Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

La microscopia a macchie fluorescenti viene utilizzata per analizzare la dinamica di varie proteine del citoscheletro in cellule vive. Quando utilizzata correttamente, è possibile effettuare misurazioni quantitative della velocità e della cinetica di turnover delle proteine del citoscheletro. Iniziamo questa procedura iniettando mediante microiniezione un piccolo volume di actina marcata con un fluorocromo in cellule vive.

Assembliamo quindi la camera di imaging per ridurre gli effetti del fotoblecamento. Innanzitutto, due pezzi di nastro biadesivo vengono posizionati su entrambi i lati del vetrino su cui poggerà il coverslip cellulare. Successivamente, il mezzo di imaging viene pipettato nella camera, dispensando il mezzo vicino a una delle fessure aperte.

Infine, tutti e quattro i lati vengono sigillati con valet. Ciao, mi chiamo James Lim e sono del laboratorio di Galden's Deucer del Dipartimento di Biologia Cellulare presso lo Scripps Research Institute. Oggi vi mostreremo una procedura relativa alla microscopia fluorescente a macchie.

Utilizziamo questa procedura per analizzare la dinamica dell'actina in cellule epiteliali in migrazione. Cominciamo dunque. Un componente fondamentale per ottenere buoni filmati mediante microscopia a macchie fluorescenti è l'etichettatura corretta dell'actina con il fluorocromo di vostra scelta; raccomandiamo l'uso di fluorocromi della serie Alexa e X rodine cin, derivati estere medi che bersagliano i residui di lisina esposti sulla superficie dell'actina.

È importante che il rapporto di marcatura sia elevato, tra 0,3 e 0,7 coloranti per monomero di actina, per garantire che le macchie appaiano luminose e distinte prima del congelamento a lungo termine. Clarificare la soluzione di actina marcata centrifugando a 75.000-80.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. L'actina marcata deve essere conservata in soluzione tampone G a meno 80 gradi Celsius.

Preparare aliquote da due microlitri per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, che possono portare alla formazione di aggregati insolubili. Per evitare lo sbiancamento fotochimico dei fiori colorati, non esporre la soluzione di actina marcata alla luce diretta per periodi prolungati e utilizzare tubi microcentrifuga opachi per il mantenimento a lungo termine. Le cellule per la microiniezione su coprioggetti quadrati in vetro trattati con acido.

È possibile applicare un rivestimento standard del substrato al vetrino, che non influirà sulla microiniezione. Conservare le cellule a 37 gradi mentre si prepara l'actina, per selezionare le cellule adatte alla microiniezione. Per la FSM, prendere in considerazione questi criteri.

Le cellule devono essere grandi, con un diametro superiore a 50 micrometri, devono appiattirsi dopo essere state seminate e aderire naturalmente ai substrati. È inoltre utile che la zona isolata della cellula occupi un'area maggiore rispetto a quella del suo nucleo. Alcune linee cellulari adatte includono PTK one, cellule polmonari di tritone e neuroni AIA.

In questa dimostrazione, inietteremo delle cellule epiteliali PTK1. La corretta selezione degli aghi per microiniezione dipende dalle dimensioni dell'apertura della punta. Tipicamente, le dimensioni del foro possono variare da 0,5 micrometri fino a tre micrometri.

Si raccomanda una dimensione ottimale dell'apertura compresa tra 0,5 e un micrometro. Per l'iniezione di Acton, gli aghi per microiniezione possono essere acquistati oppure realizzati in laboratorio. Se è disponibile un estrattore di aghi commerciale, si consiglia di avere a disposizione da 10 a 20 aghi già preparati prima di iniziare la procedura di iniezione.

Il passaggio successivo consiste nel diluire l'acton marcato con buffer di iniezione freddo di ghiaccio. Mantenere tutte le soluzioni di lavoro sul ghiaccio. La concentrazione ideale per l'iniezione, ovvero la concentrazione finale di acton caricata nella siringa, è compresa tra 0,5 e 1 microgrammo per microlitro.

