Name: Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Scopri l'estrazione del DNA genomico da filtri Sterivex 0,22 µm con purificazione mediante gradiente di densità al cloruro di cesio. Questo metodo ottimizzato garantisce DNA di alta qualità per studi di microbiologia ambientale marina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. JJW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC e DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution. SL è stato sostenuto dal Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.

Nota: Tutti i reagenti usati in questo protocollo sono aliquotati dalle scorte di laboratorio in piccoli stock di lavoro-questo è molto importante per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA e la contaminazione delle scorte di laboratorio. Inoltre, quando pipettaggio, assicurarsi di modificare puntali per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Parte prima: la lisi cellulare e digestione <ol><li> Iniziare questo protocollo da scongelamento i filtri Sterivex che contengono biomassa planctonica precedentemente concentrato sul ghiaccio. Per semplicità, qui descritta la procedura per l&#39;elaborazione di un singolo filtro. In pratica, si consiglia di elaborazione 16 o meno dei filtri alla volta. </li><li> Una volta che il filtro ha scongelato, iniziare il primo dei due incubazioni: uno per lisare le cellule e rimuovere l&#39;RNA, e quello di rompere le proteine. Per la prima incubazione, aggiungere 100 microlitri lisozima (125 mg in 1000 ml TE) e 20 ml di RNasi A (10 mcg / ml) per il filtro. Richiudere il filtro con Parafilm e lasciare a ruotare nel forno di ibridazione a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Per l&#39;incubazione prossimo, aggiungere 100 microlitri proteinasi K e 100 ul SDS 20% al filtro. Richiudere con Parafilm e lasciare a ruotare 1-2 ore in più nel forno di ibridazione, questa volta a 55 ° C. </li><li> Utilizzando una siringa 5cc, trasferire il lisato dal filtro Sterivex in una provetta da 15 ml Falcon. Sciacquare il filtro con 1 ml di tampone di lisi e aggiungere il liquido di risciacquo al lisato nel tubo Falcon con la siringa 5cc. Ora che avete lisati e digerito le vostre cellule, si è pronti per estrarre il proprio DNA. </li></ol> Parte seconda: Estrazione del DNA <ol><li> Il passo successivo è quello di utilizzare il metodo fenolo-cloroformio per estrarre il DNA dal lisato. Aggiungere un volume equivalente (circa 3 ml) di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (IAA) per il tubo di lisato, avendo cura di cambiare puntali per pipette per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Vortex per 10 secondi per mescolare bene. </li><li> Rotazione del tubo a 2500 g per 5 minuti, assicurandosi che la centrifuga è equilibrata. Durante la centrifugazione, il fenolo-cloroformio-lisato miscela deve separare in due strati: uno strato organico contenente il fenolo, cloroformio, e le proteine ​​dal campione, sul fondo, e uno strato acquoso, che consiste del vostro DNA, acqua e altri molecole più idrofile, in cima. </li><li> Trasferire la fase acquosa (contenente il DNA) in un nuovo tubo 15 ml Falcon. Fare attenzione a non toccare l&#39;interfaccia con la punta della pipetta (sempre lasciare una piccola quantità dello strato acquoso dietro). </li><li> Per questo nuovo tubo, aggiungere un volume equivalente (circa 3 ml) di Cloroformio: IAA, avendo cura di cambiare puntali per pipette per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Vortex per 10 secondi. Questo passaggio consente di rimuovere qualsiasi residuo fenolo dal campione di DNA. </li><li> Rotazione a 2500 g per 5 minuti o fino a strato acquoso è chiara. Trasferimento strato acquoso in una nuova provetta Falcon e aggiungere 1 ml di TE a pH 8.0, facendo attenzione a non toccare l&#39;interfaccia con la punta della pipetta (sempre lasciare una piccola quantità dello strato acquoso dietro). Questo strato acquoso contenente il DNA estratto. </li></ol> Parte terza: La concentrazione del DNA e di lavaggio <ol><li> Il passo successivo è quello di lavare e concentrare il campione di DNA in un tubo da 15 ml per centrifuga Amicon Ultra. I tubi Amicon costituiti da un filtro che trattiene le molecole pari o superiore a un determinato peso molecolare (il retentato) e un tubo per prendere il flow-through (il filtrato). In questo caso, il filtro trattiene il vostro DNA (il retentato). Trasferite i vostri estrarre il DNA da 2,5 a passo il vano del filtro di un tubo Amicon Ultra. </li><li> Rotazione a 3500 g per 10 minuti. Controllare per assicurarsi che non vi è meno di 1 ml di liquido trattenuta dal filtro Amicon. Se rimane più retentato, riempire il filtro con TE e girare di nuovo. Assicurarsi di utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta TE per evitare contaminazioni incrociate. </li><li> Rimuovere il flusso continuo, o filtrato, ad un altro tubo Falcon e salvarlo in frigo prima di aver confermato il vostro prodotto finale di DNA su un gel (parte quarta). </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone TE al filtro Amicon e far girare a 3500 g per 6 minuti, avendo cura di usare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta TE per evitare contaminazioni incrociate. Filtrato con piscina che dal punto 3.3 e salvare in frigorifero. </li><li> Lavare il DNA altre due volte con TE, per un totale di tre lavaggi (avendo cura di usare sempre un nuovo puntale per pipetta), e salvando il filtrato di volta in volta (come passi al 3.3 e 3.4). Per l&#39;ultimo lavaggio, rotazione fino a 200 a 500 ml di resti retentato nel filtro Amicon. Registrare il volume finale e trasferire i retentato (contenente il DNA) in una provetta etichettata 1,5 ml Eppendorf. </li></ol> Parte quarta: Determinazione della qualità del DNA <ol><li> Controllare la qualità del DNA e valutare la concentrazione del DNA da parte esaurendo i campioni su un gel di agarosio 0,8% gel staINED con 1 ml di etidio bromuro (EtBr) durante la notte. (Siate molto prudenti quando si usa EtBr-it è un noto agente mutageno e cancerogeno. Assicurati di cambiare spesso i guanti ed evitare di EtBr trasferimento al resto del laboratorio e per la pelle.) Caricare i campioni accanto alla scale del DNA, che servono come standard di dimensioni e intensità (vedi punto successivo). </li><li> Nelle corsie prima diversi, scale carico con bande di vari pesi molecolari e concentrazioni. Si consiglia il seguente schema di carico: nelle corsie primo e l&#39;ultimo (corsia esterna), carico 10 ml di 50ng/μl di 1kb + o scaletta 2log. Nelle corsie 2,3 e 4, carico 2 microlitri, 5 microlitri, e 