sollevare la carta da filtro con la retina ad esso e tagliare il nervo ottico con un par di forbici Vännäs; </li><li> Trasferire il filtro contenente la retina in un piatto di plastica 35 millimetri con soluzione cultura ialuronidasi e staccare la retina dalla carta da filtro con l&#39;aiuto di pinzette Dumont # 7; </li><li> Tagliare la retina in 4-6 pezzi con metà di un industriale in acciaio al carbonio singolo taglio della lama e lasciare riposare nella soluzione ialuronidasi per 20 minuti; </li><li> In attesa di ialuronidasi abbiano effetto, aggiungere 5 ml di L-cisteina soluzione alla papaina e lasciare riposare fino a quando il liquido diventa trasparente (circa 5-10 minuti); </li><li> Lavate i pezzi di retina 3x a basso Ca 2 + Ringer e farli sedere nella soluzione di papaina per 30-35 minuti; </li><li> Lavate i pezzi di retina 3x a basso Ca 2 + Ringer e conservarli fino al momento dell&#39;uso a 4 ° C in un piatto da 35 millimetri cultura di plastica contenente basso Ca 2 + di Ringer; </li><li> Dissociare le cellule, mettere un pezzo di retina in una provetta contenente 500 ml di basso Ca 2 + Ringer e lentamente triturare la retina pipettando su e giù con una dissociazione pipetta di vetro, con attenzione per non produrre eventuali bolle d&#39;aria. Pipette dissociazione sono fabbricati con il riscaldamento fino alla punta di una pipetta Pasteur di vetro con un becco Bunsen e piegando leggermente con l&#39;aiuto di pinze anatomiche; </li><li> Piastra le cellule isolate aggiungendo una goccia di sospensione della retina ad un fatto in casa da camera di registrazione precedentemente riempiti con 2 ml di basso Ca 2 + Ringer. La camera è costituito dalla metà inferiore di un 35 mm, piatto di plastica con la cultura nel suo complesso circolare nel mezzo e un coprioggetto circolare in vetro di 1,78 indice di rifrazione (PlanOptik, Germania) incollati al fondo con un elastomero di silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Parte 2: cella di carico bipolare e Wash Out TIRF immagini delle vescicole sinaptiche è meglio effettuato con un obiettivo di tipo TIRFM microscopio con un obiettivo molto alto NA e una macchina fotografica sensibile. Per i nostri esperimenti, abbiamo scelto di usare un obiettivo NA 1,65 (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Giappone) con un EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). L&#39;uso del obiettivo molto alto NA richiede l&#39;uso di coprioggetto di vetro ad alta rifrazione e fluido ad immersione (di-iodomethane con lo zolfo). Nelle nostre condizioni, luce di eccitazione è limitato a un campo diminuisce in modo esponenziale con una lunghezza costante di circa 50 nm. <ol><li> Aggiungere una goccia di liquido ad alto indice di rifrazione (serie M, indice di rifrazione = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) con l&#39;obiettivo microscopio; </li><li> Posizionare la camera di registrazione con attenzione sulla parte superiore del microscopio e l&#39;obiettivo con cura il montaggio dell&#39;elettrodo di massa e l&#39;uscita del tubo superfusione alla camera; </li><li> Lasciate camera di sedersi sul microscopio per 10-20 minuti per consentire alle cellule di affondare e di aderire al fondo; </li><li> Nel frattempo, preparare 5 ml di una Trolox 1mM ® ((±)- 6-idrossi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbossilico, Sigma, St. Louis, MO) una soluzione di alta K + Ringer . Sonicare fino a completa dissoluzione; </li><li> Preparare 15 mL di ADVASEP-7 soluzione di lavaggio: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) a basso Ca 2 + Ringer. Si noti che ADVASEP-7 uso è facoltativo e può essere omesso se lo si desidera; </li><li> Spurgare il li superfusionesoluzione NES e aggiungere ADVASEP-7 di lavaggio, basso Ca 2 + suoneria e il controllo della suoneria al sistema superfusione; </li><li> Tirare carico pipette da pareti sottili in vetro borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Puffer resistenze pipetta sono nella gamma 1,5-2,5 MΩ; </li><li> Preparare la FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro &quot;confezione speciale&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA) soluzioni. In primo luogo, fare un 1 mM magazzino con l&#39;aggiunta di 160 microlitri di acqua distillata per un flaconcino (100 mg) di FM1-43 ®. Questo stock può essere conservato a 4 ° C per un massimo di una settimana. Poi, aggiungere 5 ml di FM1-43 ® a 1 ml di alta K + suoneria + di 1 mM Trolox ®. Proteggere la soluzione dalla luce con un foglio di alluminio e conservarlo a 4 ° C fino all&#39;utilizzo; </li><li> Girare la brillante luce campo ottico e la ricerca delle cellule bipolari intatto. Leggermente toccare il microscopio per fare in modo che i neuroni sono saldamente attaccato al fondo della camera; </li><li> Posizionare la penna superfusione vicino alla cella di interesse e profumato continua la preparazione con un basso Ca 2 + Ringer; </li><li> Spegnere le luci della stanza e aggiungere un filtro passa lunghe rosso (cioè RG630, Schott, Germania) per il percorso ottico per ridurre al minimo l&#39;eccitazione del colorante FM; </li><li> Riempire una pipetta di carico con 10 microlitri della soluzione colorante FM, montare la pipetta nel micromanipolatore e abbassare la pipetta sulla preparazione senza sovrapressione fino a quando non è sullo stesso piano focale, come la cellula bipolare che si desidera caricare. Assicurarsi di avere almeno due portaelettrodi: quello usato per la tintura FM non può essere utilizzato per la patch di bloccaggio, altrimenti potrebbero contaminare la soluzione intracellulare; </li><li> Posizionare l&#39;apertura palla a una distanza di circa 10 micron dal terminale dell&#39;assone, spegnere il sistema superfusione off e sfoglia la soluzione colorante per 10 secondi, girando la sovrapressione pipetta sulla; </li><li> Girare la sovrapressione off e, senza muovere la pipetta, attendere per 30 secondi; </li><li> Girare il superfusione su e fare il bagno della camera in ADVASEP-7 soluzione per 5 minuti. Nel frattempo, togliere la pipetta palla dal bagno; </li><li> Dopo 5 minuti, passare al basso Ca 2 + suoneria e profumato della camera per 25-30 minuti per permettere la rimozione del colorante in eccesso. </li></ol> Parte 3: Patch di serraggio e TIRFM Imaging <ol><li> Mentre la preparazione sta lavando fuori, tirare pipette patch da pareti spesse in vetro borosilicato (B150-86-10; Instrument Company Sutter, Novato, CA). Patch resistenze pipetta sono MΩ 8-10 gamma; </li><li> Dopo wash out è completa, posizionare il terminale assone al centro del campo di vista; </li><li> Riempire una pipetta di patch con 7μL di soluzione interna, toccare la pipetta per liberarsi di bolle d&#39;aria, cappotto la pipetta con fuso impronte dentarie (Sticky Cera; Kerr Corporation, Orange, CA) e montarlo nel micromanipolatore; </li><li> Girare la sovrapressione pipetta sulla e abbassare la pipetta lentamente sulla preparazione. Controllare la resistenza pipetta in dell&#39;amplificatore e offset pipetta corretta e capacità con i controlli amplificatore rispettive; </li><li> Accendere il superfusione per controllare la suoneria. Per creare un gigaseal tra la pipetta e la cellula, un po &#39;toccare la punta dell&#39;elettrodo contro il corpo cellulare e girare la sovrapressione pipetta off mentre delicatamente applicando una pressione negativa per l&#39;elettrodo; </li><li> Mentre sigillato, scegliere &quot;a cellula intera&quot; modalità dell&#39;amplificatore e impostare la cella di detenzione potenziale a -60 mV; </li><li> Scegli una regione di interesse con il software di imaging che comprende tutto il terminal assone, spegnere la luce campo e fuori, con una breve