Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

La fabbricazione di dispositivi di co-coltura di neuroni microfluidici multicompartimentali inizia con la definizione dei serbatoi sul blocco di PMMA con una fresatrice, seguita dalla goffratura a caldo di array di microcanali che collegano i compartimenti. Una volta che lo stampo A-P-M-M-A è stato preparato, lo stampo master A-P-D-M-S viene replicato dallo stampo in PMMA e rivestito con tricloroetilene. Il dispositivo finale viene replicato dallo stampo master PDMS e assemblato su una piastra di coltura rivestita in PDL.

I neuroni primari di ratto da E 16 a 18 vengono quindi caricati nel compartimento soma e coltivati per due settimane prima di aggiungere P da una a due cellule di oligodendrociti di ratto sopra gli strati assonali all'interno del compartimento ggl dell'assone per la co-coltura. Ciao, sono J Par del Nano Bio Systems Laboratory nel dipartimento di ingegneria elettrica e informatica dell'Università del Texas e m. Oggi vi mostreremo una procedura per la fabbricazione di una piattaforma di cocoltura di neuroni microfluidici multicompartimentali.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'interazione tra i neuroni e le glia del sistema nervoso centrale in vitro. Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, utilizzare una micro fresatrice per realizzare scomparti profondi 3,5 millimetri.

Nel blocco A-P-M-M-A definire un compartimento soma e sei compartimenti ggl assonali. Dopo aver preparato gli scomparti, sonicare e isopropanolo per 10 minuti per rimuovere i detriti, creare strutture di micro creste sul vetrino utilizzando la fotolitografia convenzionale e il processo di incisione a umido per goffrare a caldo i modelli di micro cresta dal vetro. Far scorrere prima sul master in PMMA, allineare manualmente lo stampo master in PMMA e il substrato di vetro.

Quindi aumentare la temperatura a 115 gradi Celsius su una pressa a caldo. E una volta raggiunta la temperatura, applicare 0,5 tonnellate di peso per cinque minuti. Dopo cinque minuti, raffreddare a 40 gradi Celsius e rilasciare la pressione.

Ora inizia a preparare il master PDMS. Miscelare il prepolimero PDMS con il suo agente indurente in un rapporto di 10 a uno in peso, tagliare il master in PMMA in blocchi di dimensioni 50 millimetri per 50 millimetri. Utilizzando una sega a piega, posizionarlo all'interno di una botte e versare la miscela PDMS sopra il master in PMMA, posizionare la botte in un essiccante collegato a una pompa a vuoto e DGA per 15 minuti.

Per rimuovere le bolle generate durante il processo di miscelazione PDMS. Una volta rimosse tutte le bolle, mettere la botte in un forno livellato a 85 gradi Celsius per un'ora per la polimerizzazione. Ora che il PDMS è completamente indurito, staccare il master PDMS dal master in PMMA, rivestire a vapore il master PDMS inserendolo all'interno di un essiccante con due o tre gocce di tricloroetilene e applicare il vuoto per 15 minuti.

Il rivestimento del master PDMS facilita il rilascio del dispositivo di co-coltura dei neuroni PDMS finale dallo stampo master PDMS Dopo il rivestimento, il master PDMS viene brevemente risciacquato con alcol isopropilico per rimuovere l'eccesso di tricloroetilene e asciugato con il dispositivo di co-coltura dei neuroni gassosi di azoto La fabbricazione dal polimero PDMS è simile alla preparazione dello stampo master PDMS descritto nella sezione precedente. Iniziare mescolando il prepolimero PDMS con l'agente oscurante in un rapporto di 10 a uno in peso, procedere a versare la miscela PDMS sopra il master PDMS. È importante non versare troppo PDMS in modo che la struttura PDMS alta 3,5 millimetri sul master non sia completamente immersa.

DGA all'interno di un essiccante collegato a una pompa a vuoto per 15 minuti. Quando tutte le bolle sono state rimosse, mettere il PDMS all'interno di un forno livellato a 85 gradi Celsius per un'ora per la polimerizzazione alla fine di un'ora, togliere il PDMS dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Quindi staccare delicatamente i dispositivi di coltura neuronale PDMS dal master PDMS.

Avvolgere i dispositivi PDMS in paraforma per proteggerli da polvere o detriti. Terminando tagliando il PDMS avvolto in paraforma in singoli pezzi utilizzando un trapano a colonna dotato di una lama, i dispositivi PDMS di co-coltura neuronale sono quasi pronti per l'uso in piastre di coltura cellulare. Prima di posizionare il dispositivo PDMS di co-coltura neuronale in una piastra di coltura cellulare, inserire il dispositivo all'interno del pulitore al plasma ed esporlo al plasma d'aria per 90 secondi per rendere la superficie idrofila.