10 microlitri, rispettivamente, della scala 50ng/μl λHindIII. Infine, carico 5 microlitri per corsia di estrarre il DNA con la tintura per ogni campione. </li><li> Attivare il gel a 15 volt per circa 16 ore (si raccomanda di eseguire durante la notte). </li><li> Il giorno dopo, fotografare il gel UV utilizzando un sistema di documentazione del gel. Per determinare il campo peso molecolare del DNA e la sua concentrazione, confrontare le bande campione per fasce di scale. DNA di buona qualità hanno un alto peso molecolare (&gt; 36kb), e mostrano pochi segni di taglio / degrado. Vedere la Figura 1. </li></ol> Parte quinta: centrifugazione su gradiente di cloruro di Cesio <ol><li> Se la qualità del DNA è buona e in quantità sufficiente, si può procedere per purificare il DNA eseguendo un cloruro di cesio (CsCl) centrifugazione in gradiente. Si noti che questa fase di purificazione è opzionale e non è necessario per tutte le applicazioni a valle (per esempio, se si desidera generare librerie fosmid DOVRESTE purificare, mentre se si vuole semplicemente effettuare reazioni di PCR, purificazione di solito non è necessario). In primo luogo, etichetta un tubo per centrifuga per ogni campione. </li><li> Per ogni provetta, aggiungere 160 mg di CsCl, 178 ml di DNA genomico. Dopo aver aggiunto CsCl e del DNA per il tubo, mettere un piccolo pezzo di parafilm sulla parte superiore del tubo e capovolgere delicatamente il tubo di 10-20 volte per miscelare i componenti. Non mescolare pipettando, che può causare taglio del DNA. Successivamente, aggiungere 10 ml di 10 mcg / EtBr microlitri di questo tubo e mescolare nello stesso modo. (Siate molto prudenti quando si usa EtBr-it è un noto agente mutageno e cancerogeno. Assicurati di cambiare spesso i guanti ed evitare di EtBr trasferimento al resto del laboratorio e alla vostra pelle.) </li><li> Assicurarsi che il peso di tutti i tubi sono bilanciate prima della centrifugazione in modo che le differenze di peso tra i tubi sono inferiori a 1 mg. </li><li> Collocare le provette nel rotore hemostat utilizzando, chiudere il coperchio e posizionare il rotore all&#39;interno del ultracentrifuga. </li><li> Chiudere la porta ultracentrifuga. Vuoto sarà applicato non appena si chiude la porta. Eseguire durante la notte a 100.000 giri al minuto per 18 ore e 20 ° C. </li><li> Quando la centrifugazione è completo, estrarre i tubi dal rotore utilizzando hemostat e posto su un rack tubo. </li><li> Visualizza il DNA con luce blu transilluminatore, o se non disponibile, un uso prolungato della luce UV di lunghezza d&#39;onda, in una stanza buia. Indossare un paio di occhiali ambra filtro per vedere la band DNA. Vedere la Figura 2. </li><li> Utilizzando una siringa sterile e 1cc ago (26G 5 / 8), rimuovere banda del DNA e collocarlo in un tubo Eppendorf 1,5 ml. </li><li> Per aiutare a recuperare la maggior parte del DNA intrappolato nello spazio morto nella siringa, lavare la siringa con 100 ul TE e aggiungere la soluzione di risciacquo al tubo. Preparare un tubo con 100 microlitri di buffer TE per campione al fine di prevenire la contaminazione crociata. </li><li> Per rimuovere EtBr dal DNA, aggiungere un volume equivalente di butanolo saturo d&#39;acqua al tubo, invertire i tubi delicatamente 1-20 volte, centrifugare a 10000 rpm per 1 minuto e scartare lo strato superiore. </li><li> Ripetere il lavaggio finché il colore di butanolo è trasparente, 3 - 4 volte di più. </li><li> Posto 4 ml TE in una provetta da centrifuga Ultra Amicon e aggiungere la soluzione di DNA da sopra. </li><li> Centrifugare a 3500 g a temperatura ambiente, fino a quando il volume del DNA è ridotto a circa 100-500 microlitri (circa 6-7 minuti) ed eliminare la flow-through. </li><li> Aggiungi 2ml TE Amicon filtro e centrifugare a 3500 g per 6 minuti, avendo cura di usare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Ripetere due volte. </li><li> Concentrato ad un volume finale di 50-100 microlitri per centrifugazione aggiuntive necessarie e trasferire la soluzione di DNA sul filtro a un nuovo tubo di 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Aggiungere 40 microlitri TE al filtro Amicon e pipettare su e giù lungo entrambe le membrane filtranti per lavare ogni residuo di DNA. Aggiungere a questa soluzione per il tubo in 5.15. </li><li> Posizionare un microcontrollore YM-30 unità di filtro in un tubo microcontrollore e prelavaggio il microcontrollore con l&#39;aggiunta di 200 microlitri di acqua in autoclave e la centrifugazione a 10000 rpm per 7 minuti. </li><li> Aggiungere la soluzione di DNA da 5,16 a microcontrollore lavata al fine di concentrare ulteriormente il DNA. Centrifugare a 5000-10000 g per 1 - 3 minuti. Controllare la quantità di liquidosulla centrifugazione filtro e ripetere fino a quando la quantità di liquido nel filtro si riduce a circa 50 microlitri. </li><li> Posizionare l&#39;unità filtro a testa in giù in un tubo nuovo microcontrollore e centrifugare a 1000 g per 3 minuti. La quantità ideale di soluzione concentrata è di 50-60 microlitri. </li><li> Misurare e registrare la concentrazione del DNA su un NanoDrop e controllo di qualità del picco (dovrebbero essere 260 nm). </li><li> Trasferire una piccola aliquota del DNA in una provetta eppendorf pulita per lavorare fotografici e congelare a meno 20. Trasferire il resto del DNA per un secondo pulita eppendorf e conservare a meno 80. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Quando questo protocollo è eseguita correttamente, si dovrebbe vedere un immagine gel dopo il passaggio a 4,4 Determinazione della qualità del DNA simile alla Figura 1. Concentrazione di DNA estratti effettiva varia a seconda della fonte del campione. Dopo passo 5,7 nel gradiente di CsCl centrifugazione, DNA genomico illuminata da luce blu dovrebbe essere simile alla Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. 0,8% di agarosio immagine elettroforesi su gel ad alto peso molecolare del DNA raccolti da quattro profondità nel subartiche Oceano Pacifico (in duplice copia), colorati con il intercalando agente di bromuro di etidio (10 mg / ml). Gel è stato eseguito a 15V per ~ 16 ore in tampone 1X TBE gel in esecuzione. Bande del campione sono di buona qualità che mostrano scarse prove di taglio meccanico (mostra singole bande o macchie invece di bande multiple) anche se gli estratti 10m conservano alcuni RNA riporto (vedi striscio nel range 0,5-2,0 Kb). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Banda DNA genomico illuminati dalla luce blu dopo la centrifugazione gradiente di CsCl.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