esposizione (30 ms) il terminale al laser 488 nm, trovare il giusto piano focale per TIRF per immagini; </li><li> Pausa nella cella utilizzando il comando &quot;zap&quot; dell&#39;amplificatore, mentre applicando una pressione leggermente negativa per la pipetta; </li><li> Corretto per capacità delle cellule e la resistenza serie, e quindi applicare il protocollo di tensione di interesse, mentre l&#39;imaging del movimento delle vescicole sinaptiche. E &#39;in questa fase importante avere il protocollo di tensione sincronizzato con il frame rate della telecamera. Nel nostro caso, ogni fotogramma è di 30 ms lunga, quindi i cambiamenti di tensione si verificano in multipli di questo valore (cioè ogni 300 ms o 10 fotogrammi); </li><li> Attendere almeno 40 secondi tra le prove per consentire il recupero; </li><li> Per controllare la posizione dei nastri sinaptici, scattare foto mentre si accende il laser a 561 nm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: Il setup sperimentale. Un laser a 488 nm (blu) è focalizzata alla periferia del piano focale posteriore dell&#39;obiettivo e soffre riflessione interna totale quando raggiunge il vetro acquoso interfaccia media. Il campo elettromagnetico generato dal raggio riflesso eccita il fluoroforo caricato nel vescicole sinaptiche più vicino al bottom della camera di vetro, che poi fluorescenti (verde). La luce fluorescente viene poi guidato all&#39;occhio dell&#39;osservatore (raffigurato) o di una telecamera CCD. Il potenziale di membrana delle cellule è controllata ripreso contemporaneamente da loro patch-bloccaggio. Questo approccio permette lo studio del rapporto tra i segnali in arrivo (la tensione di membrana) e l&#39;uscita neuronale (esocitosi). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2: I risultati tipici. Sinistra: immagine in campo chiaro di una cellula isolata bipolare pesci rossi. In alto a destra: immagine TIRF delle vescicole sinaptiche nel terminale assone delle cellule bipolari caricato con FM 1-43 ® e ripreso con il nm laser 488 (FM colorante). In basso a destra: l&#39;immagine del terminale stesso dopo aver patchato la cellula e di imaging il terminale assone con il laser a 561 nm. Nastri sinaptici sono etichettati dalla rodamina-based Ribeye di legame peptidico (Rpep_rhod). Tabella 1: Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Fabbricante </td><td> Catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Tabella </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscopio invertito </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> Dotato di una lampada al tungsteno per campo chiaro e una porta laterale per l&#39;apertura TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Alimentazione lampada </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dicroico Filtro </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Emissione Filtro </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O HR </td><td> Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Glass Filter </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm laser </td><td> Coerente </td><td> - </td><td> Uso alla minima potenza </td></tr><tr><td> - </td><td> Otturatore </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Shutter driver </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm laser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Otturatore </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Shutter driver </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusione pressione Kit </td><td> Superfusione sistema </td><td> Automatizzare scientifico </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusione Penna </td><td> Superfusione sistema </td><td> Automatizzare scientifico </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Superfusione System Controller </td><td> Automatizzare scientifico </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM CCD </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7,1 </td><td> Imaging Software </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Patch Morsetto Amplificatore </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Impulso </td><td> Amplificatore Software </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipolatore </td><td> Sutter strumento </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Porta elettrodo </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> Per 1,5 mm di diametro in vetro, 2 unità </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Capillare di vetro borosilicato </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Senza filamento </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Capillare di vetro borosilicato </td><td> Sutter strumento </td><td> - </td><td> Con filamento </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Microelettrodo Puller </td><td> Sutter strumento </td><td> - </td><td> Dotato di filamento box 3x3 e camera ambientale </td></tr><tr><td> - </td><td> Pressione pompa a vuoto d&#39;aria </td><td> Thomas scientifico </td><td> 7893B05 </td><td> Crea vuoto per rimuovere i liquidi da camera e sovrapressione per pipette </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Software per l&#39;analisi </td><td> The MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> Piatti 35 millimetri Cultura Plastica </td><td> Falco </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Alto indice di rifrazione di vetro </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Indice di rifrazione 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Serie M </td><td> Alto indice di rifrazione liquido </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Indice di rifrazione = 1.78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Silicone elastomero Kit </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatione </td><td> Tripeptide </td><td> EMD chimici </td><td></td><td> Libero radical scavenger </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> Enzima </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tipo V </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Amino Acid </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Attiva la papaina </td></tr><tr><td> Papaina </td><td> Enzima </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> Dalla Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Solubile vitamina E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Scavenger radicali liberi </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Solfonati B-ciclodestrina derivati </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Riduce FM 1-43 ® fluorescenza di fondo </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Colorante fluorescente </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Confezione speciale&quot; </td></tr><tr><td> Cera appiccicoso </td><td> Pipetta di rivestimento agente </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Diminuisce la capacità pipetta </td></tr></tbody></table> Tabella 2: soluzioni fisiologiche utilizzate in questo studio. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> Basso Ca 2 + Ringer </td><td> Controllo di Ringer </td><td> Alta K + Ringer </td><td> Soluzione interna </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mm </td><td> 120 mm </td><td> 97,5 mm </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mm </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatione </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> * CH 3 CSO 3 S </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 mL </td><td> 100 ml </td><td> 5 microlitri </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> * Metanosolfonato cesio. ** Ribeye vincolante peptide: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

