Fattore-Coated crescita Placement Bead su Espianti Forebrain dorsali

Questi sono il primo tipo di perline che utilizzerò. Sono perline gel blu. Sono morbide.

Pertanto, devo utilizzare una pipetta di vetro riempita, collegata a una pipetta orale, per posizionare queste perle sulle X. Il secondo tipo di perla che mostrerò è costituito da perle di acrilato eparinico. Si tratta di un tipo rigido di perle, e posizionerò queste perle su espianti X utilizzando un ago di tungsteno. Queste sono le provette capillari di vetro che fonderò per prime utilizzando il becco di Bunsen.

Poi le tirerò per creare una punta più fine. Quindi tengo il capillare al centro della fiamma e lo ruoto mentre il tubo si fonde. Posso sentire che diventa morbido.

Lo solleverò dalla fiamma e poi lo tirerò. Inciderò una linea trasversale sul tubo capillare con questa penna a punta di diamante, in modo da ottenere un taglio dritto e preciso. Successivamente, luciderò le estremità con la fiamma per ripulirle.

Passerò il capillare attraverso la fiamma per levigare l'estremità e ridurre l'apertura, in modo da poter trattenere una perla invece di farla passare attraverso il capillare. È importante notare che non si deve tenere il capillare nella fiamma per molto tempo. Si tratta infatti di un passaggio molto rapido, altrimenti il capillare si sigillerebbe.

Di solito ne preparo diversi perché molti finiscono con la punta sigillata dalla fiamma. È difficile da controllare, quindi si preparano semplicemente diversi campioni. Questo è un esempio di uno in cui la punta è stata sigillata.

Questo è un esempio di una buona pipetta. Ho trasferito 250 microlitri di perle agel in questa provetta einor e le laverò cinque volte con un millilitro di PBS per rimuovere la soluzione azi in cui erano in ammollo. Attenderò circa tre minuti per permettere alle perle di sedimentare, quindi aspirerò il PBS in eccesso e ripeterò questa operazione altre quattro volte.

Le perle non si sono ancora del tutto depositate, quindi aspetterò che si depositino e poi aspirerò il PBS in eccesso, ripetendo questa operazione quattro volte. Alla fine, aggiungerò 300 microlitri di PBS e inizierò a lavorare con le perle. Questa è una pipetta manuale standard e prenderò semplicemente la capillare che ho preparato inserendola all'interno per circa un terzo della sua lunghezza.

Per prima cosa, riempire le pipette con PBS. Di solito si riempiono semplicemente per azione capillare. Questo è il coperchio di una piastra di coltura da 30 millimetri e ho aggiunto una goccia di microsfere di colore blu.

Vicino a esso si trova una piccola goccia di PBS. In questa piastra è presente una goccia di soluzione proteica di cinque microlitri. In questo caso, si tratta di B e P quattro, ma è possibile utilizzare una proteina a scelta mediante pipetta orale.

Prelevo una perla da questo cerchio blu, la risciacquo una volta nella goccia di PBS. Poi prendo la perla con la pipetta a bocca e la pongo nella goccia di soluzione proteica, lasciandola in incubazione a temperatura ambiente per circa un'ora o a quattro gradi per diverse ore. Qui si vede un gruppo di perle in PBS e devo selezionare quelle di dimensioni appropriate.

Se sono troppo piccole, passeranno semplicemente attraverso la pipetta a bocca. Devono rimanere posizionate all'estremità. Ora potete vedere che ho scelto alcune perline, tre perline più grandi e tre più piccole.

Utilizzerò le perle più grandi nell'esperimento. Ora trasferirò una perla grande dalla goccia di PBS alla goccia di soluzione proteica. Per fare ciò, ritirerò delicatamente la lingua lontano dalla pipetta orale.

Non è un movimento di aspirazione, ma semplicemente l'applicazione di una pressione negativa. Poi lo trasferirò e fondamentalmente riposizionerò la lingua sopra l'apertura. Testa del tubo, senza soffiare, ma aggiungendo semplicemente una pressione positiva per far staccare il batuffolo dall'estremità.

Ora ho cinque perline nella goccia di soluzione proteica, e le incuberò a quattro gradi per diverse ore, oppure a temperatura ambiente per mezzo ora fino a un'ora. Questa è la piastra di coltura che contiene la membrana galleggiante nel mezzo insieme alle eggplants che ho già dissezionate. Prenderò la punta della mia pipetta e aspirerò un po' del mezzo.

Sto per risciacquare le perline in una goccia di mezzo solo una volta immediatamente prima di posizionare la perlina sull'esplan X. Queste sono le punte di tungsteno che utilizzerò per raccogliere e posizionare le perline acriliche. Questa è la punta di tungsteno e al momento è nel suo supporto.

E queste sono delle ottime pinzette. A un angolo di 45 gradi. Userò l'ago di tungsteno nelle pinzette per sollevare una perla da questa pozzetta di PBS e trasferire la perla in una goccia di soluzione proteica.

Come ho fatto con le perline di agel. Come per le perline di agel, ho lavato queste perline acriliche cinque volte in PBS e trasferito una goccia su questa piastra. Successivamente, userò l'ago di tungsteno tenuto con pinzette per trasferire una perla in una goccia di proteina e procederò all'incubazione, esattamente come ho fatto con le perline di gel.

Quindi si tratta di sollevare la perla. Tengo saldamente la mano destra appoggiata sul tavolo e uso l'indice della mano sinistra per stabilizzare l'ago mentre entro nel liquido; tocco leggermente una perla con l'ago e la sollevo lentamente fuori dal liquido. A volte la perla cade dall'ago, quindi basta tornare a prenderne un'altra.

Ora con la mano sinistra ho la pinza ad angolo di 45 gradi. Con le punte rivolte verso il basso, tocco la perla e l'ago con il liquido e uso. Uso la punta della pinza per premere delicatamente e staccarla.

Ora ho cinque perle con proteina. Ok, quindi con la mano destra tengo l'ago di tungsteno nella perla, e con la mano sinistra uso la pinzetta con la punta rivolta verso il basso, nello stesso modo in cui le ho staccate dalle quattro; lo farò di nuovo qui sullo x explan. Incubare a 37 gradi e il tempo dipende dall'assay specifico.