Name: Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Impara a dissecare embrioni di Drosophila per registrazioni elettrofisiologiche. Questa tecnica espone il sistema neuromuscolare per studiare lo sviluppo embrionale e analizzare mutanti che non schiudono.

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Parte 1: Attrezzature e Forniture <ol><li> Un microscopio a dissezione buona è necessaria per dissezioni embrione; ingrandimento 40X è suggerito, con 25X oculari per aumentare al massimo ingrandimento. </li><li> Una pinza sottile (numero 5) sono necessari per la selezione manuale di embrioni e devitellinization degli embrioni. </li><li> Attrezzature per creare e modificare gli aghi buon bicchiere è richiesto. Tirato in vetro aghi sono necessari per la dissezione. Noi preferiamo vetro solido per la dissezione (durano più a lungo), ma di serie pareti spesse tubo di vetro (diametro esterno 1-1,5 mm) funziona pure. Alcune persone usano aghi tungsteno fine, elettrolizzata per la nitidezza desiderata in un bagno di NaOH 1M con un + 10 Amp batteria autotrasformatore. Aghi affilati dissezione tungsteno hanno il vantaggio di essere relativamente resistenti e di lunga durata. Aghi di vetro cavo (formato simile a elettrodi di patch clamp) sono collegati a tubi di plastica e utilizzato durante la dissezione per l&#39;aspirazione ed espulsione di soluzione salina, così come la consegna controllata di colla. Una varietà di estrattori di vetro sono disponibili per la produzione di aghi di vetro. Computer programmato estrattori può essere regolato per tirare una varietà di forme e dimensioni. Il Brown-Flaming modelli (Sutter Instrument Co.) sono ampiamente favorite. Un microscopio composto (20-40X obiettivo) dovrebbero essere disponibili per controllare e modificare gli elettrodi prima dell&#39;uso. </li><li> Due tipi di soluzioni sono comunemente usati per il bagno durante la dissezione dei tessuti embrionali: 1) &quot;standard&quot; (Jan e Jan, 1976a) o &quot;standard modificato&quot; (Broadie, 2000) saline, basato su soluzioni comunemente usati per la registrazione in altri sistemi di invertebrati , e 2) &quot;emolinfa-like&quot; (HL) saline (Stewart et al 1994), un compromesso tra la soluzione salina standard e le concentrazioni ioniche misurate nella emolinfa Drosophila. Va notato che nessuna di queste saline imitano con precisione la composizione chimica di emolinfa in vivo (Broadie, 2000). Standard di soluzione salina contiene (in mm): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 saccarosio, 5 TES, pH 7,2. Sperimentatori possono anche prendere in considerazione salina insetti preparati commercialmente (ad esempio Schneider Media insetti), che non è adatto per la registrazione elettrofisiologica ma molto probabilmente per proteggere la salute dei tessuti esposti. </li></ol> Parte 2: Staging Embryo e dissezione <ol><li> Per la raccolta delle uova ottimale, mantenere giovani (&lt;7 giorni), maschio sano e mosche di sesso femminile (20-40) su cibi freschi vasi che per 2-3 giorni. Pentole posa comunemente costituiti da 100 bicchieri di plastica ml (Tri-Versare) perforata per fornire un&#39;adeguata circolazione dell&#39;aria, che copre una piastra di agar 60 mm. Piastre di agar contenenti mele o succo d&#39;uva indurito con agar. Esistono diverse ricette, ma un esempio è la seguente: 700 ml di acqua, 25-30 grammi di agar, 300 ml di succo concentrato (uva o di mela), 0,5 g metilparaben (p-hydroxymethylbenzoate) e 30g di zucchero. Autoclave l&#39;acqua e agar e far bollire a parte il p-hydroxymethylbenzoate con lo zucchero e il succo. Mescolare l&#39;agar e soluzioni succo di frutta e versare rapidamente in 60 piastre mm, rimuove le bolle. </li><li> Prima della raccolta delle uova, le mosche sono alimentati con pasta di lievito (7 grammi di lievito di birra in 9 ml di acqua conservato a 4 ° C) su piatti freschi, cambiata almeno due volte al giorno per almeno due giorni. Di giorno 3, un piatto buono dovrebbe produrre 100-200 uova all&#39;ora. Deposizione delle uova migliore si osserva in una pentola mantenuto su un lato con l&#39;agar nella piastra graffiato. Molti