I vantaggi di tipo oggettivo-microscopia TIRF sono che: 1) fornisce un&#39;eccellente sezionamento ottico limitando luce di eccitazione ad una regione ristretta all&#39;interno del piano focale dell&#39;obiettivo, minimizzando così out-of-focus luce, 2) in quanto la luce diminuisce esponenzialmente con la distanza , il movimento in direzione verticale può essere monitorato come un cambiamento di intensità di fluorescenza, 3) la raccolta efficiente luce attraverso l&#39;obiettivo ad alta apertura numerica 1,5. Il principal...

esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è una tecnica che permette lo studio di eventi che accadono a livello della membrana cellulare, con immagini selettivo di molecole fluorescenti che sono più vicini ad una sostanza alto indice di rifrazione come il vetro<sup&gt; 1</sup&gt;. In questo articolo, si applica questa tecnica per esocitosi immagine delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina isolata dalla retina pesci rossi. Questi neuroni sono molto adatti per questo tipo di studio a causa della loro terminali degli assoni di grandi dimensioni. Contemporaneamente cerotto di fissaggio le cellule bipolari, è possibile indagare il rapporto tra pre-sinaptica di tensione e rilascio sinaptico<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Vescicole sinaptiche terminali all&#39;interno delle cellule del bipolare sono caricati con un colorante fluorescente (FM 1-43 ®) per co-sbuffando il colorante e una soluzione contenente una suoneria alta K<sup&gt; +</supConcentrazione&gt; sui terminali sinaptici. Questo depolarizza le cellule e stimola endocitosi e conseguente assorbimento colorante in vescicole glutamatergica. Dopo aver lavato il colorante in eccesso per circa 30 minuti, le cellule sono pronte per essere cerotto bloccato e ripreso in contemporanea con un laser a 488 nm. La soluzione contiene una pipetta di patch rodamina basata peptide che si lega selettivamente alla proteina sinaptica Ribeye nastro<sup&gt; 4</sup&gt;, In tal modo l&#39;etichettatura nastri specificamente quando i terminali sono ripreso con un laser a 561 nm. Questo permette la localizzazione precisa delle zone attive e la separazione della sinaptica da eventi extra-sinaptico.

