Name: Modello murino per la malattia di Parkinson: da 6-OH lesione dopamina a test comportamentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-15T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Scopri la chirurgia stereotassica con 6-OH-dopamina per indurre lesioni cerebrali nel modello murino di Parkinson. Valuta l'impairment motorio con il test di rotazione da apomorfina per studiare nuove terapie.

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Supportato da Fundação de Amparo uno Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq). Siamo grati a referee anonimi i cui commenti ci hanno aiutato a migliorare sia il manoscritto e video.

Tutti i prodotti chimici conservati in forma solida, come la 6-OHDA e apomorfina, sono stati diluiti in acqua sterile e filtrata all&#39;interno di una cappa a flusso laminare, per evitare contaminazioni. Inoltre, neurotossine e sostanze neuroattivi erano conservati, preparati, trattati e smaltiti secondo le norme stabilite dalle linee guida internazionali 6 e il locale Comitato Biosicurezza. 1 - Anestesia e chirurgia Topi maschi adulti svizzeri (25-30g) sono premedicazione con atropina (0,2 mg / kg, sc) per ridurre il tono vagale e poi anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di ketamina (90-120 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg) . L&#39;animale viene posto su una piastra elettrica a controllo elettronico (Insight) per garantire la temperatura corporea è mantenuta a 37 ° C, come l&#39;induzione della sedazione dura qualche minuto. Il livello di anestesia viene controllato durante tutta la procedura di verifica l&#39;assenza di riflesso ritiro. Dosaggio di anestetico deve essere regolata per ogni ceppo / colonia. A seconda che l&#39;animale e la durata della chirurgia, ulteriori dosi di ketamina può essere necessario. Dopo di che, soluzione salina (NaCl 0,9%) è applicato su entrambi gli occhi per proteggere la cornea si secchi e verificare l&#39;assenza del riflesso lampeggiano in questo primo momento. La pelliccia sopra la testa intera è rasata con un trimmer per garantire il minimo contatto con le zone non sterile. Anestetico locale (Xylocaine) viene applicato al bar orecchio per evitare disagi. Solo una volta ritiro e riflessi sono scomparsi lampeggiare, indicando il livello di anestesia è abbastanza profondo per l&#39;intervento chirurgico (fase 3), l&#39;animale è posizionato sul telaio stereotassico con bocchino e bar orecchio appositamente per questa specie (Insight). Una volta &#39;dislocate, un unguento oculistico (MARCA) viene applicato per proteggere gli occhi degli animali in tutta la chirurgia. Solo dopo essere sicuri che gli occhi sono correttamente protette, la procedura di continuare con la disinfezione della cute della regione chirurgico ripetendo tre applicazioni di iodio povidone seguito da 70% etanolo, utilizzando tamponi sterili cotoni Dopo, il corretto posizionamento delle barre orecchio è garantito mediante una analisi di movimenti laterali della testa (la testa non deve muoversi per garantire che le barre sono fissate in modo sicuro). La corretta inclinazione della testa dorsoventrale sarà verificata più tardi, quando sono rivelati punti di riferimento del cranio. Una incisione sagittale (1,5 cm) è fatto con un bisturi sterile (# 15 lama). Il periostio sopra l&#39;area di interesse è leggermente raschiato via con una nuova lama, e l&#39;osso è pulito con lo sguardo sterile e tamponi di cotone, per scoprire punti di riferimento del cranio: bregma è definito come il punto di intersezione delle suture sagittale e coronale, mentre lambda è il punto di intersezione della sutura sagittale e la linea più adatta passando attraverso la parte sinistra e destra della sutura lambdoidea. La punta di un ago di riferimento allineati verticalmente è prima azzerato al bregma, in esame attraverso il microscopio chirurgico, e poi spostato per toccare il punto lambda. Se la testa è posizionata correttamente, lambda deve essere allo stesso livello dorso-ventrale come bregma, ed entrambi i punti di riferimento devono essere distanti di 4,2 mm lungo il rostro-caudale asse. In caso contrario, le barre orecchie e nasello devono essere allentare e la testa delicatamente inclinata intorno all&#39;asse interaurali, al fine di ottenere la posizione