A seconda di quanti campioni devono essere trattati, questo può essere un tempo ad alta intensità procedura a causa delle due fasi di incubazione di un&#39;ora, e il ripetuti lavaggi e le fasi di centrifugazione. E &#39;meglio pianificare due giorni interi per questa procedura di lasciare un sacco di tempo. Se ci sono problemi a far il volume finale dell&#39;estratto nel tubo Amicon di ridurre fino a 200-500μl al momento della concentrazione del DNA e il lavaggio, prova a fare ulteriori lavaggi e centrifugazioni TE (rip...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 cc (ago 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml (ago 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 cc</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi filtranti centrifughi Amicon&amp;#174; Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>Limite nominale del peso molecolare 10.000</td></tr><tr><td>Butanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Saturare con acqua (butanolo:acqua = 1:1)</td></tr><tr><td>Rotore per centrifuga, JA5.3</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Sale disodico di acido etilendiamminotetraacetico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Forno per ibridazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tampone di lisi</td><td></td><td></td><td>Saccarosio 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg in 1000 &amp;#x03BC;l di TE</td></tr><tr><td>Unità filtrante centrifuga Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>Limite di taglio a 50 bp</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo:Cloroformio:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Transilluminatore a luce blu Safe Imager&amp;#8482;</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsolfato di sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>SDS al 20%</td></tr><tr><td>Filtri Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Tampone TE, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&amp;#174;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Rotore per ultracentrifuga, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifuga (7X20 mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Portaprovette per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione del dna da 0,22 filtri mm sterivex e cloruro di cesio densità centrifugazione gradiente

