Name: Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Impara a registrare l'attività elettrica di muscoli e neuroni motori in embrioni di Drosophila utilizzando tecniche di patch-clamp. Questo metodo permette di studiare la sinaptogenesi funzionale nelle giunzioni neuromuscolari glutammatergiche e nelle sinapsi centrali colinergiche e GABAergiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KB è supportato dal NIH concedere GM54544.

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Registrazione elettrofisiologica da embrioni di Drosophila richiede la manipolazione manuale e dissezione. La salute della preparazione, e la conseguente qualità delle registrazioni, dipende da un solo essere in grado di preparare rapidamente e ordinatamente i tessuti fragili embrionali per la registrazione, e quindi eseguire l&#39;esperimento. Sperimentatori dovranno essere in grado in entrambe le dissezioni embrionale e di patch clamp elettrofisiologia prima di tentare di affrontare entrambi contemporaneament...

registrazione elettrofisiologiche in drosophila embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila è un modello premier genetico per lo studio sia dello sviluppo embrionale e funzionale delle neuroscienze. Tradizionalmente, questi campi sono abbastanza isolati gli uni dagli altri, con storie in gran parte indipendenti e le comunità scientifiche. Tuttavia, l&#39;interfaccia tra questi campi di solito disparati sono i programmi di sviluppo funzionali alla base dell&#39;acquisizione di proprietà elettriche di segnalazione e la differenziazione delle sinapsi chimici funzionali durante le fasi finali della formazione circuito neurale. Questa interfaccia è un&#39;area estremamente importante per le indagini. In Drosophila, queste fasi di sviluppo funzionale si verificano durante un periodo di &lt;8 ore (a 25 ° C) durante l&#39;ultimo terzo di embriogenesi. Questo periodo tardo di sviluppo è stato a lungo considerato intrattabile a causa indagine per la deposizione di un duro, cuticola impermeabile epidermica. Un passo avanti è stato anticipato l&#39;applicazione di acqua-polimerizzazione colla chirurgica che può essere applicata a livello locale per la cuticola per permettere la dissezione controllato di fase avanzata di embrioni. Con una incisione longitudinale dorsale, l&#39;embrione può essere posato piatto, esponendo il cordone ventrale dei nervi e muscolatura della parete del corpo di indagine sperimentale. Whole-cell patch-clamp tecniche possono essere impiegate per registrare da neuroni individualmente identificabili e muscoli somatici. Queste configurazioni di registrazione sono stati utilizzati per monitorare l&#39;aspetto e la maturazione delle correnti ioniche e propagazione del potenziale d&#39;azione sia in neuroni e muscoli. Mutanti genetici che influenzano le proprietà elettriche sono stati caratterizzati per rivelare la composizione molecolare dei canali ionici e dei relativi complessi di segnalazione, e per iniziare l&#39;esplorazione dei meccanismi molecolari del differenziamento funzionale. Un focus particolare è stato l&#39;assemblaggio delle connessioni sinaptiche, sia nel sistema nervoso centrale e la periferia. Il glutamatergici giunzione neuromuscolare (NMJ) è più accessibile ad una combinazione di imaging ottico e la registrazione elettrofisiologica. Un elettrodo di vetro di aspirazione è usato per stimolare il nervo periferico, con eccitatorio giunzione corrente (EJC), le registrazioni effettuate nella tensione muscolare bloccato. Questa configurazione di registrazione è stato utilizzato per tracciare la differenziazione funzionale della sinapsi, e traccia l&#39;aspetto e la maturazione di proprietà presinaptico rilascio di glutammato. Inoltre, le proprietà postsinaptici possono essere analizzati in maniera indipendente tramite iontoforesi o applicazione di una pressione di glutammato direttamente sulla superficie del muscolo, per misurare la comparsa e la maturazione dei campi recettori del glutammato. Così, sia gli elementi pre-e post-sinaptici possono essere monitorate separatamente o in combinazione durante la sinaptogenesi embrionale. Questo sistema è stato molto utilizzato per isolare e caratterizzare mutanti genetici che impedire la formazione embrionale sinapsi, e quindi svelare i meccanismi molecolari che regolano la specificazione e differenziazione delle connessioni di sinapsi e funzionali, le proprietà di segnalazione sinaptica.