Questo trattamento faciliterà il riempimento dei microcanali con terreni di coltura dopo l'assemblaggio su piastre rivestite di polide licina. Per sterilizzare il dispositivo trattato al plasma, immergerlo in etanolo al 70% per 30 minuti e spostare il contenitore nella cappa biologica sterile. Dopo 30 minuti, estrarre il dispositivo e asciugare con azoto gassoso filtrato con un filtro milliporo da 0,2 micron.

Successivamente, posizionare i dispositivi essiccati sopra una piastra di coltura a sei pozzetti in polistirene rivestito di polistirene D e applicare una leggera pressione per garantire una tenuta ermetica tra la superficie della piastra di coltura e il ghiaccio del dispositivo. Riempire ora lo scomparto soma con terreni di coltura. Attendere un minuto o due per assicurarsi che non vi siano bolle intrappolate all'interno dei microcanali.

Quindi riempire i sei compartimenti gliali assonali. Infine, incubare i dispositivi riempiti con terreni di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte per rimuovere eventuali detriti o residui tossici. Dopo l'incubazione notturna, la coltura può essere avviata per prepararsi al caricamento delle cellule nel dispositivo.

Utilizzare una pipetta per aspirare i terreni di coltura dai compartimenti Soma e Axon. Quindi caricare 40 microlitri di cellule neuronali primarie del prosencefalo dal giorno embrionale 16 al 18 ratti nel compartimento soma attorno agli ingressi del microcanale a una densità aerea di 500 cellule per millimetro quadrato. È importante non toccare il dispositivo PDMS durante il caricamento delle cellule, poiché può rompere il sigillo tra il dispositivo e la piastra di coltura cellulare.

Queste immagini microscopiche mostrano cellule neuronali colorate di calcio am. All'interno del compartimento del soma, le cellule sono caricate uniformemente all'interno del compartimento e situate vicino ai canali microfluidici. Incubare i dispositivi caricati con le cellule per 30 minuti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per migliorare l'adesione delle cellule al substrato.

Dopo questa incubazione, riempire tutti gli scomparti con terreni di coltura. Mantenere le cellule che crescono nel dispositivo a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di CO2 e sostituire solo metà del terreno di coltura ogni tre o quattro giorni. All'interno dei compartimenti dell'assale gliale dovrebbe formarsi una fitta rete assonale.

Dopo due settimane di coltura dopo 14 giorni di coltura, i neuroni primari in vitro CLIA vengono aggiunti prima del carico Le cellule aspirano circa il 60% dei terreni di coltura dai compartimenti in cui gli oligodendrociti sono stati sezionati dagli emisferi cerebrali dei ratti Sprague Dolly in postnatale. Il primo o il secondo giorno aggiungono cinque microlitri di cellule oligodendrocitarie a ciascun compartimento della glia assonale a una densità aerea di 1000 cellule per quadrato. Bisogna fare attenzione millimetrica a non toccare il substrato inferiore utilizzando la pipetta durante il caricamento, poiché può danneggiare la rete assonale formata sul substrato dopo l'aggiunta degli oligodendrociti, incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius e poi riempire i compartimenti.

Con i terreni di coltura, continuare a coltivare i neuroni come prima dell'aggiunta del CLIA, cambiare solo metà dei terreni di coltura ogni tre o quattro giorni per altre due settimane mentre si studia il sistema nervoso centrale dei mammiferi. Interazione con la glia degli assoni quando gli esperimenti vengono eseguiti correttamente. Le cellule neuronali caricate nel compartimento soma si trovano vicino agli ingressi dei microcanali e uno strato assonale inizia a formarsi all'interno dei compartimenti Ggl dell'assone.

Dopo una settimana di coltura, i segni di aggregazione delle cellule neuronali all'interno del compartimento soma possono essere un'indicazione che le cellule non sono sane durante il caricamento degli oligodendrociti. Dopo due settimane di coltura neuronale, i compartimenti ggl degli assoni devono essere coperti con uno strato denso di assoni e gli oligodendrociti devono essere caricati sopra lo strato assonale. Vi abbiamo appena mostrato come fabbricare una piattaforma di coltura neuroco multicompartimentale e come utilizzarla per studiare l'interazione della neuroglia del SNC in vitro.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di tenere i dispositivi lontani dalla polvere e di non sterilizzarli in etanolo per troppo tempo poiché non possono deteriorare l'incollaggio. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e fortunato i tuoi esperimenti.