Name: Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Impara a visualizzare l'esocitosi delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina di pesce rosso usando la microscopia TIRF. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori in tempo reale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH di Grant EY 14990.

Parte 1: Dissection e cella di isolamento bipolare <ol><li> Preparare le soluzioni di cui alla tabella 2; Il pH delle suonerie &#39;(esterni) le soluzioni devono essere regolato a 7,4 con NaOH e il pH della soluzione interna deve essere regolato a 7,2 con CsOH. Proteggere la soluzione dalla luce interna con foglio di alluminio e conservarlo a 4 ° C fino all&#39;utilizzo; </li><li> Dark-adattare un pesce rosso per almeno 30 minuti prima della dissezione; </li><li> Mentre l&#39;animale scuro si adatta, preparare 5 ml di ialuronidasi (ialuronidasi tipo V, 1100 unità / mL in basso Ca 2 + Ringer, Sigma, St. Louis, MO) e 10 mL di L-cisteina (0,5 mg / mL in basso Ca 2 + Ringer) soluzioni e pesare la papaina (polvere liofilizzata, 40 unità / ml; Sigma, St. Louis, MO) per 5 ml di soluzione digestione; </li><li> Euthanize il pesce rosso per decapitazione veloce con le forbici chirurgiche e distruggere il cervello e il midollo spinale con una lama di bisturi # 11; </li><li> Rimuovere gli occhi distruggendo i muscoli extraoculari con l&#39;aiuto di una pinza # 7 curve Dumont e il taglio del nervo ottico con le forbici iris; </li><li> Mettere una lampadina occhio su un pezzo di carta da filtro e forare il limbo sclerale con la punta della lama di un bisturi # 11; </li><li> Introdurre la lama di un paio di forbici Vännäs all&#39;interno del tutto forato e tagliato l&#39;intero segmento anteriore lontano; </li><li> Posizionare un piccolo pezzo di carta da filtro in cima alla coppa rimanenti ottica ed esercitare una certa pressione al fine di avere la carta bagnare con vitreo; </li><li> Sollevare la carta da filtro con la retina ad esso e tagliare il nervo ottico con un par di forbici Vännäs; </li><li> Trasferire il filtro contenente la retina in un piatto di plastica 35 millimetri con soluzione cultura ialuronidasi e staccare la retina dalla carta da filtro con l&#39;aiuto di pinzette Dumont # 7; </li><li> Tagliare la retina in 4-6 pezzi con metà di un industriale in acciaio al carbonio singolo taglio della lama e lasciare riposare nella soluzione ialuronidasi per 20 minuti; </li><li> In attesa di ialuronidasi abbiano effetto, aggiungere 5 ml di L-cisteina soluzione alla papaina e lasciare riposare fino a quando il liquido diventa trasparente (circa 5-10 minuti); </li><li> Lavate i pezzi di retina 3x a basso Ca 2 + Ringer e farli sedere nella soluzione di papaina per 30-35 minuti; </li><li> Lavate i pezzi di retina 3x a basso Ca 2 + Ringer e conservarli fino al momento dell&#39;uso a 4 ° C in un piatto da 35 millimetri cultura di plastica contenente basso Ca 2 + di Ringer; </li><li> Dissociare le cellule, mettere un pezzo di retina in una provetta contenente 500 ml di basso Ca 2 + Ringer e lentamente triturare la retina pipettando su e giù con una dissociazione pipetta di vetro, con attenzione per non produrre eventuali bolle d&#39;aria. Pipette dissociazione sono fabbricati con il riscaldamento fino alla punta di una pipetta Pasteur di vetro con un becco Bunsen e piegando leggermente con l&#39;aiuto di pinze anatomiche; </li><li> Piastra le cellule isolate aggiungendo una goccia di sospensione della retina ad un fatto in casa da camera di registrazione precedentemente riempiti con 2 ml di basso Ca 2 + Ringer. La camera è costituito dalla metà inferiore di un 35 mm, piatto di plastica con la cultura nel suo complesso circolare nel mezzo e un coprioggetto circolare in vetro di 1,78 indice di rifrazione (PlanOptik, Germania) incollati al fondo con un elastomero di silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Parte 2: cella di carico bipolare e Wash Out TIRF immagini delle vescicole sinaptiche è meglio effettuato con un obiettivo di tipo TIRFM microscopio con un obiettivo molto alto NA e una macchina fotografica sensibile. Per i nostri esperimenti, abbiamo scelto di usare un obiettivo NA 1,65 (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Giappone) con un EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). L&#39;uso del obiettivo molto alto NA richiede l&#39;uso di coprioggetto di vetro ad alta rifrazione e fluido ad immersione (di-iodomethane con lo zolfo). Nelle