Name: La colorazione delle proteine in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Impara a colorare le proteine in gel con Coomassie G-250 senza solventi organici né acido acetico. Questo metodo semplificato consente la visualizzazione delle bande proteiche in un minuto dopo elettroforesi.

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Vorremmo ringraziare l&#39;assistenza tecnica di Ines Racke.

Parte 1: Preparazione della soluzione colorante CBB <ol><li> 60-80 mg di CBB G-250 sono sciolti in 1 litro di acqua bidistillata mescolando per 2-4 ore. Infine, 3 ml di HCl concentrato viene aggiunto alla soluzione blu scuro con mescolando per un altro minuto e conservati al buio per un uso successivo. La soluzione può essere conservata per settimane fino a diversi mesi senza perdere la sua efficienza colorazione. </li><li> HCl concentrato deve essere maneggiato con la massima cura al solito utilizzati sotto una cappa aspirante. La soluzione finale sarà di circa pH 2, per cui i guanti devono essere utilizzati e qualsiasi contatto con la pelle deve essere evitato. </li></ol> Parte 2: SDS-PAGE <ol><li> Aliquote appropriato di campioni di proteine ​​sono miscelati con il caricamento del buffer ad una concentrazione finale di 1x tampone di caricamento. Noi usiamo il caricamento del buffer 2x 125mm con Tris/H3PO4 (pH 7,5 a 25 ° C), 2mM EDTA, 4% SDS, 200mm DTT, 0,02% bromofenolo blu e il 50% glicerolo. Buffer di carico di altri per SDS-PAGE può essere utilizzato come bene. </li><li> Campioni di proteine ​​vengono riscaldate per circa 5 minuti prima di caricarla. Nel frattempo, la camera di elettroforesi su gel è pronto per la corsa. Noi usiamo NuPAGE prefabbricati 4-12% © Bis-Tris gel (Invitrogen) in un SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen) con MES-tampone come il tampone di corsa, ma qualsiasi altro gel elettroforesi e il sistema può essere utilizzato come bene. </li><li> Campioni di proteine ​​sono stati caricati sul gel elettroforesi e correre per 50 minuti a 220V. </li></ol> Parte 3: colorazione del gel <ol><li> La cassetta gel viene smontato e il gel messo in una scatola per le fasi successive di lavaggio. </li><li> Circa 100 ml di acqua bidistillata viene aggiunta al gel e riscaldato nel forno a microonde per 30 secondi. Riscaldamento deve essere interrotto prima della bollitura si verifica. La scatola con il gel viene posto su un agitatore per 3-5 min. e questa fase di lavaggio viene ripetuto due volte con acqua fresca. </li><li> Basta soluzione colorante CBB è aggiunto per coprire il gel nella casella e la casella riscaldato nel forno a microonde per 10 secondi. senza portare all&#39;ebollizione. La scatola con il gel viene posto su un agitatore per la finitura della colorazione. Già dopo 1 minuto, bande proteiche possono essere osservati, dopo 15-30 min. la colorazione è abbastanza forte nella maggior parte dei casi. </li><li> La soluzione colorante è travasato e 50-100 ml di acqua bidistillata è aggiunto per Decolorare ulteriormente lo sfondo azzurro del gel in uno shaker. L&#39;acqua può essere sostituita con acqua fresca per ulteriori decolorazione, se necessario. </li><li> Il gel può essere scansionati, fotografati o essiccato per conservazione a lungo termine </li></ol> Parte 4: Risultati Rappresentante: Vedi fig. 1 per un gel colorato correttamente seguendo la procedura descritta. Vedi fig. 2 per un gel che non è stato lavato abbastanza a lungo prima di colorazione e colorazione residua SDS inibisce efficiente. Si noti che le corsie marcatore (*) contengono la stessa quantità di proteine ​​marker. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Fig. 1: il gel colorato Rappresentante dopo aver caricato i campioni di una purificazione di proteine ​​(*: marcatore di peso molecolare). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Fig. 2: CBB gel colorato che non è stato lavato abbastanza a lungo prima di colorazione CBB. Le bande di proteine ​​appaiono più deboli (si noti che la corsia * marcatore contiene la stessa quantità di proteine ​​come in fig. 1).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi. La procedura descritta sopra è stato pubblicato originariamente nella domanda di brevetto da EM Wondrak (vedi rif.).