In base a un rapporto di marcatura del 40% di D rispetto al monomero di actina, caricare da 0,5 a un microlitro della soluzione di actina diluita. Utilizzando un ago per siringa micrometrica, distribuire con attenzione la soluzione di actina. Evitare di formare bolle d'aria.

Se sono presenti bolle d'aria, possono essere facilmente rimosse aspirando i liquidi in eccesso che circondano la bolla. Assicurarsi che la soluzione Acton sia completamente ferma alla punta dell'ago. Non deve esserci soluzione in eccesso in alcun punto del capillare dell'ago, poiché ciò potrebbe alterare il flusso dell'iniezione.

L'ago caricato è ora pronto per essere fissato al supporto di iniezione per la microiniezione. Recuperare le cellule dall'incubatrice e posizionare il vetrino coprioggetto sul portapreparati del microscopio. Per iniziare la procedura di microiniezione, portare l'ago caricato al microscopio.

Attaccare con attenzione l'ago evitando il contatto con la punta dell'ago al supporto dell'iniettore. Posizionare il supporto in modo che l'ago formi un angolo compreso tra 35 e 50 gradi rispetto alla base del piatto del microscopio. Abbassare la punta dell'ago fino a quando non rompe appena la superficie del mezzo di bagnatura.

Ora posizionate le cellule in modo che la punta dell'ago si trovi esattamente al centro dell'obiettivo. Se la punta dell'ago è allineata con l'obiettivo, dovreste vedere un alone luminoso attraverso l'oculare. Questa è la punta terminale dell'ago.

Spostare lentamente l'ago da un lato all'altro può aiutare a individuare meglio l'alone. Durante la navigazione, assicurarsi che la punta dell'ago sia ben al di sopra delle cellule. Per evitare di spezzare la punta dell'ago, regolare la messa a fuoco Z. del microscopio finché le cellule non saranno chiaramente visibili.

Quindi abbassare lentamente la punta dell'ago controllando la messa a fuoco finché l'alone si restringe gradualmente e infine converge sulla punta dell'ago. È anche possibile osservare il fusto dell'ago, che proietterà ombre lineari. Abbassando l'ago, il fusto verrà definito progressivamente.

Potrebbero essere necessari leggeri aggiustamenti dell'anello di fase per migliorare il contrasto; sia la punta dell'ago sia le cellule ora dovrebbero essere chiaramente visibili. Quando si selezionano le cellule da iniettare, le cellule con margini liberi devono essere orientate verso la punta dell'ago. Questo garantisce che la pendenza decrescente della cellula, dal punto più spesso in cui si trova il nucleo al punto più sottile del margine anteriore, incontri la punta dell'ago invece di correre parallelamente ad essa.

Impostare la pressione dell'ago tra 0,3 e 0,8 PSI. La pressione costante applicata garantirà un flusso regolare della soluzione di actina. Una volta scelta la cellula da iniettare, posizionare l'ago in modo che la punta sia vicina al nucleo della cellula; abbassare lentamente l'ago e riaggiustarne la posizione fino a quando la punta non risulta premuta contro la cellula.

Abbassare gradualmente l'ago fino a quando la sua punta ha perforato la membrana. Se l'ago ha perforato completamente la membrana, la cellula apparirà più luminosa. Non appena si osserva questo cambiamento, sollevare l'ago fino a quando non tocca più la cellula.

Il processo reale di perforazione e iniezione richiederà da 0,5 a due secondi. Se eseguito correttamente, la forma della cellula apparirà invariata. Per ridurre al minimo lo stress sulle cellule, non superare i 20-45 minuti per ogni sessione di microiniezione.

A volte potrebbe non essere visibile alcun cambiamento nella cellula durante l'iniezione e la cellula non diventa più luminosa. Ciò indica che la punta della pipetta potrebbe essere ostruita. È possibile verificare questa situazione premendo il pulsante di pulizia, se disponibile sul vostro iniettore.

Se la punta dell'ago è aperta, ciò aumenterà significativamente il flusso a pressione costante, che può essere osservato come increspature e dispersione dei detriti circostanti. Se la punta dell'ago è chiusa, è possibile inserire un nuovo ago per microiniezione oppure tentare di rompere la punta abbassando delicatamente l'ago finché la sua estremità preme contro il vetrino di copertura, provocando così la rottura dell'estremità terminale.