desiderata, che definisce il &quot;piatto del cranio&quot; di riferimento per le misure stereotaxical. La punta dell&#39;ago di riferimento è quindi posizionato alle coordinate desiderato: antero-posteriore (AP 0,5 millimetri) e laterale (L -2,0 mm, a sinistra). La posizione è segnato sul cranio e una piccola (1,2 mm di diametro) del foro è aperto con una punta da trapano sterilizzato, con azione intermittente per evitare che il calore della zona. Frammenti di ossa sono accuratamente rimosso con un curette dentale e lavato con sterili caldo NaCl 0,9%. Il sterilizzati 5 microlitri siringa Hamilton (26 anni calibro; 0,47 mm di diametro esterno) viene caricato con la 6-OHDA soluzione (o di un veicolo per gli animali di controllo) e allineati verticalmente nell&#39;apparato stereotassica. La punta dell&#39;ago (tipo 2 o 12 smusso °), viene quindi inserito nel foro aperto, fino a toccare la superficie piale, per determinare il punto di riferimento del dorso-ventrale coordinate. Una volta determinata questa coordinata, l&#39;ago viene lentamente abbassato per raggiungere le coordinate dello striato (AP: 0,5; L: -2,0 e DV: mm -3,0, sotto la superficie piale 7). Il 6-OHDA soluzione (10 mg 6-OHDA nello 0,9% di NaCl con acido ascorbico 0,02%), che è stato preparato e filtrata all&#39;interno di una cappa a flusso laminare, e deve essere protetto dalla luce da un foglio di alluminio durante tutta la procedura, viene iniettato a una portata di 0.1μL/min. Per gli animali di controllo, un uguale volume di veicoli (0,02 acido ascorbico% e 0,9% di NaCl in acqua sterile) viene iniettato. Una volta che l&#39;intero microlitri 2.0 è stato iniettato, la siringa viene mantenuto in sede per 5 minuti prima di essere molto lentamente ritirato dal cervello, in non meno di 5 minuti. Il cranio è pulita e l&#39;incisione viene chiusa con una sutura in nylon # 6-0 (Shalon). Per fare un ulteriorecura contro le infezioni, una pomata antibiotica locale, come la neomicina, può essere applicato alla pelle suturata. Gli animali vengono rimossi dal telaio, dato 0,5 ml di soluzione fisiologica (sc.) per prevenire la disidratazione, e tenuti al caldo e sotto stretta osservazione fino al recupero completo. Essi vengono poi alloggiati con cibo e acqua ad libitum. Analgesico si aggiunge alla bottiglia di acqua potabile per i primi due giorni dopo l&#39;intervento (dato un consumo medio di acqua giornaliero di 5,5 ml, e una dose raccomandata di 0,03 Ibuprofene mg / g di peso corporeo / giorno; aggiungere 0,82 ml di 20 mg / mL Ibuprofene-Abbott sospensione per 100 ml di acqua potabile). I topi di solito guariscono subito dalla procedura, errante e il raggiungimento di pellet cibo l&#39;acqua con facilità. In ogni caso di disagio evidente, o di qualsiasi segno di infezione, gli animali dovrebbero essere eutanasia secondo le linee guida locali. 2 - prova di comportamento Sebbene la disabilità motoria può essere osservato dopo una settimana, un post-lesione intervallo di un mese è permesso prima di quantificazione affidabile con il test di rotazione. L&#39;animale riceve una iniezione sottocutanea di apomorfina agonista DA (0,5 mg / Kg), ed è posto in un cilindro opaco di 30 cm di diametro, posto 45 centimetri sotto la telecamera di registrazione. E &#39;importante rimuovere eventuali residui e odori provenienti da animali precedentemente testati prima di ogni prova. Dopo un periodo di assuefazione 5 minuti, i movimenti sono registrati nel corso di un periodo di tempo 5 min. Entrambe le controindicazioni e ipsilaterale tutto il corpo di rotazione sono misurati e confrontati con il gruppo di controllo (veicolo iniettato). Se la procedura è stata eseguita correttamente, gli animali di controllo non mostra alcuna rotazione, mentre 6-OHDA animali lesionati inizierà a girare verso il lato controlaterale, dal momento che l&#39;agonista attiva prevalentemente striato supersensibile denervato sul lato leso. Animali punteggio superiore a 7 giri (la visualizzazione di almeno 7 rotazioni controlaterale tutto il corpo al minuto) sono considerati come successo lesionate. L&#39;animale può essere tranquillamente tornati alle loro case 30 min dopo il test, che può essere ripetuto ogni settimana. Nelle nostre mani, meno del 5% dei topi lesionati mostrato tassi di rotazione ottimale.