embrioni saranno stabilite nel o accanto ai graffi. </li><li> Per raccogliere un gran numero di embrioni, delicatamente trasferire gli embrioni dalla piastra di agar in un cesto con un pennello. Un cesto può essere fatto con un tubo da 15 o 50 ml per centrifuga. Tagliare la parte inferiore lasciando spazio sufficiente superficie per intrappolare uno schermo (70 mesh micron) tra il coperchio e la parte superiore del tubo. Sciacquare gli embrioni con dH 2 0 e messo in una piastra di Petri di fresco 50% al 100% di candeggina per rimuovere il corion esterno. In alternativa, le uova possono essere raccolti individualmente utilizzando una pinza sottile, e dechorionated mettendoli manualmente in una goccia di candeggina. De-chorionation può richiedere da 30 secondi a 2 minuti (candeggina fresca è molto più veloce), e devono essere monitorati sotto il microscopio di dissezione. La rimozione del corion espone la lucida, trasparente membrana vitellina. Dechorionated uova devono essere brevemente sciacquati, o posto in soluzione fisiologica, come candeggina distrugge rapidamente i tessuti devitellinized. </li><li> E &#39;fondamentale mettere in scena con attenzione embrioni per l&#39;età evolutiva desiderato. La Drosophila definito stadio embrionale (1-17; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) non sono utili, come tutto lo sviluppo funzionale neuromuscolare avviene in fase avanzata o 16 stadio 17. Così, gli embrioni sono messo in scena da ora dello sviluppo a 25 ° C in un incubatore umidificato, in ore dopo la fecondazione o, più comunemente, dopo la deposizione delle uova (AEL). In queste condizioni, l&#39;embriogenesi dura 21 + / - 1 ora a 25 ° C. </li><li> Uova da un tempo di uovo laici (1-2 hrs) che sono opportunamente invecchiato sono visti per la prossima criteri morfologici. Dopo il lavaggio in ampia dH 2 O, le uova dechorionated sono posti in un piatto di plastica cultura (sotto dH 2 O) per la visualizzazione. Corretta stadiazione può essere confermata con criteri morfologici usando la luce riflessa con un microscopio a dissezione (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985). Maturo fase avanzata embrioni (22-24h AEL) sul punto di cova sono generalmente riconosciuti dalla segmentazione della cuticola e trachea gonfiati. Gli embrioni possono anche essere sottoposti a tipizzazione mediante GFP e bilanciatori di dissezione di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati. </li><li> Per la dissezione, embrioni dechorionated ed evolutivamente messo in scena sono fissati (lato dorsale verso l&#39;alto) su un vetrino con una goccia di soluzione salina (vedi punto 1.5). Gli embrioni vengono rimosse dalla membrana vitellina da pungere la membrana verso la fine anteriore o posteriore, con una micropipetta di vetro o un ago di tungsteno, e poi delicatamente liberando l&#39;embrione dalla membrana. In preparazione per la dissezione, l&#39;embrione deve essere posizionato sul vetrino con la superficie dorsale up (lato dorsale fino dissezione esporrà il sistema nervoso ventrale e neuromusculature per gli esperimenti. Tuttavia, l&#39;embrione può ovviamente essere posizionati in altri modi per facilitare l&#39;accesso ad altri tessuti.) </li><li> Embrioni stadio precoce (&lt;16 ore AEL) attaccano direttamente alla pulizia vetro o vetro rivestiti con polilisina (poli-L-lisina bromidrato; Broadie e Bate, 1993a, b). Vecchi embrioni (&gt; 16 ore AEL), a seguito di formazione cuticola, deve essere incollato, idealmente Sylgard rivestite (Dow Corning) coprioggetto. Un&#39;acqua-polimerizzazione colla cianoacrilato chirurgico o veterinario viene utilizzata (Broadie e Bate, 1993c, d). La colla è espresso attraverso una pipetta piccolo elettrodo di vetro (10-20 micrometri punta diametro interno) collegato ad un tubo di gomma con la colla flusso controllato dalla pressione bocca. Si deve prestare attenzione durante il parto colla, come la colla polimerizza rapidamente dopo il contatto con soluzione salina. Si noti inoltre che l&#39;incollaggio non può essere eseguita in soluzione salina con nessuna o scarsa concentrazione di ioni bivalenti, come il collante