<ul><li> Le fasi di lavaggio sono fondamentali per la colorazione efficiente delle proteine. Una riduzione dei tempi di lavaggio di sotto di 2 minuti o ridotto volume di acqua (&lt;50 ml) può risultare in bande proteiche blu pallido, molto probabilmente a causa di una maggiore quantità di residui di SDS nel gel. </li><li> Se le proteine ​​stanno per essere analizzati mediante spettrometria di massa, le fasi di riscaldamento nel forno a microonde deve essere ignorata, il tempo per il lavaggio del gel estesa a circa 10 minuti in ogni passo e il t...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>può essere utilizzato qualsiasi altro CBB G-250</td></tr><tr><td>Acido cloridrico concentrato</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la colorazione delle proteine ​​in gel con coomassie g-250, senza solventi organici acido acetico e

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Nei protocolli classica colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB), soluzioni con alto contenuto di solventi organici tossici e infiammabili (metanolo, etanolo o 2-propanolo) e acido acetico vengono utilizzati per la fissazione, colorazione e decolorazione delle proteine ​​in un gel dopo SDS -PAGE. Per accelerare la procedura, il riscaldamento della soluzione colorante nel forno a microonde per un breve periodo è usato frequentemente. Questo di solito provoca l&#39;evaporazione di metanolo tossici o pericolosi, Etanolo o 2-propanolo e un forte odore di acido acetico in laboratorio, che dovrebbe essere evitato per motivi di sicurezza. In un protocollo originariamente pubblicato in due domande di brevetto da EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), una composizione alternativa della soluzione di colorazione è descritta in cui nessun solvente organico o acido è usato. La CBB è disciolto in acqua bidistillata (60-80mg di CBB G-250 per litro) e 35 mM HCl è aggiunto come l&#39;unico altro composto nella soluzione colorante. Il staning CBB del gel è fatto dopo SDS-PAGE e completa il lavaggio del gel in acqua bidistillata. Riscaldando il gel durante il lavaggio e la colorazione fasi, il processo può essere completato più velocemente e senza compunds tossici o pericolosi stanno evaporando. La colorazione delle proteine ​​si verifica già entro 1 minuto dopo il riscaldamento il gel in soluzione colorante ed è completamente sviluppato dopo 15-30 minuti con uno sfondo blu che è leggermente decolorato completamente dal lavaggio prolungato del gel colorato in acqua bidistillata, senza alterare la proteina macchiata bande.

Un protocollo corto per la colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in gel di poliacrilammide è descritto senza l&#39;utilizzo di solventi organici o acido acetico come nelle procedure di colorazione classica con CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

Nei protocolli classici di colorazione delle proteine che utilizzano il Coomassie Brilliant Blue (CBB), le soluzioni con un'elevata concentrazione di solventi organici tossici e infiammabili...

Per iniziare questa procedura, il Kumasi Brilliant Blue o CBG due 50 viene disciolto in un litro di acqua bidistillata mescolando per due-quattro ore. Successivamente, viene aggiunto acido cloridrico alla soluzione di colore blu scuro, mescolando per un altro minuto, e la soluzione viene conservata al buio per un uso successivo. Dopo la preparazione del campione proteico e la STS page, la cassetta della gel viene smontata e il gel viene posto in una vaschetta per tre successivi passaggi di lavaggio con acqua bidistillata.Dopo il terzo passaggio di lavaggio, l'acqua viene sostituita con una quantità sufficiente di soluzione colorante CBB per coprire il gel nella vaschetta. La vaschetta viene riscaldata nel microonde per 10 secondi e quindi posizionata su un agitatore. Per completare la colorazione, le bande proteiche possono essere osservate già dopo un minuto.Ciao, sono Amri Lawrence della struttura di espressione e purificazione delle proteine presso Emberin Heidelberg. Oggi vi mostreremo un protocollo per la colorazione delle proteine con blu brillante del cocomero G 250 in gel al cloruro. A differenza dei metodi classici di colorazione, il nostro protocollo non utilizza solventi organici né acido acetico.Utilizziamo questo protocollo per analizzare le nostre proteine dopo ogni passaggio di purificazione. Cominciamo dunque. Per preparare la soluzione di colorazione con CBB, da 60 a 80 milligrammi di CBB vengono sciolti in un litro di acqua bidistillata mescolando per due-quattro ore.Dopo che il CBV è stato disciolto, trasferire la soluzione in una cappa chimica. All'interno della cappa, aggiungere con attenzione tre millilitri di acido cloridrico concentrato alla soluzione di colore blu scuro. Durante l'agitazione per un minuto, indossare guanti poiché la soluzione finale avrà un pH pari a due.Una volta preparata, la soluzione viene conservata al buio per un uso successivo. La soluzione può essere conservata per settimane o fino a diversi mesi senza perdere la sua efficacia di colorazione. Per preparare i campioni proteici per la SDS-PAGE, aliquote appropriate di campioni proteici vengono miscelate con buffer di caricamento fino a una concentrazione finale di 1x; quindi i campioni proteici vengono riscaldati per circa cinque minuti prima del caricamento.Mentre i campioni vengono riscaldati, la camera di elettroforesi su gel viene preparata per la corsa. Utilizziamo gel prefabbricati in una cella mini con tampone MES come tampone di corsa. Tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi altro sistema di gel ed elettroforesi.I campioni proteici riscaldati vengono quindi caricati sul gel ed elettroforesi per 50 minuti a 220 volt. Al termine della SDS-PAGE, la cassetta del gel viene smontata e il gel viene posizionato in una scatola contenente 100 millilitri di acqua bidistillata. Per i successivi passaggi di lavaggio, la scatola viene riscaldata nel forno a microonde per 30 secondi.Riscaldare senza portare a ebollizione. Dopo aver scaldato in microonde, posizionare la piastra con il gel su un agitatore per tre-cinque minuti; ripetere questo passaggio di lavaggio due volte con acqua fresca. Dopo i tre lavaggi con acqua, aggiungere la soluzione di CBB nella piastra fino a coprire completamente il gel e riscaldare in microonde per 10 secondi senza portare a ebollizione.Dopo di ciò, la scatola contenente il gel viene posta su un agitatore per completare la colorazione. Le bande proteiche possono essere osservate dopo un minuto e dopo 15-30 minuti. La colorazione è solitamente sufficientemente intensa.Si elimina la soluzione di colorazione e si aggiungono da 50 a 100 millilitri di acqua bidistillata. Per ridurre ulteriormente lo sfondo blu chiaro del gel, agitando su un agitatore, l'acqua può essere sostituita con acqua fresca per un'ulteriore decolorazione. Se necessario, il gel può ora essere scansionato, fotografato o essiccato per un immagazzinamento a lungo termine.Un gel colorato seguendo questa procedura dovrebbe avere questo aspetto. In questo gel, le bande proteiche sono state ben colorate e sono chiaramente visibili, mentre lo sfondo è trascurabile.La prima corsia indicata dall'asterisco contiene marcatori del peso molecolare. Al contrario, un gel che non è stato lavato sufficientemente prima della colorazione avrà questo aspetto: in questo gel, i passaggi di lavaggio sono stati troppo brevi, quindi le bande proteiche non sono state colorate in modo adeguato. Si noti che la corsia indicata dall'asterisco contiene le stesse quantità proteiche di marcatori del peso molecolare rispetto a un gel precedente, ma mostra una colorazione meno efficiente.Abbiamo appena mostrato come colorare le proteine con il blu brillante coomassico su gel di poliammide senza dover utilizzare solventi organici tossici o infiammabili. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che i passaggi di lavaggio sono fondamentali per una colorazione efficiente delle proteine. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Dopo la separazione con metodi elettroforetica, le proteine ​​in un gel può essere rilevato da diversi metodi di colorazione. La colorazione delle proteine ​​con Coomassie Blue, colorazione Silver, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sono dimostrate in questo video.