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Questo metodo è utilizzato per estrarre DNA genomico ad alto peso molecolare peso da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 mM Sterivex che sono stati trattati con memorizzazione / buffer di lisi e archiviati a -80 ° C, e per purificare il DNA utilizzando un gradiente di densità di cloruro di cesio. Il protocollo inizia con due di un&#39;ora le fasi di incubazione per liberare il DNA dalle cellule e rimuovere l&#39;RNA. Poi, una serie di fenolo: cloroformio e estrazioni Cloroformio vengono eseguite seguita da centrifugazione per rimuovere le proteine ​​e componenti della membrana cellulare, la raccolta del DNA estratto acquoso, e diverse fasi di scambio tampone per lavare e concentrare l&#39;estratto. Parte quinta descrive la purificazione opzionale tramite gradiente di densità di cloruro di cesio. Si consiglia di lavorare con meno di 15 campioni in una sola volta per evitare confusione e ridurre i tempi del protocollo. Il tempo totale richiesto per questo protocollo dipende dal numero di campioni da estrarre. Per 10-15 i campioni e assumendo l&#39;attrezzatura corretta centrifugazione è disponibile, questo protocollo intera dovrebbe prendere 3 giorni. Assicurarsi di avere i forni ibridazione impostata la temperatura all&#39;inizio del processo.

Descriviamo un metodo per l&#39;estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

Questo metodo viene utilizzato per estrarre DNA genomico ad alto peso molecolare da biomassa planctonica concentrata su filtri Sterivex da 0,22 µM che sono stati...

