Dissezione di dischi immaginale da larve 3 Instar Drosophila

Oggi vi mostrerò come dissezionare i dischi immaginali da larve di Drosophila di terzo stadio. I dischi delle larve di terzo stadio possono essere utilizzati per studiare diversi processi di sviluppo. Nel nostro laboratorio li osserviamo per analizzare il processo di apoptosi, ma è possibile esprimere diverse proteine al loro interno e studiarli in questo modo, osservando una varietà di processi di sviluppo che avvengono all'interno dei dischi.

Per fare ciò, utilizzerò diversi strumenti molto importanti. Il primo è il bastoncino per il prelievo, con il quale preleveremo le larve dalle loro piastre. Successivamente, ed è molto importante, ci serviremo della pinzetta da dissezione, che deve essere estremamente affilata per consentire lo svolgimento della dissezione.

Quindi useremo una lama chirurgica, una lama chirurgica numero 11, per rimuovere i dischi dalla testa. Successivamente posizioneremo i dischi su un vetrino con del vector shield come mezzo di montaggio. La prima cosa che faremo è raccogliere alcune larve di terzo stadio e star wandering, larve di terzo stadio e star.

Sto semplicemente usando il mio bastoncino per staccarli delicatamente dal lato del vial. A volte è utile inumidire leggermente il bastoncino, quindi trasferirli in una goccia di PBS. Bene, ora abbiamo qui le nostre larve di terzo stadio.

Essendo destro, girerò la sua testa verso la mia destra e utilizzeremo alcuni punti di riferimento per individuare dove afferrarlo. Il primo è la parte principale della trachea qui e qui. Poi c'è una piccola sezione trasversale più in alto, verso la testa.

Quindi, per prima cosa afferrerò delicatamente le larve a circa due terzi del corpo a partire dalla testa. Poi, con la mano destra, afferrerò alcuni millimetri dietro la traversa qui, cercando di raggiungere circa metà della larghezza della larva. Questa è un'ottima presa.

Si può notare che sono circa a metà. A questo punto tirerò delicatamente in avanti con la mano destra, osservando tutti gli intestini che fuoriescono. Va bene. La parte principale del corpo può ora essere scartata.

E qui abbiamo la testa, che include i dischi immaginali attaccati agli organi boccali. Quindi, prenderò la testa dagli organi boccali in modo da non schiacciare nessuno dei dischi e la sposterò su una nuova goccia di PBS. Ora abbiamo la testa larvale fissata.

Elimineremo tutti i tessuti in eccesso e prenderemo la larva con le pinzette afferrandola dalle bocchette come prima, oppure premendola contro la piastra di dissezione. Le bocchette ora sono a sinistra. Bene, qui abbiamo l'intestino, che non ci interessa, e una ghiandola salivare.

C'è del corpo adiposo o tessuto adiposo. Continuare a rimuoverlo, in particolare il tessuto adiposo, che potrebbe interferire con alcuni saggi e colorazioni di elementi che non si desidera evidenziare. A questo punto abbiamo la testa della larva pulita.

Ora abbiamo le teste larvali, che sono state dissezionate dal corpo, fissate e lavate, con i tessuti estranei rimossi, e sono state trattate con quanto necessario, ad esempio una colorazione con anticorpi nel tunnel C due o un'altra colorazione funzionale. Ora le abbiamo posizionate su un vetrino ed siamo pronti a dissezionare i dischi effettivi dalla testa. Le parti boccali.

Ok, questa volta le parti della bocca si trovano qui a sinistra. Prenderò la mia pinzetta e la premerò semplicemente contro il vetrino. Con la mano destra ho una lama di bisturi numero 11, uno strumento leggermente più fine, che userò per la dissezione.

Quindi, per prima cosa rimuoverò il sistema nervoso centrale e i lobi ottici. Come si può vedere, ecco il sistema nervoso centrale, i due lobi ottici e qui i dischi oculari antennali attaccati a questi ultimi. Se rimuovo il sistema nervoso centrale inserendo la lama tra i lobi ottici e i dischi oculari e tirando lentamente, i dischi oculari si allungano in questo modo.

Ok, quindi abbiamo il sistema nervoso centrale e i lobi ottici. Ora abbiamo i due dischi oculari, che sono stati staccati dal sistema nervoso centrale. Ora li allontanerò dalle parti boccali semplicemente tagliando delicatamente e tirando alla base.

Ok, quindi c'è un disco dell'occhio anteriore, l'altro è il disco dell'occhio posteriore. Ok. E ora possiamo vedere il disco alare che sporge qui. Vado nuovamente a individuare delicatamente il taglio alla base e a tirare.

Quindi qui abbiamo un disco alare e un disco del disco legato ad esso, insieme a un po' di trachea. Ok, quindi c'è il vostro disco alare con un disco della zampa attaccato, e chiaramente ci sono diversi dischi della zampa. Possiamo, possiamo cercare un po' qui intorno e trovare altri dischi semplicemente esplorando delicatamente con la lama.

Sono tutti i dischi che troveremo in questo campione. Ci sono ancora un paio di dischi delle zampe.