In questo video ci dimostra come etichettare e visualizzare singole esocitosi delle vescicole sinaptiche e la tratta di pesci rossi cellule bipolari della retina mediante fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è una tecnica che permette lo studio di eventi che avvengono a livello della membrana cellulare, attraverso la selezione...

Questa procedura inizia con la dissezione della retina neurale del pesce rosso adulto, che è il tessuto nervoso situato nella parte posteriore dell'occhio. Le retine vengono poste in una soluzione enzimatica per 35 minuti, risciacquate e triturate con una pipetta di vetro levigata a fiamma per dissociare le cellule. Le cellule vengono quindi seminate su coprivetri di vetro ad alto indice di rifrazione e montate in piatti di plastica per colture cellulari.I neuroni bipolari isolati vengono identificati in base alla loro morfologia distinta per caricare i terminali. Viene erogata una puffata per 10 secondi con una soluzione contenente FM 1-43 e si attendono 30 secondi prima di rimuovere il colorante. Dopo un lavaggio di 30 minuti, le cellule vengono sottoposte a patch clamp e analizzate mediante microscopia TIRF.Ciao, mi chiamo Christina Jovi del laboratorio ZEC del Dipartimento di Fisiologia Cellulare e Molecolare della Scuola di Medicina dell'Università di Yale. Oggi vi mostreremo un procedimento per studiare l'esocitosi in cellule bipolari retiniche vive mediante microscopia turf. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare i meccanismi del rilascio sinaptico.Inizi

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Biologia

Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Fonte: Daniele, F., et. al Sonde TIRFM e GFP sensibili al pH per valutare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y: imaging cellulare e analisi dei dati. J. Vis. Exp. (2015). Questo video mostra l'imaging di cellule di neuroblastoma umano utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare vescicole sinaptiche marcate con fluorofori. Le cellule vengono prima focalizzate in modalità epifluorescenza.

Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per la visualizzazione di eventi esocitici nei neuroni corticali. Un marcatore di proteina fluorescente verde (GFP) sensibile al pH emette fluorescenza dopo la fusione delle vescicole, con eccitazione...

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici 

Basato polarizzazione-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) permette un rilevamento in tempo reale della dinamica della membrana cellulare. Questo articolo descrive l'implementazione di pTIRFM per lo studio della membrana rimodellamento durante l'esocitosi regolata. La tecnica è generalizzabile ad altri processi in biologia cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente cambiamenti di forma della membrana.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Qui abbiamo dettaglio un metodo per l'imaging di cellule vive di esocitosi regolata. Questo metodo utilizza FITC-Destrano, che si accumula in organelli lisosoma-correlati, come reporter. Questo semplice metodo permette anche di distinguere tra diverse modalità di esocitosi regolata in cellule che sono difficili da manipolare geneticamente.

FITC-Destrano di imaging come Reporter per esocitosi regolata

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Questo lavoro presenta una preparazione alternativa della retina flatmount in cui la rimozione dei corpi cellulari dei fotorecettori consente una diffusione più rapida degli anticorpi e un migliore accesso con pipette patch ai neuroni retinici interni per esperimenti di immunoistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.

Retina divisa come preparazione flatmount migliorata per lo studio dei neuroni dello strato nucleare interno nella retina dei vertebrati

Questo articolo dimostra un metodo per visualizzare e quantificare la motilità della microglia e il contatto con i punti postsinaptici nella retina utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia e delle interazioni con le sinapsi nella retina murina malata

Impara a visualizzare l'esocitosi delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina di pesce rosso usando la microscopia TIRF. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori in tempo reale.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

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