Ciao, sono Jody del laboratorio di Steven Hallam del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'estrazione del DNA genomico, concentrato da campioni di acqua di mare su filtri STX da 0,2 micron, e per la purificazione di questo DNA mediante centrifugazione in gradiente di densità al cloruro di cesio. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per ottenere DNA ambientale, in modo da poter studiare la struttura, la diversità e il metabolismo delle comunità microbiche negli ambienti marini.Iniziamo. Avvii questo protocollo scongelando sul ghiaccio il filtro di X che è stato precedentemente concentrato con biomassa planctonica, trattato con tampone di lisi e congelato per semplicità. Qui di seguito descriviamo la procedura per l'elaborazione di un singolo filtro.In pratica, si consiglia di elaborare non più di 15 filtri alla volta. Una volta che il filtro si è scongelato, iniziare la prima delle due incubazioni: una per lisare le cellule ed eliminare l'RNA e una per degradare le proteine.Per la prima incubazione, aggiungere 100 microlitri di lisozima e 20 microlitri di RNasi A al filtro. Richiudere ermeticamente il filtro con parafilm e lasciarlo ruotare a 37 gradi Celsius per un'ora. Per l'incubazione successiva, aggiungere 100 microlitri di proteina ace K, 100 microlitri di SDS al 20% al filtro.Richiudere il filtro utilizzando il perfil e lasciarlo ruotare ancora da una a due ore. Questo periodo a 55 gradi. Utilizzare una siringa da cinque cc per trasferire il lisato dal filtro Stax a un tubo falcon da 15 millilitri.Sciacquare il filtro con un millilitro di buffer di lisi e aggiungere il liquido di risciacquo al lisato nel tuo tubo falcon. Ora che hai lisato e digerito le tue cellule, sei pronto per estrarre il loro DNA. Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare il metodo fenolo-cloroformio per estrarre il DNA dal tuo lisato.Aggiungere un volume equivalente, pari a circa tre millilitri, di fenolo cloroformio alcol isoamilico al tubo del lisato e vortexare per 10 secondi per miscelare accuratamente. Centrifugare il tubo a 2.500 ×g per cinque minuti. Durante la centrifugazione, la miscela di lisato con fenolo cloroformio dovrebbe separarsi in due strati.Uno strato organico in basso contenente il fenolo, il cloroformio e le proteine del campione. E uno strato acquoso solitamente in alto, costituito da DNA in acqua e da altre molecole più idrofile. Trasferire lo strato acquoso contenente il DNA in un nuovo tubo Falcon da 15 millilitri. A questo tubo, aggiungere un volume uguale di una miscela di cloroformio e alcol isoamilo e vorticare per 10 secondi.Questo passaggio rimuove qualsiasi fenolo residuo dal campione di DNA. Centrifugare a 2.500 ×g per cinque minuti o fino a quando lo strato acquoso non diventa limpido. Trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo falcon etichettato e aggiungere un millilitro di TE a pH 8.Ora si ha l'estrazione di DNA. Il passo successivo consiste nel lavare e concentrare il campione di DNA in un tubo da ultracentrifuga Amazon da 15 millilitri. Trasferire il campione di DNA nel compartimento del filtro di anon.Le provette ultra tube sono composte da un filtro che trattiene le molecole di peso molecolare uguale o superiore a un valore specificato, un tappo e una provetta per raccogliere il filtrato in uscita. In questo caso, il filtro trattiene il DNA; centrifugare a 3.500 ×g per 10 minuti. Verificare che nel filtro Amon sia presente meno di un millilitro di liquido trattenuto.Se rimane altro retenato, ricaricare il filtro con TE e centrifugare nuovamente. Rimuovere il passato o il filtrato in un altro tubo falcon e conservarlo in frigorifero finché non si è confermato il prodotto finale su un gel; aggiungere due millilitri di tampone TE al filtro Amazon e centrifugare a 3.500 ×g per sei minuti. Rimuovere il filtrato come in precedenza.Lavare il DNA altre due volte con TE per un totale di tre lavaggi, conservando ogni volta il filtrato fino all'ultimo centrifugato, fino a quando nel filtro Amon rimangono da 200 a 500 microlitri di Tate. Annotare il volume finale e trasferirlo in una provetta einor da 1,5 millilitri etichettata. Preparare un'aliquote da 70 microlitri del DNA concentrato lavato da utilizzare come stock di lavoro.Conservare la soluzione di lavoro a meno 20 gradi Celsius. Congelare il resto del DNA a meno 80 gradi Celsius. Verificare la concentrazione e la qualità del DNA del prodotto finale eseguendo i campioni su un gel accanto al DNA.Le scale, utilizzate come standard di dimensione e intensità, richiedono l'allestimento di un gel AROS allo 0,8% con bromuro di aterio da far correre tutta la notte. Nei primi pozzi caricare le scale con bande di diversi pesi molecolari e concentrazioni; si raccomanda il seguente schema di caricamento. Nei primi due pozzi, caricare 10 microlitri di scala one kilobase plus; nei successivi tre pozzi, caricare rispettivamente 2 microlitri, 5 microlitri e 10 microlitri di scala Lambda H three a 50 nanogrammi per microlitro.Infine, caricare cinque microlitri per corsia del campione di DNA estratto. Eseguire l'elettroforesi a 15 volt per circa 16 ore. Fotografare il