nostre condizioni, luce di eccitazione è limitato a un campo diminuisce in modo esponenziale con una lunghezza costante di circa 50 nm. <ol><li> Aggiungere una goccia di liquido ad alto indice di rifrazione (serie M, indice di rifrazione = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) con l&#39;obiettivo microscopio; </li><li> Posizionare la camera di registrazione con attenzione sulla parte superiore del microscopio e l&#39;obiettivo con cura il montaggio dell&#39;elettrodo di massa e l&#39;uscita del tubo superfusione alla camera; </li><li> Lasciate camera di sedersi sul microscopio per 10-20 minuti per consentire alle cellule di affondare e di aderire al fondo; </li><li> Nel frattempo, preparare 5 ml di una Trolox 1mM ® ((±)- 6-idrossi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbossilico, Sigma, St. Louis, MO) una soluzione di alta K + Ringer . Sonicare fino a completa dissoluzione; </li><li> Preparare 15 mL di ADVASEP-7 soluzione di lavaggio: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) a basso Ca 2 + Ringer. Si noti che ADVASEP-7 uso è facoltativo e può essere omesso se lo si desidera; </li><li> Spurgare il li superfusionesoluzione NES e aggiungere ADVASEP-7 di lavaggio, basso Ca 2 + suoneria e il controllo della suoneria al sistema superfusione; </li><li> Tirare carico pipette da pareti sottili in vetro borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Puffer resistenze pipetta sono nella gamma 1,5-2,5 MΩ; </li><li> Preparare la FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) piridinio dibromuro &quot;confezione speciale&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA) soluzioni. In primo luogo, fare un 1 mM magazzino con l&#39;aggiunta di 160 microlitri di acqua distillata per un flaconcino (100 mg) di FM1-43 ®. Questo stock può essere conservato a 4 ° C per un massimo di una settimana. Poi, aggiungere 5 ml di FM1-43 ® a 1 ml di alta K + suoneria + di 1 mM Trolox ®. Proteggere la soluzione dalla luce con un foglio di alluminio e conservarlo a 4 ° C fino all&#39;utilizzo; </li><li> Girare la brillante luce campo ottico e la ricerca delle cellule bipolari intatto. Leggermente toccare il microscopio per fare in modo che i neuroni sono saldamente attaccato al fondo della camera; </li><li> Posizionare la penna superfusione vicino alla cella di interesse e profumato continua la preparazione con un basso Ca 2 + Ringer; </li><li> Spegnere le luci della stanza e aggiungere un filtro passa lunghe rosso (cioè RG630, Schott, Germania) per il percorso ottico per ridurre al minimo l&#39;eccitazione del colorante FM; </li><li> Riempire una pipetta di carico con 10 microlitri della soluzione colorante FM, montare la pipetta nel micromanipolatore e abbassare la pipetta sulla preparazione senza sovrapressione fino a quando non è sullo stesso piano focale, come la cellula bipolare che si desidera caricare. Assicurarsi di avere almeno due portaelettrodi: quello usato per la tintura FM non può essere utilizzato per la patch di bloccaggio, altrimenti potrebbero contaminare la soluzione intracellulare; </li><li> Posizionare l&#39;apertura palla a una distanza di circa 10 micron dal terminale dell&#39;assone, spegnere il sistema superfusione off e sfoglia la soluzione colorante per 10 secondi, girando la sovrapressione pipetta sulla; </li><li> Girare la sovrapressione off e, senza muovere la pipetta, attendere per 30 secondi; </li><li> Girare il superfusione su e fare il bagno della camera in ADVASEP-7 soluzione per 5 minuti. Nel frattempo, togliere la pipetta palla dal bagno; </li><li> Dopo 5 minuti, passare al basso Ca 2 + suoneria e profumato della camera per 25-30 minuti per permettere la rimozione del colorante in eccesso. </li></ol> Parte 3: Patch di serraggio e TIRFM Imaging <ol><li> Mentre la preparazione sta lavando fuori, tirare pipette patch da pareti spesse in vetro borosilicato (B150-86-10; Instrument Company Sutter, Novato, CA). Patch resistenze pipetta sono MΩ 8-10 gamma; </li><li> Dopo wash out è completa, posizionare il terminale assone al centro del campo di vista; </li><li> Riempire una pipetta di patch con 7μL di soluzione interna, toccare la pipetta per liberarsi di bolle d&#39;aria, cappotto la pipetta con fuso impronte dentarie (Sticky Cera; Kerr Corporation, Orange, CA) e montarlo nel micromanipolatore; </li><li> Girare la sovrapressione pipetta sulla e abbassare la pipetta lentamente sulla preparazione. Controllare la resistenza pipetta in