Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

La fabbricazione del dispositivo microfluidico per colture cellulari neuronali in compartimenti multipli inizia con la definizione dei serbatoi sul blocco di PMMA mediante una macchina da fresatura, seguita dalla termoimpronta di matrici di microcanali che collegano i compartimenti. Una volta preparato il modello A-P-M-M-A, si replica da questo un master del modello A-P-D-M-S in PMMA, rivestito con tricloroetilene. Il dispositivo finale viene replicato dal master in PDMS e assemblato su una piastra per colture rivestita con PDL.

Neuroni primari di ratto E16-E18 vengono quindi caricati nel compartimento del soma e coltivati per due settimane prima di aggiungere uno o due oligodendrociti di ratto sopra gli strati assonali all'interno del compartimento axon ggl per la co-coltura. Ciao, sono J Par del Nano Bio Systems Laboratory del dipartimento di Ingegneria Elettrica e Informatica della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per la fabbricazione di una piattaforma microfluidica multicompartimento per la co-coltura neuronale.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'interazione tra neuroni e cellule gliali del sistema nervoso centrale in vitro. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, utilizzare una fresatrice micrometrica per creare compartimenti profondi 3,5 millimetri.

Nel blocco A-P-M-M-A definire un compartimento del soma e sei compartimenti assone ggl. Dopo aver preparato i compartimenti, sottoporli a sonicazione e isopropanolo per 10 minuti per rimuovere i detriti, creare strutture a microcresta sul vetrino utilizzando la litografia ottica convenzionale e il processo di incisione umida, quindi imprimere a caldo i modelli a microcresta dal vetrino. Posizionare lo stampo in PMMA sul master in PMMA, quindi allineare manualmente il master dello stampo in PMMA e il substrato di vetro.

Quindi aumentare la temperatura a 115 gradi Celsius su una pressa calda. Una volta raggiunta la temperatura, applicare un peso di 0,5 tonnellate per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, raffreddare a 40 gradi Celsius e rilasciare la pressione.

Ora iniziare a preparare il master in PDMS. Mescolare il prepolimero di PDMS con il suo agente indurente in un rapporto di 10 a 1 in peso, tagliare il master in PMMA in blocchi di dimensioni 50 millimetri per 50 millimetri. Utilizzando una sega a nastro, posizionarlo all'interno di un contenitore e versare la miscela di PDMS sopra il master in PMMA; quindi collocare il contenitore in un desiccator collegato a una pompa a vuoto e sottoporlo a degasaggio per 15 minuti.

Per rimuovere le bolle generate durante il processo di miscelazione del PDMS. Una volta eliminate tutte le bolle, posizionare il contenitore in un forno livellato a 85 gradi Celsius per un'ora per la polimerizzazione. Ora che il PDMS è completamente polimerizzato, staccare il master in PDMS dal master in PMMA, vaporizzare il master in PDMS posizionandolo all'interno di un essiccatore con due o tre gocce di tricloroetilene ed applicare il vuoto per 15 minuti.

Il rivestimento del master in PDMS facilita il rilascio del dispositivo finale per la co-coltura di neuroni dallo stampo master in PDMS. Dopo il rivestimento, il master in PDMS viene risciacquato brevemente con alcol isopropilico per rimuovere l'eccesso di tricloroetilene e asciugato con gas azoto. La fabbricazione del dispositivo per co-coltura di neuroni a partire dal polimero PDMS è simile alla preparazione dello stampo master in PDMS descritta nella sezione precedente. Iniziare mescolando il pre-polimero PDMS con l'agente opacizzante in un rapporto di 10 a 1 in peso, quindi versare la miscela di PDMS sulla superficie del master in PDMS. È importante non versare troppo PDMS, in modo che la struttura in PDMS alta 3,5 millimetri sul master non venga completamente immersa.

Posizionare le DGA in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto per 15 minuti. Quando tutte le bolle saranno rimosse, inserire il PDMS in un forno livellato a 85 gradi Celsius per un'ora per la polimerizzazione. Trascorso un'ora, rimuovere il PDMS dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Successivamente, staccare delicatamente i dispositivi per colture neuronali in PDMS dal master in PDMS.

Avvolgere i dispositivi in PDMS con parafilm per proteggerli da polvere o detriti. Completare il processo tagliando il PDMS avvolto in parafilm in pezzi singoli utilizzando un trapano a colonna dotato di lama; i dispositivi in PDMS per la co-coltura neuronale sono ora quasi pronti per essere utilizzati nelle piastre per colture cellulari. Prima di posizionare il dispositivo in PDMS per la co-coltura neuronale in una piastra per colture cellulari, inserire il dispositivo nel pulitore al plasma ed esporlo al plasma d'aria per 90 secondi al fine di rendere la superficie idrofila.