Le registrazioni elettrofisiologiche da<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni consentire analisi di sviluppo muscolare e le proprietà elettriche dei neuroni, così come la caratterizzazione di sinaptogenesi funzionali a livello della giunzione neuromuscolare glutammatergica e centrale colinergici e GABAergici sinapsi.

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Drosophila è un modello genetico di primo piano per lo studio sia dello sviluppo embrionale che delle neuroscienze funzionali. Tradizionalmente, questi campi sono piuttosto...

Registrazioni elettrofisiologiche da muscoli e neuroni motori possono essere ottenute dalla parete corporea di un embrione di oph adeguatamente preparato. I muscoli 6, 7, 12 o 13 possono essere facilmente registrati mediante la configurazione di registrazione in intera cellula e correnti di ampiezza miniatuta robuste possono essere misurate dopo aver ottenuto un sigillo gigaohm per registrare dalla giunzione neuromuscolare. Un elettrodo a sifone può essere utilizzato per aspirare un nervo motore in prossimità del punto di uscita dal sistema nervoso centrale e fornire una stimolazione pre-sinaptica mentre le correnti in intera cellula vengono misurate nel muscolo post-sinaptico.In alternativa, una pipetta può essere utilizzata per somministrare neurotrasmettitori eccitatori vicino all'elettrodo di registrazione mediante iontoforesi o espulsione a pressione. Ciao, sono Ton del Laboratorio di Dave del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Illinois a Chicago. Oggi vi mostrerò come registrare fisiologicamente lo stadio embrionale della giunzione neuro-muscolare e dei neuroni centrali.Queste procedure vengono utilizzate per studiare la funzione e lo sviluppo del sistema neuromuscolare di joof. Queste tecniche sono state originariamente sviluppate da Kendall Brody, trasmesse a David Fit Stone e successivamente a me; oggi le trasmetterò a voi.Questa procedura richiede che gli embrioni vengano prelevati e dissezionati correttamente in anticipo. Per vedere come ciò viene effettuato, consultare la pubblicazione allegata di Jo di Brody Featherstone e Chen. Le registrazioni elettrofisiologiche dai muscoli e dai neuroni embrionali del Jossa utilizzano tecniche standard di bloccaggio in configurazione whole cell. Innanzitutto, l'embrione dissezionato viene posizionato in una piccola camera di registrazione in plexiglass.L'area per la registrazione della fisiologia è schermata elettricamente mediante una gabbia di Faraday e collocata su un tavolo smorzato alle vibrazioni. La camera viene osservata in luce trasmessa utilizzando un microscopio composto eretto con ottiche KY e un obiettivo a immersione in acqua con lunga distanza di lavoro 40x. Le registrazioni oggettive vengono tipicamente effettuate a temperature inferiori a quella ambiente, poiché diventa sempre più difficile eseguire il patch-clamp sui muscoli oculomotori con l'aumentare della temperatura.L'elettrodo di registrazione deve avere una resistenza finale compresa tra cinque e dieci megaohm ed essere lucidato a caldo fino a un diametro interno di circa un micrometro. Alla punta, gli elettrodi di registrazione vengono riempiti all'indietro con una soluzione fisiologica contenente cloruro di potassio e saccarosio. Un filo di terra in argento clorurato viene posizionato nel bagno contenente soluzione salina standard, utilizzata anche per la dissezione dell'embrione.I segnali vengono amplificati mediante un amplificatore per patch clamp, filtrati e memorizzati in forma digitale per analisi successive. È possibile utilizzare qualsiasi sistema adatto per esperimenti di patch clamp, come questo equipaggiamento e software prodotti da Axon. È ora possibile stimolare e registrare cellule provenienti da tre tessuti diversi del sistema nervoso embrionale: muscoli, neuroni alla giunzione neuromuscolare e neuroni motori centrali.Con questa preparazione dell'embrione, è possibile effettuare la registrazione da quasi tutti i muscoli embrionali nella maggior parte degli esperimenti. Concentrarsi sul gruppo di quattro muscoli longitudinali ventrali 6, 7, 12 e 13, in particolare sul muscolo 6 nell'addome anteriore, da due a tre per effettuare la registrazione dai muscoli dorsali. L'embrione deve essere incollato con il lato dorsale verso il basso e dissezionato lungo la linea mediana ventrale nei giovani embrioni.Non è necessario alcun trattamento enzimatico prima della registrazione muscolare. Tuttavia, negli embrioni più sviluppati dotati di cuticola, si forma anche una guaina muscolare prima della registrazione in patch. Questa guaina deve essere rimossa mediante un'immersione breve in una soluzione di collagenasi.La maggior parte delle registrazioni viene effettuata in configurazione whole cell, ottenuta facilmente dallo stato cell attached mediante leggera aspirazione o uno stimolo elettrico rapido. È uno shock. Si tratta di una stimolazione elettrica, per far sì che la membrana cellulare si rompa.In un contesto di cellula intera, le resistenze di sigillo sul muscolo sono tipicamente superiori a un gigaohm; le correnti di cellula intera si ottengono di solito entro tre minuti dalla formazione del sigillo. La resistenza aumenta notevolmente nella maggior parte dei casi e le cellule possono sviluppare una maggiore perdita. Per la tecnica del patch clamping, gli embrioni devono avere almeno 14 ore di vita, poiché stadi di sviluppo precedenti non sono idonei.L'elevato accoppiamento elettrico tra i tubuli miotubulari rende impreciso il voltage clamping per effettuare registrazioni con patch clamp delle fibre muscolari. I potenziali di clamping tipici sono compresi tra -60 e -80 millivolt e possono essere utilizzati metodi di voltage clamp e current