dell&#39;amplificatore e offset pipetta corretta e capacità con i controlli amplificatore rispettive; </li><li> Accendere il superfusione per controllare la suoneria. Per creare un gigaseal tra la pipetta e la cellula, un po &#39;toccare la punta dell&#39;elettrodo contro il corpo cellulare e girare la sovrapressione pipetta off mentre delicatamente applicando una pressione negativa per l&#39;elettrodo; </li><li> Mentre sigillato, scegliere &quot;a cellula intera&quot; modalità dell&#39;amplificatore e impostare la cella di detenzione potenziale a -60 mV; </li><li> Scegli una regione di interesse con il software di imaging che comprende tutto il terminal assone, spegnere la luce campo e fuori, con una breve esposizione (30 ms) il terminale al laser 488 nm, trovare il giusto piano focale per TIRF per immagini; </li><li> Pausa nella cella utilizzando il comando &quot;zap&quot; dell&#39;amplificatore, mentre applicando una pressione leggermente negativa per la pipetta; </li><li> Corretto per capacità delle cellule e la resistenza serie, e quindi applicare il protocollo di tensione di interesse, mentre l&#39;imaging del movimento delle vescicole sinaptiche. E &#39;in questa fase importante avere il protocollo di tensione sincronizzato con il frame rate della telecamera. Nel nostro caso, ogni fotogramma è di 30 ms lunga, quindi i cambiamenti di tensione si verificano in multipli di questo valore (cioè ogni 300 ms o 10 fotogrammi); </li><li> Attendere almeno 40 secondi tra le prove per consentire il recupero; </li><li> Per controllare la posizione dei nastri sinaptici, scattare foto mentre si accende il laser a 561 nm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: Il setup sperimentale. Un laser a 488 nm (blu) è focalizzata alla periferia del piano focale posteriore dell&#39;obiettivo e soffre riflessione interna totale quando raggiunge il vetro acquoso interfaccia media. Il campo elettromagnetico generato dal raggio riflesso eccita il fluoroforo caricato nel vescicole sinaptiche più vicino al bottom della camera di vetro, che poi fluorescenti (verde). La luce fluorescente viene poi guidato all&#39;occhio dell&#39;osservatore (raffigurato) o di una telecamera CCD. Il potenziale di membrana delle cellule è controllata ripreso contemporaneamente da loro patch-bloccaggio. Questo approccio permette lo studio del rapporto tra i segnali in arrivo (la tensione di membrana) e l&#39;uscita neuronale (esocitosi). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2: I risultati tipici. Sinistra: immagine in campo chiaro di una cellula isolata bipolare pesci rossi. In alto a destra: immagine TIRF delle vescicole sinaptiche nel terminale assone delle cellule bipolari caricato con FM 1-43 ® e ripreso con il nm laser 488 (FM colorante). In basso a destra: l&#39;immagine del terminale stesso dopo aver patchato la cellula e di imaging il terminale assone con il laser a 561 nm. Nastri sinaptici sono etichettati dalla rodamina-based Ribeye di legame peptidico (Rpep_rhod). Tabella 1: Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Fabbricante </td><td> Catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Tabella </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscopio invertito </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> Dotato di una lampada al tungsteno per campo chiaro e una porta laterale per l&#39;apertura TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Alimentazione lampada </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dicroico Filtro </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Emissione Filtro </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O HR </td><td> Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Glass Filter </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm laser </td><td> Coerente </td><td> - </td><td> Uso alla minima potenza </td></tr><tr><td> - </td><td> Otturatore </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Shutter driver </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm laser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Otturatore </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Shutter driver </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusione pressione Kit </td><td> Superfusione sistema </td><td> Automatizzare scientifico </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusione Penna </td><td> Superfusione sistema </td><td> Automatizzare scientifico </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Superfusione