necessario per polimerizzare gli ioni bivalenti. Piccole quantità di colla prima utilizzazione per fissare saldamente la testa e la coda. </li><li> Una volta che le estremità dell&#39;embrione sono incollati al vetrino, un&#39;incisione è fatta lungo la linea mediana dorsale con un elettrodo di vetro o un ago di tungsteno affilata. Ciò è reso più facile da dolci perforando la linea di incisione prima di effettuare il taglio finale. I lati dell&#39;incisione vengono poi attaccato al vetrino con più colla, per diffondere delicatamente il piatto embrione. Gli organi interni tra cui l&#39;intestino, i corpi grassi e, facoltativamente, trachea vengono eliminati tramite aspirazione con una pipetta di vetro collegato al tubo di gomma (Broadie e Bate 1993a-c). L&#39;embrione dovrebbe essere allegato al piano coprioggetti, epidermide giù con la ventrale sistema nervoso centrale, nervi periferici, e somatiche muscolatura esposta per la sperimentazione. </li></ol>

Precisa stadiazione di embrioni è critica a causa della rapida maturazione delle proprietà funzionali nel corso del tempo solo diverse ore. Diversi problemi complicare questa messa in scena. In primo luogo, molti ricercatori utilizzano uovo tempo stabilisce per gli embrioni palco, ma il tempo di deposizione delle uova può variare enormemente da animale ad animale in condizioni diverse (Broadie et al. 1992). In particolare, le femmine con una dieta limitata tendono a conservare le uova fecondate per periodi prolungati pr...

<table><tbody><tr><td>Recipienti per raccolta di embrioni</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (per piatto da 60 mm; disponibili altre dimensioni)</td><td>I recipienti possono anche essere realizzati in laboratorio utilizzando becher tri-pour forati, come mostrato nel video</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Disponibile da diverse aziende</td><td>La colla chirurgica aderisce meglio a coprioggetti rivestiti con Sylgard</td></tr><tr><td>Microcapillari di vetro, diametro esterno 1,0-1,5 mm</td><td>Varie</td><td></td><td>Per essere tirati a formare aghi di vetro sottili per dissezione e tubi per l'applicazione della colla</td></tr><tr><td>Tubino di plastica, da collegare alla pipetta di vetro per aspirazione orale e applicazione della colla</td><td>Tygon</td><td></td><td>Il diametro interno del tubino deve corrispondere al diametro esterno del vetro.</td></tr></tbody></table>

raccolta e preparazione drosophila gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila è un modello premier genetico per lo studio sia dello sviluppo embrionale e funzionale delle neuroscienze. Tradizionalmente, questi campi sono abbastanza isolati gli uni dagli altri, con storie in gran parte indipendenti e le comunità scientifiche. Tuttavia, l&#39;interfaccia tra questi campi di solito disparati sono i programmi di sviluppo funzionali alla base dell&#39;acquisizione di proprietà elettriche di segnalazione e la differenziazione delle sinapsi chimici funzionali durante le fasi finali della formazione circuito neurale. Questa interfaccia è un&#39;area estremamente importante per le indagini. In Drosophila, queste fasi di sviluppo funzionale si verificano durante un periodo di &lt;8 ore (a 25 ° C) durante l&#39;ultimo terzo di embriogenesi. Questo periodo tardo di sviluppo è stato a lungo considerato intrattabile a causa indagine per la deposizione di un duro, cuticola impermeabile epidermica. Un passo avanti è stato anticipato l&#39;applicazione di acqua-polimerizzazione colla chirurgica che può essere applicata a livello locale per la cuticola per permettere la dissezione controllato di fase avanzata di embrioni. Con una incisione longitudinale dorsale, l&#39;embrione può essere posato piatto, esponendo il cordone ventrale dei nervi e muscolatura della parete del corpo di indagine sperimentale. Questo sistema è stato molto utilizzato per isolare e caratterizzare mutanti genetici che impedire la formazione embrionale sinapsi, e quindi svelare i meccanismi molecolari che regolano la specificazione e differenziazione delle connessioni di sinapsi e funzionali, le proprietà di segnalazione sinaptica.

