Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale
15 settembre 2009
Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione nel Drosophila melanogaster Embrione sinciziale per studiare la mitosi.
Questa procedura inizia con la raccolta degli embrioni su piastre di succo d'uva fresco da 30 a 60 minuti. Dopo aver rimosso la piastra dalla gabbia del lago, raccogli gli embrioni con un pennello inumidito e posizionali su un doppio nastro adesivo. Arrotolare delicatamente un embrione sul nastro usando metà di una pinzetta fino a quando il corion non si apre.
Raccogli l'embrione e posizionalo delicatamente sul coperchio. Infilate sopra uno strato di colla. Ripeti l'operazione fino a quando non avrai abbastanza embrioni.
Dopo la disidratazione, gli embrioni sono pronti per l'iniezione. Ciao, sono Ingrid Bruce Musher del laboratorio del Dr.Jonathan Sculley nel Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell'Università della California Davis. Oggi ti mostreremo una procedura per microiniettare embrioni sinciziali di Drosophilas.
Utilizziamo questa procedura per studiare il ruolo delle microtte e dei motori a base mitralica nella mitosi. Ad esempio, microiniettiamo anticorpi o altri inibitori di specifiche proteine mitotiche. Analizzando l'effetto dell'inibitore sulla mitosi, siamo in grado di determinare la funzione delle proteine bersaglio.
Quindi iniziamo. Per iniziare i preparativi due o tre giorni prima dell'esperimento, allestisci la gabbia di posa tagliando due piccoli fori di circa un centimetro quadrato sui lati opposti di una bottiglia di plastica. Riempi i fori con un pezzo di cotone, permettendo all'aria di fluire.
Picchietta le mosche nella bottiglia e poi coprila con un piatto di succo d'uva. Con il lievito, tenere la gabbia per le gambe a temperatura ambiente, le mosche deporranno le uova per un massimo di 10 giorni, almeno un giorno prima dell'esperimento. Estrarre gli aghi per iniezione e mantenerli a quattro gradi Celsius.
Il giorno dell'esperimento, preparare e caricare gli aghi. Per prima cosa, togli la tubulina etichettata dal congelatore e mettila in ghiaccio per cinque-15 minuti. Quindi, diluirlo con tampone GPEM e centrifugarlo per 10-15 minuti a 13.000 giri/min e quattro gradi Celsius.
Infine, carica uno o due microlitri nell'ago e mantienilo a quattro gradi Celsius. Per prevenire la polimerizzazione indotta dalla temperatura nell'ago. Prima di impostare il vetrino coprioggetto, preparare la colla eptanica avvolgendo del doppio nastro adesivo e mettendolo in una bottiglia da 100 millilitri.
Aggiungere circa 50 millilitri di eptano, sigillare la bottiglia e farla oscillare per diversi giorni. Prima di preparare gli embrioni, creare una camera di disidratazione in cui verranno inseriti gli embrioni prima dell'iniezione. Per fare questo, metti una parte di un piatto da 35 millimetri all'interno di un piatto di Petri da 100 millimetri per fare un tavolo aggiungere essiccatore, a destra, che è solfato di calcio anidro attorno ad esso in modo che l'altezza dell'essiccatore a destra non sia superiore al tavolo e al coperchio.
Per iniziare a preparare gli embrioni, per prima cosa, raccoglili dalla gabbia del lago cambiando il piatto del succo d'uva con il lievito ogni ora, gli embrioni dovrebbero essere visualizzati circa due ore dopo l'inizio della raccolta. Per preparare il vetrino coprioggetto, posizionarlo su un lato di un microscopio, far scorrere e fissare i quattro angoli con del nastro adesivo verso il basso in modo che non si muova. Usando un applicatore con punta di cotone, metti uno strato di colla eptano in linea sul vetrino coprioggetto.
La colla non deve essere viscosa e deve asciugarsi in pochi secondi. Se è troppo denso, aggiungi altro eptano. Infine, metti un pezzo di doppio nastro adesivo sul vetrino accanto al coperchio.
Infilare con un pennello inumidito. Prelevare con cura gli embrioni dalla piastra del succo d'uva e posizionarli sul doppio nastro adesivo sul vetrino. Quindi, usa metà di una pinzetta per arrotolare gli embrioni sul doppio nastro adesivo fino a quando il corion non si apre.
Raccogli l'embrione facendolo rotolare delicatamente sul Corian in modo che aderisca alla pinzetta e posizionalo sulla colla eptanica sul coperchio. Scivolare con il lato lungo dell'embrione parallelo al lato lungo del vetrino coprioggetto. Posizionare da 10 a 20 embrioni in una fila.
Rimuovere il vetrino coprinte e metterlo nella camera di disidratazione per tre-otto minuti. Il tempo dipende dall'umidità locale e dalla quantità da iniettare. Quindi, posizionare il vetrino coprioggetto su una camera metallica con grasso per vuoto.
Infine, copri gli embrioni con olio di carbonio halo per evitare un'ulteriore disidratazione. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione. Innanzitutto, trova gli embrioni con un obiettivo 16 x.
Allontana gli embrioni e trova l'ago senza spostare il piano focale. Centrare l'ago e spostarlo verso l'alto senza spostarlo in direzione X o Y. Per aprire l'ago, inserire il bordo del vetrino coprioggetti nel campo visivo, ma non dove si troverà l'ago.
E abbassa l'ago sullo stesso piano focale. Muovi con molta attenzione il vetrino coprioggetto finché non colpisce l'ago e lo rompe delicatamente. Sposta l'ago verso l'alto.