System Controller </td><td> Automatizzare scientifico </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM CCD </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7,1 </td><td> Imaging Software </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Patch Morsetto Amplificatore </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Impulso </td><td> Amplificatore Software </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipolatore </td><td> Sutter strumento </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Porta elettrodo </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> Per 1,5 mm di diametro in vetro, 2 unità </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Capillare di vetro borosilicato </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Senza filamento </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Capillare di vetro borosilicato </td><td> Sutter strumento </td><td> - </td><td> Con filamento </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Microelettrodo Puller </td><td> Sutter strumento </td><td> - </td><td> Dotato di filamento box 3x3 e camera ambientale </td></tr><tr><td> - </td><td> Pressione pompa a vuoto d&#39;aria </td><td> Thomas scientifico </td><td> 7893B05 </td><td> Crea vuoto per rimuovere i liquidi da camera e sovrapressione per pipette </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Software per l&#39;analisi </td><td> The MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> Piatti 35 millimetri Cultura Plastica </td><td> Falco </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Alto indice di rifrazione di vetro </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Indice di rifrazione 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Serie M </td><td> Alto indice di rifrazione liquido </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Indice di rifrazione = 1.78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Silicone elastomero Kit </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatione </td><td> Tripeptide </td><td> EMD chimici </td><td></td><td> Libero radical scavenger </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> Enzima </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tipo V </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Amino Acid </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Attiva la papaina </td></tr><tr><td> Papaina </td><td> Enzima </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> Dalla Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Solubile vitamina E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Scavenger radicali liberi </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Solfonati B-ciclodestrina derivati </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Riduce FM 1-43 ® fluorescenza di fondo </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Colorante fluorescente </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Confezione speciale&quot; </td></tr><tr><td> Cera appiccicoso </td><td> Pipetta di rivestimento agente </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Diminuisce la capacità pipetta </td></tr></tbody></table> Tabella 2: soluzioni fisiologiche utilizzate in questo studio. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> Basso Ca 2 + Ringer </td><td> Controllo di Ringer </td><td> Alta K + Ringer </td><td> Soluzione interna </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mm </td><td> 120 mm </td><td> 97,5 mm </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mm </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatione </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> * CH 3 CSO 3 S </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 mL </td><td> 100 ml </td><td> 5 microlitri </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> * Metanosolfonato cesio. ** Ribeye vincolante peptide: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

I vantaggi di tipo oggettivo-microscopia TIRF sono che: 1) fornisce un&#39;eccellente sezionamento ottico limitando luce di eccitazione ad una regione ristretta all&#39;interno del piano focale dell&#39;obiettivo, minimizzando così out-of-focus luce, 2) in quanto la luce diminuisce esponenzialmente con la distanza , il movimento in direzione verticale può essere monitorato come un cambiamento di intensità di fluorescenza, 3) la raccolta efficiente luce attraverso l&#39;obiettivo ad alta apertura numerica 1,5. Il principal...

esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è una tecnica che permette lo studio di eventi che accadono a livello della membrana cellulare, con immagini selettivo di molecole fluorescenti che sono più vicini ad una sostanza alto indice di rifrazione come il vetro<sup&gt; 1</sup&gt;. In questo articolo, si applica questa tecnica per esocitosi immagine delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina isolata dalla retina pesci rossi. Questi neuroni sono molto adatti per questo tipo di studio a causa della loro terminali degli assoni di grandi dimensioni. Contemporaneamente cerotto di fissaggio le cellule bipolari, è possibile indagare il rapporto tra pre-sinaptica di tensione e rilascio sinaptico<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Vescicole sinaptiche terminali all&#39;interno delle cellule del bipolare sono caricati con un colorante fluorescente (FM 1-43 ®) per co-sbuffando il colorante e una soluzione contenente una suoneria alta K<sup&gt; +</supConcentrazione&gt; sui terminali sinaptici. Questo depolarizza le cellule e stimola endocitosi e conseguente assorbimento colorante in vescicole glutamatergica. Dopo aver lavato il colorante in eccesso per circa 30 minuti, le cellule sono pronte per essere cerotto bloccato e ripreso in contemporanea con un laser a 488 nm. La soluzione contiene una pipetta di patch rodamina basata peptide che si lega selettivamente alla proteina sinaptica Ribeye nastro<sup&gt; 4</sup&gt;, In tal modo l&#39;etichettatura nastri specificamente quando i terminali sono ripreso con un laser a 561 nm. Questo permette la localizzazione precisa delle zone attive e la separazione della sinaptica da eventi extra-sinaptico.

In questo video ci dimostra come etichettare e visualizzare singole esocitosi delle vescicole sinaptiche e la tratta di pesci rossi cellule bipolari della retina mediante fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è una tecnica che permette lo studio di eventi che avvengono a livello della membrana cellulare, attraverso la selezione...

Questa procedura inizia con la dissezione della retina neurale del pesce rosso adulto, che è il tessuto nervoso situato nella parte posteriore dell'occhio. Le retine vengono poste in una soluzione enzimatica per 35 minuti, risciacquate e triturate con una pipetta di vetro levigata a fiamma per dissociare le cellule. Le cellule vengono quindi seminate su coprivetri di vetro ad alto indice di rifrazione e montate in piatti di plastica per colture cellulari.I neuroni bipolari isolati vengono identificati in base alla loro morfologia distinta per caricare i terminali. Viene erogata una puffata per 10 secondi con una soluzione contenente FM 1-43 e si attendono 30 secondi prima di rimuovere il colorante. Dopo un lavaggio di 30 minuti, le cellule vengono sottoposte a patch clamp e analizzate mediante microscopia TIRF.Ciao, mi chiamo Christina Jovi del laboratorio ZEC del Dipartimento di Fisiologia Cellulare e Molecolare della Scuola di Medicina dell'Università di Yale. Oggi vi mostreremo un procedimento per studiare l'esocitosi in cellule bipolari retiniche vive mediante microscopia turf. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare i meccanismi del rilascio sinaptico.Iniziamo. Per cominciare, adattare al buio un pesce rosso per almeno 30 minuti prima della dissezione. Dopo la decapitazione e la rimozione dell'occhio, posizionare un bulbo oculare su un pezzo di carta da filtro e utilizzare la punta di una lama da bisturi numero 11 per perforare il limbo sclerale all'interno del foro perforato.Utilizzare un paio di forbici bonna per tagliare via l'intero segmento anteriore. Successivamente, posizionare un piccolo pezzo di carta da filtro sulla parte superiore della coppa ottica rimanente ed esercitare una certa pressione per far sì che assorba l'umore vitreo. Sollevare la carta da