gel utilizzando il sistema di documentazione gel a UV per determinare l'intervallo di peso molecolare del DNA e la sua concentrazione.Confrontare le bande del campione con quelle del marker. Il DNA di buona qualità avrà un alto peso molecolare e mostrerà scarsi segni di rottura meccanica o degradazione. Se la qualità del DNA è buona e la quantità è sufficiente, procedere alla purificazione del DNA eseguendo un gradiente di cloruro di cesio.Etichettare innanzitutto ogni provetta da centrifuga, una provetta per ogni campione; in ciascuna aggiungere 160 milligrammi di cloruro di cesio e 178 microlitri di DNA genomico. Coprire la provetta con un piccolo pezzo di pellicola e capovolgere delicatamente la provetta da 10 a 20 volte per mescolare i componenti. Non mescolare mediante pipetta, poiché ciò potrebbe causare la rottura del DNA.Quindi aggiungere 10 microlitri di bromuro di AUM al tubo e mescolare nuovamente. Assicurarsi che i tubi siano ben bilanciati prima della centrifugazione e che le differenze di peso tra i tubi siano inferiori a un milligrammo. Inserire i tubi nel rotore dell'ultracentrifuga utilizzando pinzette a forbice.Quindi chiudere il coperchio del rotore e posizionare il rotore all'interno dell'ultracentrifuga. Il vuoto della porta dell'ultracentrifuga verrà applicato non appena si chiude la porta. Eseguire per tutta la notte per un totale di 18 ore a 100.000 giri al minuto a 20 gradi Celsius.Al termine della centrifugazione, rimuovere le provette dal rotore utilizzando pinzette a forbice e posizionarle sul rack. Portare le provette al transluminatore a luce blu, indossare gli occhiali con filtro ambrato. Quindi accendere la luce blu e osservare la banda di DNA utilizzando una siringa sterile da un cc con ago.Rimuovere la banda di DNA e quindi collocarla in una provetta da 1,5 millilitri per aiutare a recuperare la maggior parte del DNA intrappolato nello spazio morto della siringa. Sciacquare la siringa con 100 microlitri di TE e aggiungere la soluzione di risciacquo alla provetta. Preparare una provetta con 100 microlitri di tampone TE per ogni campione al fine di prevenire contaminazioni incrociate.Per rimuovere il bromuro di AUM dal DNA, aggiungere un volume uguale di butanolo saturo di acqua nel tubo. Capovolgere delicatamente i tubi da 10 a 20 volte, centrifugare a 10.000 giri/min per un minuto e scartare lo strato superiore. Ripetere il lavaggio altre tre o quattro volte fino a quando il colore del butanolo diventa trasparente.Collocare quattro millilitri di TE in un tubo per ultracentrifuga e aggiungere la soluzione di DNA ottenuta dalla centrifugazione precedente a 3.500 × g a temperatura ambiente fino a ridurre il volume del DNA a circa 100-500 microlitri, quindi scartare il flusso passante. Aggiungere due millilitri di TE al filtro Amazon e centrifugare a 3.500 × g per sei minuti. Ripetere il lavaggio due volte, per un totale di tre lavaggi, concentrando il TE a un volume finale di 50-100 microlitri mediante ulteriore centrifugazione, se necessario.Trasferire la soluzione di DNA sul filtro in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 40 microlitri di TE sul filtro e aspirare e rilasciare più volte lungo entrambe le membrane del filtro per lavare via tutto il DNA rimanente. Aggiungere questa soluzione alla provetta contenente il DNA concentrato.Posizionare un'unità di filtrazione MicroCon YM 30 in una provetta MicroCon e prerisciacquare il MicroCon aggiungendo 200 microlitri di acqua autoclavata e centrifugando a 10.000 giri al minuto per sette minuti. Aggiungere la soluzione di DNA al MicroCon prerisciacquato per ulteriormente concentrare il DNA, centrifugando a 5.000-10.000 ×g per uno-tre minuti. Verificare la quantità di liquido sul filtro ed eseguire nuovamente la centrifugazione fino a quando la quantità di liquido sul filtro si riduce a circa 50 microlitri.Posizionare l'unità filtrante capovolta in una nuova provetta MicroCon e centrifugare a 1000 ×g per tre minuti. La quantità ideale di soluzione concentrata è di 50-60 microlitri. Trasferire il campione di DNA in una nuova provetta da 1,5 millilitri einor.Misurare la concentrazione di DNA con un NanoDrop e verificare la qualità del picco. Un grafico delle assorbanze per un DNA puro deve presentare un picco netto a 260 nanometri. Congelare il resto del DNA a meno 80 gradi Celsius.Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe osservare un'immagine di gel simile alla figura uno; la concentrazione reale di DNA negli estratti varierà a seconda dell'origine del campione. Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe vedere chiaramente una banda di DNA al centro del tubo. Come mostrato nella figura due, abbiamo appena illustrato come estrarre il DNA genomico da filtri Sterex e purificarlo utilizzando un gradiente di densità di cloruro di cesio.Quando si esegue questa procedura, è importante verificare prima di iniziare di disporre di tutti i reagenti e materiali monouso necessari. In secondo luogo, è consigliabile pianificare almeno tre giorni interi per avere sufficiente tempo per completare con attenzione la procedura. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