Colorazione proteine ​​in gel

Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda...

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Utilizzando glicosidasi specifico per rimuovere gli zuccheri da glicoproteine ​​seguita da SDS-PAGE è un metodo valido per individuare modifiche glycan su campioni di proteine ​​ed è una buona scelta per gli studi Glycobiology iniziale. Seguenti modifiche deglycosylation possono essere rilevati come spostamenti della mobilità gel o con la colorazione glycan reagenti sensibili.

Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

In questo video, dimostriamo una procedura per la colorazione combinata del blu di Alcian e dell'argento di frammenti di oligosaccaridi di glicosaminoglicani solfatati. Questa tecnica di colorazione combinata amplifica significativamente le bande di polimeri di glicosaminoglicani di diverse lunghezze nei gel di poliacrilammide.

Colorazione con argento di glicosaminoglicani solfatati: un metodo di colorazione per la visualizzazione di glicosaminoglicani solfatati in gel di poliacrilammide

Al fine di esplorare in modo completo la diversità dei glicani legati all'O, una nuova procedura per l'eliminazione riduttiva della β in gel, combinata con la permetilazione e un metodo di partizione di fase rapida, viene applicata all'analisi dei glicani legati all'O rilasciati direttamente dalle glicoproteine risolte mediante SDS-PAGE e suscettibili di successiva analisi glicomica mediante spettrometria di massa.

Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

L'architettura dei complessi della proteina è essenziale per la loro funzione. Combinando varie tecniche di spettrometrihe di massa ha dimostrato potente per studiare il loro assemblaggio. Forniamo i protocolli per reticolazione chimica e spettrometria di massa nativa e mostrare come queste tecniche complementari consentono a delucidare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina.

Che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag+-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.

Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Questo protocollo si concentra sull'identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

Questo protocollo descrive l'estrazione e la visualizzazione di proteine aggregate e solubili da Escherichia coli dopo il trattamento con un antimicrobico proteotossico. Seguire questa procedura permette un confronto qualitativo della formazione di aggregati proteici in vivo in diversi ceppi batterici e/o tra trattamenti.

Estrazione e visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento di Escherichia coli con un fattore di stress proteotossico

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Impara a colorare le proteine in gel con Coomassie G-250 senza solventi organici né acido acetico. Questo metodo semplificato consente la visualizzazione delle bande proteiche in un minuto dopo elettroforesi.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

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