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</ol>

Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida internazionali per la cura e l&#39;uso dei mammiferi in Neuroscienze e Comportamento di ricerca<sup&gt; 6</sup&gt;, Dopo l&#39;approvazione della cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa (Comissão de Avaliação de Uso de Pesquisa em Animais: UFRJ / CAUAP protocollo DAHEICB # 027). Sono state prese misure adeguate per ridurre al minimo il dolore ed il disagio degli animali da laboratorio.

Ampia lesione unilaterale del nigro-striatale percorso può essere ottenuto in modo affidabile in topi da una singola iniezione stereotassica di 6-OHDA nello striato. L&#39;entità della lesione può essere verificata post-mortem di immunoistochimica per tirosina idrossilasi (che catalizza la tappa limitante della sintesi di DA, cioè la conversione di L-tirosina per diidrossifenilalanina), come illustrato nel video. In vivo, rotazioni controlaterale indotto da apomorfina sono un migliore indica...

<table><tbody><tr><td>Cloridrato di chetamina</td><td>K&amp;#246;nig</td><td></td><td>90-120 mg/Kg</td></tr><tr><td>Cloridrato di xilazina</td><td>K&amp;#246;nig</td><td></td><td>10 mg/Kg</td></tr><tr><td>Solfato di atropina</td><td>Isofarma</td><td></td><td>Isofarma</td></tr><tr><td>Cloridrato di 6 &amp;#8211; idrossidopamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5 &amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td></td><td>0,2%</td></tr><tr><td>Xylocaine (cloridrato di lidocaina)</td><td>AstraZeneca</td><td></td><td>5%&lt;br/&gt;50 mg</td></tr><tr><td>Nebacetin (solfato di neomicina + bacitracina)</td><td>Altana Pharma</td><td></td><td>5 mg/g + 250 Ul/g</td></tr><tr><td>Cloridrato di R-(-)-apomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>0,5 mg/Kg</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico GenTeal con ipromellosa</td><td>Novartis AG</td><td></td><td>&lt;br/&gt;0,33%</td></tr><tr><td>Ibuprofene</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td>4 mg/100 ml di acqua da bere</td></tr><tr><td>Povidina</td><td>Johnson Diversey</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di R-(-)-apomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>0,5 mg/Kg</td></tr></tbody></table>

modello murino per la malattia di parkinson: da 6-oh lesione dopamina a test comportamentali