DNA-isotopo stabile sondaggio è un metodo di coltivazione-indipendente di identificare e caratterizzare le comunità di microrganismi attivi che sono in grado di utilizzare substrati specifici. L'assimilazione del substrato arricchito in isotopo pesante porta alla costituzione degli atomi indicati sull'etichetta in biomassa microbica. Ultracentrifugazione gradiente di densità recupera DNA etichettato per la valle analisi molecolari.

DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)

Forniamo un protocollo migliore per l'estrazione del DNA alto peso molecolare da stuoie microbica hypersaline. Cellule microbiche sono separate dalla matrice tappetino prima dell'estrazione del DNA e la purificazione. Questo aumenta la concentrazione, la qualità e le dimensioni del DNA. Il protocollo può essere utilizzato per altri campioni refrattari.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Questo video descrive la tecnica di estrazione di vescicole extracellulari da tessuti freschi o congelati. Le vescicole extracellulari isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi per scoprire il loro ruolo significativo nella patogenesi della malattia.

Estrazione di vescicole extracellulari: una tecnica per isolare le vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero utilizzando la centrifugazione differenziale

Questo video dimostra il metodo di purificazione basato sull'ultracentrifugazione a gradiente di densità per isolare sottopopolazioni di vescicole extracellulari adatte per studi di caratterizzazione.

Purificazione di sottopopolazioni di vescicole extracellulari: una tecnica per purificare sottopopolazioni di vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento, la concentrazione e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture cianobatteriche. Vengono inoltre discussi gli approcci per purificare le vescicole da colture a diverse scale, i compromessi tra le metodologie e le considerazioni per lavorare con i campioni sul campo.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche

Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell'approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.

Isolamento e purificazione di vescicole extracellulari batteriche da feci umane mediante centrifugazione a gradiente di densità

Qui, presentiamo una semplice tecnica per valutare la resistenza antimicrobica ambientale (AMR) aumentando la proporzione di DNA extracellulare a basso peso molecolare. Il trattamento precedente con PEG al 20%-30% e NaCl 1,2 M consente di rilevare sia i geni genomici che quelli AMR trasferiti orizzontalmente. Il protocollo si presta a un processo senza kit con un'ulteriore ottimizzazione.

Estrazione avanzata di DNA a basso peso molecolare dalle acque reflue per una valutazione completa della resistenza agli antimicrobici 

Scopri l'estrazione del DNA genomico da filtri Sterivex 0,22 µm con purificazione mediante gradiente di densità al cloruro di cesio. Questo metodo ottimizzato garantisce DNA di alta qualità per studi di microbiologia ambientale marina.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

Esplora altri video