filtro con la retina attaccata e, utilizzando un paio di forbici VNA, tagliare il nervo ottico.Posizionare la carta da filtro contenente la retina in una piastra di coltura di plastica da 35 millimetri contenente soluzione ad alto contenuto di alur e utilizzare pinzette Dumont numero sette per staccare la retina dalla carta da filtro. Successivamente, utilizzando metà di una lama industriale in acciaio al carbonio monolama, tagliare la retina in quattro-sei pezzi e lasciarli in ammollo nella soluzione di ialuronidasi per 20 minuti. Nel frattempo, in attesa che l'ialuronidasi faccia effetto, aggiungere cinque millilitri di soluzione di L-cisteina alla papaina e lasciare riposare per circa cinque-dieci minuti, fino a quando il liquido diventa trasparente. Lavare i pezzi di retina tre volte con soluzione di Ringer a basso contenuto di calcio e lasciarli in ammollo nella soluzione di papaina per 30-35 minuti.Dopo 35 minuti di incubazione nella soluzione di papaina, lavare i pezzi retinici tre volte. Trasferire i pezzi in una piastra di coltura in plastica da 35 millimetri contenente ringer a basso contenuto di calcio e conservare la piastra a 12-14 gradi Celsius fino al momento di iniziare la dissociazione delle cellule.Per prima cosa, preparare una pipetta di dissociazione riscaldando la punta di una pipetta di vetro PE o di una pipetta con un becco e un bruciatore, quindi utilizzare pinze anatomiche per piegarla leggermente. Posizionare un frammento di retina in una provetta microcentrifuga contenente soluzione ringer a basso contenuto di calcio ed eseguire ripetuti passaggi della retina aspirando e dispensando delicatamente con la pipetta di dissociazione appena preparata. Fare attenzione a non produrre bolle d'aria e piastrare le cellule isolate aggiungendo una goccia della sospensione retinica in una camera di registrazione fatta in casa riempita con soluzione ringer a basso contenuto di calcio.La camera consiste nella metà inferiore di una piastra di coltura in plastica da 35 millimetri con un foro circolare al centro e un coprivetro circolare in vetro con indice di rifrazione 1,78 incollato alla base. Una volta completate la dissezione e l'isolazione delle cellule bipolari, siamo pronti per iniziare il caricamento e il lavaggio delle cellule bipolari. In questo esperimento, è preferibile utilizzare un microscopio a fluorescenza con riflessione totale interna di tipo ad obiettivo, dotato di un obiettivo con elevata apertura numerica e una telecamera sensibile.In questo video, utilizzeremo un obiettivo con apertura numerica di 1,65 e un dispositivo a accoppiamento di carica con moltiplicazione elettronica. Per iniziare, aggiungere una goccia di liquido con alto indice di rifrazione sull'obiettivo del microscopio. Posizionare la camera di registrazione sopra l'obiettivo del microscopio.Montare con attenzione l'elettrodo di terra e il tubo di uscita della superfusione nella camera. Lasciare la camera sul microscopio per 10-20 minuti, permettendo alle cellule di depositarsi e aderire al fondo. Successivamente, spurgare le linee di superfusione e aggiungere la soluzione di lavaggio.Soluzione Ringer a basso contenuto di calcio e soluzione Ringer di controllo nel sistema di superfusione. Accendere la luce in campo chiaro del microscopio e cercare cellule bipolari integre. Toccare leggermente il microscopio per assicurarsi che i neuroni siano saldamente attaccati al fondo della camera.Posizionare la penna per la sovrafusione vicino a una cellula integra e perfondere continuamente il preparato con soluzione ringer a basso contenuto di calcio. Spegnere ora le luci della stanza e aggiungere un filtro passa-lungo rosso al percorso ottico per minimizzare l'eccitazione del colorante fluorescente. Riempire una pipetta di carico con 10 microlitri di soluzione di colorante fluorescente.Montarlo sul micromanipolatore, quindi