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Malattia di Parkinson (PD) colpisce almeno 6,5 milioni di persone in tutto il mondo, indipendentemente dal genere, i confini sociali, etniche, economiche, o geografici. Sintomi chiave, quali tremore, rigidità e bradikinesia, si sviluppano quando circa 3 / 4 di cellule dopaminergiche si perdono nella substantia nigra, e non riescono a prevedere il liscio, la regolazione coordinata di circuiti motori striatale. La depressione e allucinazioni sono comuni, e la demenza si verifica alla fine nel 20% dei pazienti. In questo momento, non esiste alcun trattamento per ritardare o arrestare la progressione della malattia di Parkinson. Piuttosto, i farmaci attualmente disponibili obiettivo più verso la riduzione di questi sintomi. Nuove strategie chirurgiche possono reversibilmente accendere i circuiti funzionalmente danneggiato attraverso la stimolazione elettrica delle strutture cerebrali profonde, ma anche se la stimolazione cerebrale profonda è un grande passo avanti, non è adatto per tutti i pazienti. Resta quindi necessario testare nuovi approcci di terapia cellulare in modelli preclinici. Distruzione selettiva delle vie dopaminergiche neurotossici possono essere riprodotti mediante iniezione di 6-idrossidopamina (6-OHDA) o MPTP (1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) mentre riducono farmaci e composti chimici dannosi per ossidativo può anche riprodurre le caratteristiche specifiche del PD nei roditori. A differenza di MPTP, 6-OHDA lesioni causare una massiccia perdita irreversibile dei neuroni, e può essere unilaterale o bilaterale. Il 6-OHDA modello di lesione è affidabile, porta a deficit motori robusti, ed è il più utilizzato dopo 40 anni di ricerca nel rats1. Le interazioni tra le cellule innestate e di host possono essere studiato più a fondo nei topi, piuttosto che nei ratti, il modello è stato recepito a topi 2,3, dove è stato recentemente caratterizzato 4. In questo video ci dimostra come lesione sinistra nigro-striatale percorso di topi anestetizzati lentamente offrendo 2,0 ml di 6-OHDA attraverso un stereotaxically inserito micro-siringa. La perdita di ingresso dopaminergici avviene in pochi giorni, e il deficit funzionale può essere monitorate nel corso post-operatorio settimane e mesi da rotazioni animale voto indotta da agenti dopaminergici 5. Qui vi mostriamo rotazioni controlaterale tutto il corpo che si verificano 10 minuti dopo una singola somministrazione sottocutanea di apomorfina, misurata un mese dopo la lesione. Risultati e svantaggi sono discussi di seguito.

Parkinson malattia è causata dalla perdita di innervazione dopaminergica al corpo striato, che può essere indotta sperimentalmente dalla 6-OH-dopamina. Ci descrivono come eseguire una lesione stereotassica e per monitorare apomorfina comportamenti indotti nei topi di rotazione. Questo modello è utile ed affidabile per testare nuove terapie per il morbo di Parkinson.

Modello murino per la malattia di Parkinson: da 6-OH lesione dopamina a test comportamentali

La malattia di Parkinson (PD) colpisce almeno 6,5 milioni di persone in tutto il mondo, indipendentemente dal genere e dai confini sociali, etnici, economici o geografici. Elementi chiave...

Ciao, sono Fab sva. Sono uno studente laureato del laboratorio di scienze biomediche dell'Università Federale di Genic. In questo video, eseguirò un intervento chirurgico stereotassico per somministrare il neurotossico della dopamina six side drugs al fine di indurre una lesione cerebrale in un modello murino; questa tecnica è fondamentale per lo studio della malattia di Parkinson.Mostrerò inoltre come valutare il grado di deficit motorio mediante il test di rotazione indotto dalla morfina nel comparto superiore. Materiali e strumenti. Per iniziare la procedura, è necessario indossare guanti e l'abbigliamento protettivo appropriato. Accendere il tappetino riscaldante e impostarlo a 37 gradi Celsius.Assicurarsi che tutte le parti dell'apparato stereotassico, così come i materiali e gli strumenti necessari, siano stati puliti e sterilizzati; tutti i gel e le soluzioni che devono essere mantenuti al caldo, come anestetici e soluzione salina sterile, devono essere preparati. I prodotti conservati in forma anidra, come la sei idrossidopamina e l'apo-morfina, devono essere diluiti in acqua sterile per iniezioni e filtrati all'interno di un'appaio a flusso laminare. Anestetizzare e prepar

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Un protocollo per l'esecuzione unilaterale 6-OHDA lesioni del fascio proencefalo mediale è descritto nei topi. Questo metodo ha un basso tasso di mortalità (13,3%) con l'89% degli animali sopravvissuti mostrano una perdita&gt; 95% della dopamina striatale e di 90,63 ± -4,02% pregiudizi ipsiversive rotazione verso il lato della lesione.

Sviluppo di un unilateralmente lesionata 6-OHDA modello murino della malattia di Parkinson

Questo video mostra una procedura per creare un modello di ratto del morbo di Parkinson iniettando la neurotossina 6-idrossidopamina (6-OHDA) nel cervello. L'infusione di neurotossina nel fascio mediale del proencefalo (MFB) colpisce specificamente i neuroni dopaminergici responsabili del controllo motorio, portando alla loro distruzione e replicando i sintomi della malattia di Parkinson.