L'area di rottura non deve superare un quinto dell'area della punta dell'ago, ovvero la porzione dell'ago che inizia a restringersi fino a formare una punta, al termine della microiniezione. Sostituire il mezzo cellulare nella piastra con mezzo fresco preriscaldato per rimuovere eventuali residui fluorescenti. Dopo aver cambiato il mezzo, lasciare riposare le cellule per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi prima dell'acquisizione delle immagini.

Questo permetterà anche all'actina di integrarsi nella rete citoscheletrica esistente mentre le cellule si riprendono nell'incubatore, iniziando ad assemblare la camera per l'acquisizione delle immagini. Prima riscalda il mezzo di imaging in un bagno d'acqua a 37 gradi. Successivamente, scongela un'aliquote di 15 microlitri di oxa erase a temperatura ambiente.

L'aggiunta di RA al mezzo in un secondo momento ridurrà notevolmente gli effetti del fotoblecamento. Mantenere l'ossidrilasi avvolta nella carta d'alluminio garantirà che il composto fotosensibile sia protetto dalla luce. Preriscaldare il sigillante VAP su una piastra riscaldante impostata a bassa temperatura, senza surriscaldare né bruciare il VAP, altrimenti perderà la sua efficacia come sigillante.

Pulire una microvetrina con un fazzoletto di carta imbevuto di etanolo puro per eliminare detriti e sporco. Sovrapporre due strisce di nastro adesivo doppia faccia di uguale lunghezza, lunghe 2,5 centimetri, l'una sull'altra utilizzando una superficie piana e pulita, come un'altra microvetrina. Come piattaforma, premere per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate e creare un piano completamente piatto.

Successivamente, utilizzare una lametta per tagliare due strisce dritte lungo l'asse longitudinale del nastro in modo che ciascuna striscia misuri 0,5 centimetri di larghezza. Utilizzando pinzette, posizionare ogni striscia lungo i bordi longitudinali del vetrino in modo che le due strisce di nastro creino un'apertura al centro del vetrino. Premere delicatamente sul nastro per ottenere una buona tenuta con il vetro.

Queste strisce di nastro fungeranno da distanziali tra il vetrino microscopico e il coprioggetto. Controllare la valvola per assicurarsi che si sia completamente liquefatta. Prima di iniziare il passaggio successivo, recuperare il mezzo di imaging preriscaldato.

Aggiungere 15 microlitri di oxy rays a ogni 500 microlitri di terreno. Piegare un panno chimico a triangolo per creare tre bordi rigidi. Questo verrà utilizzato successivamente per pulire il vetrino.

Recuperare le cellule dall'incubatrice utilizzando pinzette. Afferrare rapidamente un angolo del vetrino. Posizionare il vetrino su un fazzoletto di carta con il lato delle cellule rivolto verso l'alto e senza toccare il tessuto, e utilizzare il fazzoletto piegato per asciugare due lati opposti del vetrino al fine di creare una superficie semi-secca.

Quindi prendere un angolo del coprioggetto con una pinzetta e posizionare il coprioggetto sul vetrino in modo che le superfici asciutte siano allineate alle due strisce di nastro. Osservare che ora si hanno due lati chiusi e due fessure aperte. Pipettare lentamente 200 microlitri della soluzione RA del mezzo di imaging vicino a una delle aperture.

È importante non introdurre bolle d'aria. La soluzione deve essere aspirata nella camera appena assemblata grazie alle forze capillari, immergendo così completamente le cellule nella soluzione. Utilizzando un bastoncino di ovatta, tamponare i quattro angoli del vetrino con vap fuso per fissare e stabilizzare rapidamente il vetrino.

Si noterà che il VAP si asciuga in pochi secondi a temperatura ambiente. Partendo quindi dai lati chiusi, applicare una sottile striscia di VAP utilizzando il bastoncino di cotone e imitando un movimento di spazzolatura. Ripetere l'operazione per i lati aperti.