abbassarlo sul preparato senza utilizzare l'opzione di sovrapressione finché non si trova nello stesso piano focale della cellula bilar scelta. Posizionare l'apertura del puffer a una distanza di circa 10 micrometri dal termine assonico. Spegnere il sistema di superfusione e applicare la soluzione di colorante per 10 secondi attivando la sovrapressione sulla pipetta.Ora spegnere la pressione eccessiva senza muovere la pipetta. Attendere 30 secondi, accendere il sistema di superfusione e bagnare la camera con la soluzione di lavaggio per cinque minuti. Nel frattempo, rimuovere la pipetta puffer dal bagno.Dopo cinque minuti, passare al sistema di SUPERFUSIONE una soluzione ringer a basso contenuto di calcio ed eseguire la perfusione per 25-30 minuti, consentendo la rimozione del colorante in eccesso una volta completato il caricamento e il lavaggio delle cellule bipolari. A questo punto siamo pronti per iniziare la tecnica del patch clamping e l'acquisizione di immagini mediante T-I-R-F-M. Al termine del lavaggio, sostituire i supporti per gli elettrodi per evitare la contaminazione della pipetta per il patch con il colorante.Posizionare il terminale assonico al centro del campo visivo. Riempire una pipetta per il patch con sette microlitri di soluzione interna. Toccarla leggermente per eliminare le bolle d'aria.Rivestirlo con cera dentale fusa e quindi montarlo sul micromanipolatore. Capovolgere la pipetta, applicare la pressione e abbassare lentamente la pipetta sul preparato. Verificare la resistenza della pipetta ed effettuare tutte le correzioni necessarie.Successivamente, con il sistema di superfusione impostato sulla soluzione ringer di controllo, creare un sigillo gigaseal tra la pipetta e la cellula toccando leggermente la punta dell'elettrodo sul corpo cellulare. Con la pressione sulla pipetta spenta, applicare delicatamente una pressione negativa all'elettrodo mentre è sigillato. Selezionare la modalità "cellula intera" nell'amplificatore e impostare il potenziale di mantenimento della cellula a meno 60 millivolt.Ora utilizzare un software di imaging per selezionare una regione di interesse che comprenda l'intero terminale assonico. Spegnere la luce in campo chiaro e, esponendo brevemente il terminale al laser a 488 nanometri, individuare il piano focale corretto per l'immagine TIRF.Successivamente, perforare la cellula utilizzando il comando di rottura dell'amplificatore mentre si applica una leggera pressione negativa alla pipetta, correggendo la capacità cellulare e la resistenza in serie. Quindi applicare il protocollo di tensione mentre si acquisisce l'immagine del movimento delle vescicole sinaptiche. Attendere almeno 40 secondi tra un esperimento e l'altro per consentire il recupero.Prima, scegliamo una cellula bipolare mediante microscopia in campo chiaro. Successivamente, ingrandiamo e carichiamo il suo terminale assonico con un colorante fluorescente. Dopo un periodo di lavaggio di 30 minuti, il terminale marcato può essere osservato mediante microscopia inter e il movimento delle vescicole glutamatergiche fluorescenti può essere registrato.Qui introduciamo un peptide legante il rib eye attraverso la pipetta di registrazione, che ci permette di visualizzare la posizione dei ribbon sinaptici quando immaginati con un laser a 561 nanometri. Successivamente, depolarizziamo le cellule e osserviamo il movimento delle vescicole con il laser a 488 nanometri. Vi abbiamo appena mostrato come dissociare e caricare cellule bipolari retiniche con un colorante fluorescente, nonché come effettuare il patch e il clampaggio di questi neuroni e contemporaneamente immaginarli mediante microscopia TURF.Quando si esegue questa procedura, è importante non esporre eccessivamente le cellule al laser. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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