Generazione del modello di ratto 6-idrossidopamina del morbo di Parkinson

Nella malattia e dei disordini del movimento di Parkinson, in generale, le analisi comportamentali sensibili e affidabili sono essenziali per testare nuove potenziali terapie. Qui, descriviamo una batteria gestibile di prove sensomotorie per i topi che sono sensibili a vari gradi di lesioni al sistema nigrostriatal e utile per gli studi preclinici.

Valutazione della Sensorimotor funzione in modelli murini di malattia di Parkinson

Descriviamo la istituzione di un modello murino per la malattia di Parkinson utilizzando MPTP e valutazioni comportamentali mediante cilindro e campo aperto test per misurare la funzione motoria. Usiamo quindi l-dopa come un esempio per mostrare come applicare questo modello nello studio delle droghe di PD.

Valutazioni del comportamento di locomozione spontanea in un modello murino indotto MPTP del morbo di Parkinson

Qui descriviamo il sistema RatWalker, costruito riprogettando l'apparato MouseWalker per adattarsi alle maggiori dimensioni e peso dei ratti. Questo sistema utilizza la riflessione interna totale frustrata (FTIR), l'acquisizione video ad alta velocità e il software di analisi ad accesso aperto per tracciare e quantificare i parametri dell'andatura.

Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson

Il modello 6-idrossidopamina (6-OHDA) è stato utilizzato per decenni per far progredire la comprensione della malattia di Parkinson. In questo protocollo, dimostriamo come eseguire lesioni nigrostriatali unilaterali nel ratto iniettando 6-OHDA nel fascio proencefalico mediale, valutare i deficit motori e prevedere le lesioni utilizzando il test di stepping.

Il modello di ratto 6-idrossidopamina della malattia di Parkinson

I modelli di roditori di discinesie indotte da L-DOPA sono strumenti preziosi per identificare interventi terapeutici per attenuare lo sviluppo o alleviare le manifestazioni che emergono a causa della somministrazione ripetuta di L-DOPA. Questo protocollo dimostra come indurre e analizzare movimenti di tipo discinetico nel modello di ratto unilateralmente 6-OHDA-lesioned della malattia di Parkinson.

Valutazione delle discinesie indotte da L-DOPA nel modello di ratto unilateralmente 6-OHDA-lesioned della malattia di Parkinson

Questo articolo descrive i metodi per indurre e valutare le discinesie indotte da levodopa in un modello di ratto di malattia di Parkinson. Il protocollo offre informazioni dettagliate sull'intensità e la frequenza di una serie di comportamenti discinetici, sia distonici che ipercinetici, fornendo uno strumento affidabile per testare trattamenti mirati a questo bisogno medico insoddisfatto.

Induzione e valutazione delle discinesie indotte da levodopa in un modello di ratto della malattia di Parkinson

Il presente protocollo descrive l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) di zebrafish adulto con 6-idrossidopamina neurotossica (6-OHDA) al diencefalo ventrale (Dn) e la valutazione della compromissione e del successivo recupero del comportamento di nuoto postlesione utilizzando il test in vasca aperta, che è accompagnato da analisi utilizzando un software di tracciamento video.

Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina

Per studiare i processi di sviluppo delle ascospore in Gibberella zeae, una procedura per la raccolta in condizioni di sterilità è girato in modo da generare il massimo livello di informazioni per la descrizione del protocollo. Ciò dovrebbe facilitare la riproducibilità dell'esperimento, un aspetto cruciale quando è piena genoma test profilo di espressione attuazione.

Gibberella zeae ascospore di produzione e di raccolta di esperimenti di microarray.

Scopri la chirurgia stereotassica con 6-OH-dopamina per indurre lesioni cerebrali nel modello murino di Parkinson. Valuta l'impairment motorio con il test di rotazione da apomorfina per studiare nuove terapie.

Modello murino per la malattia di Parkinson: da 6-OH lesione dopamina a test comportamentali

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