Questa tecnica espone il neuromusculature Drosophila embrionali per immunoistochimica o registrazione elettrofisiologica. E &#39;utile per studiare eventi precoci nello sviluppo neuromuscolare o l&#39;esecuzione di elettrofisiologia in mutanti che non possono schiudersi.

Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

Drosophila è un modello genetico d'eccellenza per lo studio sia dello sviluppo embrionale che delle neuroscienze funzionali. Tradizionalmente, questi campi sono piuttosto...

Per effettuare registrazioni elettrofisiologiche in embrioni di drosophila, questi devono prima essere raccolti, coordinati e dissecati; una dissezione controllata è resa possibile grazie a una colla chirurgica polimerizzante in acqua, che stabilizza gli embrioni su coprioggetti. Gli organi interni vengono quindi rimossi dagli embrioni stabilizzati per esporre il sistema nervoso centrale ventrale, i nervi periferici e la muscolatura somatica. Ciao, sono Dave Featherstone del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Illinois a Chicago.Ciao, sono Ton del Laboratorio di Dave Featherstone del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Illinois a Chicago. Oggi vi mostreremo come raccogliere e dissezionare manualmente embrioni in stadio avanzato da Joof. Utilizziamo questa procedura generale in laboratorio per prepararci ai test elettrofisiologici dello sviluppo e della funzione del sistema neuromuscolare di Joof, che vi mostrerò in una prossima presentazione di JoVE.Iniziamo. Questo protocollo inizia con il prelievo di embrioni, una procedura comune utilizzata in una varietà di esperimenti joof, che ora esamineremo. Allestire una miscela di 20-40 moscerini giovani, maschi e femmine, in un contenitore per la deposizione.Allevarli in una camera umidificata a 25 gradi Celsius. Per stimare con precisione lo stadio di sviluppo dell'embrione, la temperatura e l'umidità devono essere costanti. Sebbene siano disponibili contenitori commerciali per la deposizione, questi possono essere costruiti utilizzando becher di plastica forati da 100 ml che si adattano a piastre da 60 millimetri per trapano ad apple.La ricetta per l'estrattore di mele è disponibile nel protocollo scritto. Le perforazioni nel becher possono essere realizzate con una sonda riscaldata e devono essere più piccole delle mosche adulte. Le piastre vengono integrate con una pastiglia di pasta di lievito, che stimolerà le femmine a deporre numerose uova; mescolare lievito e acqua fino a ottenere una consistenza simile a quella della crema di arachidi, quindi spalmare sulle piastre con una spatola.Cambiare la piastra due volte al giorno, facendo cadere le mosche dalla piastra. Ora posso mettere una nuova piastra che può essere rimessa nell'incubatrice. Nel frattempo, potrei verificare quante uova sono state deposte qui entro il terzo giorno.Un buon contenitore dovrebbe produrre da 100 a 200 uova all'ora, con il picco massimo di deposizione tra l'alba e la tarda mattinata. Per semplificare il recupero, praticare dei graffi o delle incisioni con uno scalpello sulla piastra di raccolta dell'elica trasportatrice: nella maggior parte dei casi le uova verranno deposte all'interno o accanto ai graffi per questa procedura. Le mosche vengono lasciate deporre le uova per uno o due ore, in modo da poter raccogliere embrioni in stadio avanzato, anche se questo intervallo di tempo può variare a seconda dell'esperimento.I metodi di raccolta degli embrioni variano anche in base al numero di embrioni necessari per l'esperimento. Per la dissezione e l'elettrofisiologia, sono necessari relativamente pochi embrioni, che in tal caso possono essere prelevati delicatamente dalle piastre con pinzette fini. Per rimuovere il corione esterno, risciacquare gli