Aumentare lentamente lo strato di VAP, rinforzando il sigillo ripetendo i passaggi di rivestimento. Il VAP deve essere confinato ai bordi, lasciando al centro del vetrino una zona libera. Dopo aver sigillato i bordi del vetrino, pulire delicatamente la parte centrale del vetrino utilizzando un bastoncino di cotone con H2O DD per rimuovere qualsiasi residuo di mezzo.

Attenzione a non schiacciare le cellule. Ripetere questo passaggio di pulizia con etanolo puro. Ora si dispone di una camera di imaging completamente chiusa, ottimizzata per l'imaging a macchie fluorescenti.

Un alloggiamento completamente sigillato impedirà ai vostri fiori di degradarsi rapidamente per fotobleaching. Le cellule nella camera completamente chiusa sono ora pronte per l'acquisizione delle immagini. Utilizziamo un microscopio a campo chiaro capovolto dotato di lampada a mercurio, illuminatore in epifluorescenza, filtri appropriati e obiettivo a immersione in olio plan.

Le immagini acquisite con obiettivi apocromatici vengono catturate mediante una telecamera CCD raffreddata con pixel da 6,7 micron e un software di acquisizione delle immagini. Preriscaldare il piatto del microscopio a 37 gradi. Posizionare la camera per l'acquisizione e attendere da 10 a 15 minuti affinché la temperatura si stabilizzi prima di iniziare l'acquisizione.

Una volta che la temperatura si è stabilizzata, mettete a fuoco le cellule in campo chiaro e quindi individuate le cellule iniettate attivando le impostazioni fluorescenti corrette. Cercate di minimizzare il tempo di esposizione alla fluorescenza per ridurre il fotobiancamento. Cercate cellule iniettate con margini anteriori sani e curvi.

Le cellule sovra-iniettate saranno caratterizzate da margini retratti e irregolari che assomigliano a numerosi filopodi. Non acquisire immagini di queste cellule. Le impostazioni di acquisizione dipenderanno dal tipo di cellula, dalla qualità dell'actina marcata e dai componenti del microscopio.

Tuttavia, le impostazioni di esposizione non devono superare i due secondi e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere impostato tra cinque e dieci secondi. Le impostazioni del guadagno sulla fotocamera possono essere aumentate per migliorare il rapporto segnale-rumore. Le caratteristiche ideali delle macchie devono prevedere che ogni macchia sia distanziata dalle macchie adiacenti di circa due diametri della macchia.

Per le cellule epiteliali, la rete di actina a macchie apparirà omogenea, con macchie distribuite uniformemente. Le impostazioni di esposizione devono essere regolate per ottenere le migliori immagini a macchie.

La chiave per ottenere buoni filmati di speckle è mantenere la messa a fuoco. Questo aspetto è particolarmente importante per l'analisi successiva che prevede misurazioni del flusso e del turnover dello speckle. Pertanto, la qualità dell'analisi quantitativa dipenderà dalla stabilità della messa a fuoco per tutta la durata dell'acquisizione temporizzata.

Sono descritte varie strategie per mantenere il fuoco; per questa dimostrazione verrà utilizzato il sistema di messa a fuoco automatica Nikon Perfect Focus. Di seguito sono riportati diversi esempi di cellule microiniettate. Il pannello a sinistra mostra una cellula sottoposta a microiniezione con un'immagine a macchie di bassa concentrazione.

Il pannello centrale mostra una cellula sovra-iniettata con un'immagine di macchie eccessivamente concentrata, mentre il pannello destro mostra una cellula iniettata in modo ottimale. Per la microscopia a macchie fluorescenti di buona qualità, vi abbiamo appena mostrato come iniettare mediante micropuntura actina marcata con fluorescenza in cellule epiteliali.

Quando si esegue questa procedura, è estremamente importante ricordare che la qualità dell'actina marcata, così come la tecnica di microiniezione, determinerà la qualità complessiva delle immagini a macchie. Questo è tutto e buona fortuna con i vostri esperimenti.