clamp. Registrazioni in modalità whole cell riuscite a -60 millivolt sono accompagnate da correnti sinaptiche spontanee robuste che variano da pochi a diverse centinaia di picoampere, come quelle mostrate qui.Grandi correnti della giunzione neuromuscolare possono essere evocate stimolando il nervo motore con elettrodi a suggello. Questi possono essere preparati a partire da una varietà di elettrodi di vetro riempiti con fibre e devono essere levigati alla fiamma per ottenere la configurazione desiderata, applicando una leggera aspirazione sulla pipetta in modo da aspirare un breve segmento del nervo motore segmentale appropriato nelle vicinanze del punto di uscita dal sistema nervoso centrale. Per formare un sigillo stretto, la stimolazione breve funziona meglio con un'intensità determinata sperimentalmente, solitamente compresa tra uno e cinque volt. Una stimolazione affidabile si ottiene impostando l'intensità dello stimolo da uno a due volt al di sopra della soglia determinata sperimentalmente.I recettori del glutammato della giunzione neuromuscolare postsinaptica possono essere attivati applicando il neurotrasmettitore glutammato; molecole cariche come il glutammato possono essere consegnate alla giunzione neuromuscolare mediante iontoforesi. Pipette ad alta resistenza vengono utilizzate per mappare i recettori, mentre pipette a resistenza più bassa vengono impiegate per stimare la risposta totale dei recettori del glutammato. Le pipette iontoforetiche sono caricate con una soluzione di L-glutammato 100 millimolare.Per rilasciare l'L-glutammato, utilizzare un breve impulso di corrente negativa con una piccola corrente positiva di sostegno per prevenire perdite; il glutammato o qualsiasi molecola non carica possono anche essere somministrati alla giunzione neuromuscolare mediante eiezione a pressione. Per l'eiezione a pressione, utilizzare da uno a due millimolari di glutammato ed applicare una forza esterna compresa tra 5 e 10 PSI alla pipetta, usando un pico spritzer.La corrente della giunzione neuromuscolare evocata da stimolazione nervosa o applicazione di glutammato a meno 60 millivolt è tipicamente compresa tra 1500 e 2000 picoampere. Molti neuroni embrionali possono essere identificati singolarmente in base alla posizione del soma e alla morfologia delle proiezioni. La maggior parte delle registrazioni sperimentali si è concentrata su un gruppo di cinque neuroni dorsali superficiali all'interno del cordone nervoso ventrale embrionale.Per effettuare la registrazione da questi neuroni, la guaina del neuroma del cordone nervoso ventrale deve essere rimossa mediante un breve trattamento focale con proteasi; i corpi cellulari vengono desguainati somministrando dallo 0,5 all'1% di proteasi durante la registrazione, utilizzando una pipetta per patch a grande diametro per aspirare il materiale della guaina nella pipetta contenente la proteasi. Un'azione delicata con la bocca può essere usata per far entrare e uscire ripetutamente la guaina dalla pipetta. Dopo uno o due minuti, la guaina si romperà.Le cellule sono ora esposte per la tecnica del patch clamping su cellula intera. Questo paradigma di registrazione non richiede che la soluzione salina venga circolata o riscaldata. La soluzione salina esterna utilizzata in questa preparazione è diversa da quella impiegata nella registrazione dai muscoli.La pipetta per il patch può essere caricata con giallo di Lucifer per visualizzare successivamente la posizione e la morfologia della cellula in patch. Questo è un neurone motorio centrale che ha assorbito il giallo di Lucifer e che è stato visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Le registrazioni in volt clamp su cellula intera vengono effettuate a potenziali di clamping di -60 millivolt a 18 gradi Celsius.Le registrazioni in modalità ponte di corrente sono altresì possibili. I neuroni possono essere stimolati con neurotrasmettitori, come acetilcolina o GABA. Questi vengono applicati sul soma cellulare mediante iontoforesi o eiezione a pressione, come avviene durante la registrazione da njs.Dopo aver stabilito un collegamento in modalità whole cell, si osservano innanzitutto le correnti spontanee. Questo è un minuto di dati grezzi ottenuti dal muscolo ventrale longitudinale embrionale sei, sottoposto a patch clamping a -60 millivolt in assenza di stimolazione. Una preparazione sana mostra tipicamente una marcata attività sinaptica spontanea, rappresentata qui dalle numerose deflessioni della corrente verso il basso.Ecco i dati ottenuti dallo stesso muscolo con stimolazione applicata mediante una pipetta a suzione sul nervo motore che innerva quel muscolo. Ciò ha determinato multiple deflessioni discendenti della corrente, rappresentanti correnti giunzionali evocate o EJC. Questi sono i dati ottenuti dallo stesso muscolo stimolato mediante glutammato ad una concentrazione di un millimolare, applicato tramite eiezione a pressione.Il glutammato apre i recettori provocando ampie deflessioni discendenti. Nella traccia corrente sono mostrati due tracciati che rappresentano due applicazioni successive di glutammato. Vi ho appena mostrato come effettuare la registrazione elettrofisiologica da embrioni di geo soft in stadio avanzato; la registrazione elettrofisiologica utilizza in generale tecniche standard di patch clamp, che qui non possiamo descrivere in dettaglio.In linea ideale, chiunque desideri effettuare la registrazione da embrioni delicati avrà già appreso la tecnica del patch clamp utilizzando un preparato più semplice. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione di singoli neuroni utilizzando tecnologia standard a cellula intera. Esso comprende le immagini di cellule GFP etichettati e neuroni visualizzati durante la registrazione.