embrioni con acqua distillata e posizionarli in una capsula contenente una soluzione fresca di candeggina al 50-100%, monitorando gli embrioni al microscopio stereoscopico.Dopo 30-120 secondi, il corione si scioglierà, esponendo la membrana vitale lucida e trasparente. Poiché la candeggina può distruggere rapidamente i tessuti vitali, le uova disclorate devono essere risciacquate brevemente o poste in soluzione salina. Posizionare le uova disclorate in una capsula di Petri in plastica contenente acqua distillata.In questo momento, possono essere genotipizzati visivamente verificando la presenza di marcatori GFP mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza e filtri appropriati; dopo aver selezionato gli esemplari di interesse, procedere con la dissezione. Poiché gli embrioni sono troppo piccoli per essere manipolati con spilli da dissezione, è necessaria una preparazione avanzata. Gli embrioni più vecchi, con cuticole già sviluppate, devono essere incollati su coprioggetti rivestiti in Sogar utilizzando colla chirurgica o veterinaria a base di cianoacrilato, nota anche come histo aal.Il blu funziona bene perché si polimerizza a contatto con soluzioni contenenti ioni bivalenti. Iniziare la dissezione trasferendo un embrione di interesse su un vetrino ricoperto di sigaro sotto una goccia di soluzione salina, con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Rimuovere la membrana vitellina praticando una piccola incisione nella membrana con una micropipetta di vetro o un ago di tungsteno.Quindi liberare delicatamente l'embrione dalla membrana. Gli embrioni in stadio precoce si attaccheranno direttamente al vetro pulito o al vetro rivestito con poli-L-lisina. Per gli embrioni più sviluppati, attaccarli a coprioggetti rivestiti con sard inserendo una colla chirurgica attraverso una piccola pipetta di vetro collegata a un tubo di gomma.Il flusso della colla è controllato con la bocca. Utilizzare piccole quantità di colla per fissare saldamente la testa e la coda. Procedere con attenzione poiché la colla si mescola rapidamente nella soluzione salina.Per dissezionare l'embrione stabilizzato, perforare delicatamente una linea lungo la linea mediana dorsale con un elettrodo di vetro o un ago di tungsteno affilato. Utilizzando lo stesso strumento, praticare un'incisione tagliando attraverso le perforazioni. È fondamentale che l'ago da dissezione sia sempre posizionato con un angolo poco pronunciato per evitare di danneggiare la muscolatura neuroventrale.Successivamente, rimuovere gli organi interni utilizzando una leggera aspirazione orale tramite una pipetta di vetro collegata a un tubo di gomma. Appiattire l'embrione fissando con ulteriore colla i bordi dell'incisione al vetrino coprioggetto. Una volta rimossi tutti gli organi interni mediante aspirazione, il sistema nervoso centrale ventrale, i nervi periferici e la muscolatura somatica risultano esposti per l'esperimento.A questo punto, l'embrione è pronto per registrazioni elettrofisiologiche oppure può essere fissato per immunohistochimica e successiva microscopia mediante tecniche convenzionali. Vi abbiamo appena mostrato come isolare e dissezionare embrioni allo stadio avanzato fino a quelli più teneri. L'applicazione della colla chirurgica e la dissezione degli embrioni risulteranno frustranti all'inizio, ma non esistono trucchi segreti.È necessario sviluppare le abilità motorie fini con la pratica per diverse settimane, ma gradualmente la percentuale di dissezioni riuscite aumenterà. Si prega di consultare il nostro altro video geo, che illustra in dettaglio le configurazioni di registrazione da cellule muscolari e dai neuroni motori. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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