Ora mettete in vista gli embrioni. Abbassa l'ago nell'olio e assicurati di ottenere delle belle gocce di liquido dall'ago. Sposta costantemente l'embrione nell'ago, inietta una goccia nell'embrione e poi allontana l'embrione.
Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, sono pronti per l'osservazione su un microscopio confocale con un obiettivo 60 o 100x. Un embrione di controllo dovrebbe assomigliare a quello di questo film. Si tratta di un embrione che esprime tubulina GFP e istone RFP ripreso con un obiettivo 100 x su un microscopio confocale a disco rotante.
Il tempo totale indicato è di otto minuti. Gli appezzamenti della distanza da polo a polo sono molto riproducibili e sono una misura affidabile del successo negli embrioni di controllo. Dovrebbero assomigliare a quelli mostrati qui per i cicli da 11 a 13.
In questo film viene mostrato un altro embrione di controllo. Questo esprime KLP 61 FGFP e iniettato con tubulina r Domine. Anche questo è stato ripreso con un obiettivo 100 x su un disco rotante confocale e il tempo totale è di sette minuti.
Questo film è stato acquisito immediatamente dopo la microiniezione e il gradiente nella concentrazione di tubulina r Domine è chiaramente visibile all'inizio del film. Questi embrioni possono essere utilizzati per studiare l'inibizione di Klp 61 F dopo la microiniezione dell'anticorpo Klp 61 F. Possiamo vedere la perdita di Klp 61 FGFP dai fusi.
Ti abbiamo appena mostrato come microiniettare embrioni incisionali di drosophilas. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire i controlli, esercitarsi prima a iniettare il tampone o la rutina da soli e assicurarsi che la mitosi proceda normalmente attraverso il cellulare. Una volta che tutte le tue iniezioni sono affidabili e non causano danni, puoi iniettare un inibitore e studiare l'effetto di quella particolare inibizione.
Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della microiniezione e dell'imaging ad alta risoluzione nell'embrione sinciziale di Drosophila melanogaster per studiare la mitosi. La procedura prevede una manipolazione attenta degli embrioni per garantire un'imaging e un'analisi di successo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
Sfondo
- Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca biologica.
- Comprendere la mitosi è cruciale per acquisire informazioni sulla divisione cellulare e lo sviluppo.
- Le tecniche di imaging ad alta risoluzione migliorano l'osservazione dei processi cellulari.
- La microiniezione consente una manipolazione precisa degli embrioni a scopi sperimentali.
Obiettivo dello studio
- Indagare le dinamiche della mitosi negli embrioni di Drosophila.
- Utilizzare tecniche di imaging avanzate per un'osservazione cellulare dettagliata.
- Stabilire un protocollo affidabile per futuri studi in biologia dello sviluppo.
Metodi utilizzati
- Raccolta di embrioni su piastre di succo d'uva.
- Microiniezione di embrioni per manipolazione sperimentale.
- Imaging ad alta risoluzione per osservare i processi mitotici.
- Manipolazione attenta degli embrioni per prevenire danni durante la preparazione.
Risultati principali
- Visualizzazione di successo delle fasi mitotiche negli embrioni di Drosophila.
- Dimostrazione dell'efficacia delle tecniche di microiniezione.
- Fornitura di informazioni sul tempismo e la regolazione della divisione cellulare.
- Stabilimento di un quadro per la futura ricerca sullo sviluppo embrionale.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per studiare la mitosi negli embrioni di Drosophila.
- L'imaging ad alta risoluzione è cruciale per comprendere le dinamiche cellulari.
- Questo studio contribuisce al più ampio campo della biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional interrogation of mitotic proteins in a rapid, synchronous in vivo system, supporting target validation through phenotypic readouts of protein inhibition. The syncytial Drosophila embryo provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of mitotic targets, allowing assessment of protein function prior to lead identification. Quantitative imaging of spindle dynamics offers predictive confidence in target essentiality and pathway involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by visualizing loss-of-function phenotypes via protein-specific antibody microinjection.
- Operational Value: Supports biological de-risking through gradient-dependent phenotypic series resembling allelic mutants.
- Predictive Value: Facilitates target confidence assessment by correlating inhibition strength with mitotic defect severity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible mitotic readouts (pole-to-pole distance) for compound or inhibitor screening.
- Quantitative Output: Provides measurable, imaging-based endpoints enabling dose-response analysis of protein inhibition.
- Scalability: Allows parallel embryo preparation and imaging for medium-throughput functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic machinery conservation supports translational biomarker alignment with human cell division pathways.
- Preclinical Continuity: Enables mechanistic follow-up from genetic hits to functional validation in a living system.
- Risk-Adjusted Decisions: Helps prioritize targets based on phenotypic penetrance and specificity of inhibition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate mitotic targets before assay development and lead identification stages, leveraging in vivo functionality.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via direct perturbation of mitotic proteins.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable mitotic imaging readouts.
- Analytics: Delivers objective, imaging-based measurements (e.g., spindle length) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved mitotic mechanisms and protein function conservation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple mitotic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function through direct, reversible protein inhibition in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized embryo preparation and injection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization using phenotypic severity gradients.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and live confocal imaging.
- Dependent on microinjection apparatus, antifade oils, and high-resolution imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging and injection consistency.
- Adaptation considerations include protein solubility, antibody functionality, and fluorescent tag compatibility.
- Practical limitations include embryo viability post-injection and potential diffusion barriers in larger embryos.