Questo trattamento faciliterà il riempimento dei microcanali con il mezzo di coltura dopo l'assemblaggio su piastre rivestite con poli-l-lisina. Per sterilizzare il dispositivo trattato al plasma, immergerlo in etanolo al 70% per 30 minuti e trasferire il contenitore nell'incubatore sterile. Dopo 30 minuti, rimuovere il dispositivo e asciugarlo con gas azoto filtrato attraverso un filtro Millipore da 0,2 micron.

Successivamente, posizionare i dispositivi essiccati su una piastra per colture in polistirene a sei pozzetti rivestita con poli-D-lisina ed esercitare una leggera pressione per garantire un sigillo stretto tra la superficie della piastra e il dispositivo in ghiaccio. Ora riempire il compartimento per il soma con mezzo di coltura. Attendere uno o due minuti per assicurarsi che non siano intrappolate bolle d'aria all'interno dei microcanali.

Quindi riempire i sei compartimenti assone-glia. Infine, incubare i dispositivi riempiti con mezzo di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte per rimuovere eventuali detriti o residui tossici. Dopo l'incubazione notturna, si può iniziare la coltura per prepararsi al caricamento cellulare nel dispositivo.

Utilizzare una pipetta per aspirare il mezzo di coltura dai compartimenti Soma e Assone. Quindi, aggiungere 40 microlitri di cellule neuronali primarie del proencefalo provenienti da ratti al giorno embrionale 16-18 nel compartimento del soma intorno agli ingressi dei microcanali, con una densità areale di 500 cellule per millimetro quadrato. È importante non toccare il dispositivo in PDMS durante il caricamento delle cellule, poiché ciò potrebbe rompere il sigillo tra il dispositivo e la piastra per coltura cellulare.

Queste immagini microscopiche mostrano cellule neuronali colorate con ammone di calcio. All'interno del compartimento del soma, le cellule sono uniformemente caricate all'interno del compartimento e si trovano in prossimità dei canali microfluidici. Incubare i dispositivi caricati con le cellule per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius per favorire l'adesione cellulare al substrato.

Dopo questo periodo di incubazione, riempire tutti i compartimenti con mezzo di coltura. Mantenere le cellule in crescita nel dispositivo a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5%CO2, sostituendo solo metà del mezzo di coltura ogni tre o quattro giorni. All'interno dei compartimenti assone-glia dovrebbe formarsi una rete assonale densa.

Dopo due settimane di coltura, a seguito di 14 giorni di coltivazione, le cellule CLIA di neuroni primari in vitro vengono aggiunte prima del caricamento; aspirare circa il 60% del mezzo di coltura dai compartimenti. Gli oligodendrociti sono stati dissecati dagli emisferi cerebrali di ratti Sprague Dawley al periodo postnatale. Dal primo al secondo giorno, aggiungere cinque microlitri di cellule oligodendrocitiche a ciascun compartimento assone-glia a una densità superficiale di 1000 cellule per millimetro quadrato. È necessaria cautela per non toccare il substrato sottostante con la pipetta durante il caricamento, poiché ciò potrebbe danneggiare la rete assonale formata sul substrato. Dopo l'aggiunta degli oligodendrociti, incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi riempire i compartimenti.

Continuare a coltivare i neuroni con il mezzo di coltura come prima dell'aggiunta del CLIA, sostituendo metà del mezzo di coltura ogni tre o quattro giorni per altre due settimane durante lo studio dell'interazione assone-glia nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, quando gli esperimenti vengono eseguiti correttamente. Le cellule neuronali caricate nel compartimento del soma si posizionano vicino agli ingressi dei microcanali e uno strato assonale inizia a formarsi all'interno dei compartimenti Ggl per l'assone.

Dopo una settimana di coltura, la presenza di aggregazioni cellulari neuronali all'interno del compartimento somatico può indicare che le cellule non sono in buone condizioni durante il caricamento degli oligodendrociti. Dopo due settimane di coltura neuronale, i compartimenti assonali dovrebbero essere ricoperti da uno strato denso di assoni e gli oligodendrociti dovrebbero essere caricati sulla superficie dello strato assonale. Vi abbiamo appena mostrato come realizzare una piattaforma di coltura neurogliale multicompartimento e come utilizzarla per studiare in vitro le interazioni tra cellule nervose centrali e neuroglia.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di proteggere i dispositivi dalla polvere e di non sterilizzarli nell'etanolo per troppo tempo, poiché potrebbe compromettere il legame. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna nei vostri esperimenti.