Registrazioni cella intero cervello di adulti Drosophila

Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Questa tecnica espone il neuromusculature Drosophila embrionali per immunoistochimica o registrazione elettrofisiologica. E 'utile per studiare eventi precoci nello sviluppo neuromuscolare o l'esecuzione di elettrofisiologia in mutanti che non possono schiudersi.

Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

Il sistema di fibra Gigante è un semplice circuito neuronale di...

Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster</em

Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Il video dimostra la registrazione extracellulare dell'attività neuronale dal sistema nervoso centrale (SNC) delle larve di Drosophila. Il SNC sezionato viene posizionato in una camera di registrazione e l'attività elettrica di un nervo discendente viene registrata per stabilire la frequenza di attivazione di base. Viene quindi introdotto un agente di prova e viene registrata la variazione della frequenza di attivazione per determinare l'effetto eccitatorio o inibitorio dell'agente.

Registrazione extracellulare dell'attività elettrica nel sistema nervoso centrale della Drosophila

Questo protocollo descrive registrazione extracellulare delle possibili azioni di risposta sparati dai neuroni del gusto labellar in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

I microelettrodi affilati consentono un'accurata caratterizzazione elettrofisiologica dell'output dei fotorecettori e degli interneuroni visivi in Drosophila vivente. Qui mostriamo come utilizzare questo metodo per registrare risposte di tensione di alta qualità delle singole cellule alla stimolazione luminosa controllata. Questo metodo è ideale per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali negli occhi composti da insetti.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la progettazione e le prestazioni degli esperimenti in vivo nella Drosophila melanogaster per valutare le conseguenze funzionali delle varianti genetiche rare associate alle malattie umane.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Impara a registrare l'attività elettrica di muscoli e neuroni motori in embrioni di Drosophila utilizzando tecniche di patch-clamp. Questo metodo permette di studiare la sinaptogenesi funzionale nelle giunzioni neuromuscolari glutammatergiche e nelle sinapsi centrali colinergiche e GABAergiche.

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Esplora altri video