Name: Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Impara a purificare i mitocondri da cellule di lievito Saccharomyces cerevisiae con questo protocollo rapido. Il metodo utilizza omogenizzazione e gradiente di densità di saccarosio per ottenere mitocondri puri e integri per studi bioenergetici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal CIHR e la NSERC del Canada. VIT è un investigatore CIHR New Research Chair e Concordia University di Genomica, Biologia Cellulare e invecchiamento.

Materiali e metodi Ceppi di lievito e le condizioni di crescita Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto &quot;fiasco volume / medio volume&quot; di 5:1. Isolamento del greggio frazione mitocondriale <ol><li> Crescere 1 L di wild-type cultura ceppo BY4742 per 48 h. </li><li> Versare la cultura in 500 ml provette Nalgene. Bilanciare il carico e le cellule raccolto per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Determinare peso fresco di pellet. </li><li> Risospendere le cellule in un tampone di pellet DTT [2 ml di tampone / g (peso fresco) cellule]. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare a 50 ml, tubi di plastica Falcon. </li><li> Ruotare le provette a 70 rpm in uno shaker per 20 minuti a 30 ° C. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule]. </li><li> Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule]. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare in un pallone di vetro. </li><li> Aggiungere la polvere di Zymolyase-100T [1 mg di Zymolyase-100T / g (peso fresco), le cellule] alla sospensione cellulare. </li><li> Ruotare il pallone con sospensione cellulare a 70 giri in uno shaker per 30 minuti a 30 ° C. </li><li> Sferoplasti trasferimento formata a causa della digestione della parete cellulare con Zymolyase-100T in provette di plastica da 50 ml centrifuga. </li><li> Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C. </li></ol> ** Tutti i passi successivi devono essere effettuate a 4 ° C o in ghiaccio. Sospensioni di sferoplasti devono essere trattati con delicatezza usando pipette con punte tagliate per evitare di rompere organelli .** <ol start="18"><li> Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule]. </li><li> Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C. </li><li> Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule]. </li><li> Trasferimento alle cellule di un pre-raffreddata in ghiaccio vetro omogeneizzatore. </li><li> Utilizzando un pestello stretto, omogeneizzare le cellule facendo 15 colpi di pestello. </li><li> Aggiungere 1 volume di ghiaccio, freddo buffer di omogeneizzazione. </li><li> Trasferimento sferoplasti omogeneizzato in provette di plastica da 50 ml centrifuga. </li><li> Pellet di cellule ininterrotta, nuclei e detriti di grandi dimensioni per centrifugazione per 5 min a 1500 xga 4 ° C. </li><li> Centrifugare il surnatante risultante per 5 min a 3000 xga 4 ° C. </li><li> Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule]. </li><li> Centrifugare per 5 min a 3000 xga 4 ° C. </li><li> Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di ghiacciata tampone SEM. </li></ol> ** Anche se questa sospensione è arricchita nei mitocondri, organelli contiene anche altri come il reticolo endoplasmatico (microsomi), Golgi, e vacuoli. Per ottenere i mitocondri pura, questa frazione greggio mitocondriale può essere sottoposto a ulteriore frazionamento, come descritto di seguito .** Purificazione di mitocondri privi di contaminazione da parte di altri organuli <ol><li> Mettere 1,5 ml di ghiacciata 60% (w / v) di saccarosio nel tampone EM in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman. </li><li> Sovrapposizione del 60% (w / v) con 4 ml di saccarosio del 32%, 1,5 ml del 23%, 1,5 ml di 15% di saccarosio (tutti p / v in tampone EM). </li><li> Mettere 3 ml della frazione mitocondriale greggio in SEM tampone sulla parte superiore del 15% (w / v) di saccarosio. </li><li> Centrifuga in un SW41 Beckman Ti oscillante-rotore per 1 ora a 134000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C. </li><li> La forma mitocondri intatti una fascia marrone al 60% / interfaccia di saccarosio 32%. </li><li> Rimuovere con attenzione saccarosio fino a raggiungere la band mitocondriale. </li><li> Rimuovere la banda mitocondriale usando una pipetta con la punta tagliata e metterla in una provetta da centrifuga di un rotore Beckman-5 MLS. </li><li> Riempire il tubo con tampone SEM. </li><li> Pellet i mitocondri puro per centrifugazione in un MLS-5 rotore per 30 minuti a 10000 xg (31000 rpm) per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante utilizzandouna pipetta. </li><li> Utilizzare i mitocondri pura per l&#39;analisi delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale. </li></ol> Reagenti <ol><li> DTT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitolo] (per 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml di buffer di 1 M Tris/H2SO4 (pH 9,4) </li><li> 150 ml di 1 M DTT </li><li> Il volume a 15 ml </li></ul></li><li> Zymolyase tampone [20 mM di potassio fosfato (pH 7,4), sorbitolo 1,2 M] (per 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,4) </li><li> 60 ml di 2 M sorbitolo </li><li> Il volume a 100 ml </li></ul></li><li> Buffer di omogeneizzazione [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitolo, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v) di BSA] (per 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml di 1 M Tris / HCl (pH 7,4) </li><li> 75 ml di 2 M sorbitolo </li><li> 500 microlitri di 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g di BSA </li><li> Il volume a 250 ml </li></ul></li><li> SEM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM saccarosio, 1 mM EDTA] (per 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml di 2 M saccarosio </li><li> 500 microlitri di 500 mM EDTA </li><li> Il volume a 250 ml </li></ul></li><li> EM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (per 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2) </li><li> 500 microlitri di 500 mM EDTA </li><li> Il volume a 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Questo metodo consente ad alto rendimento puro isolamento dei mitocondri da cellule di lievito. I mitocondri purificati con questo metodo sono essenzialmente priva di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione. I rendimenti metodo descritto mitocondri che sono adatti per cell-free ricostituzione di processi essenziali mitocondriale. Questi mitocondri elevata purezza può essere utilizzato anche per l&#39;analisi della struttura e delle funz...

purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

I mitocondri sono la sede principale della produzione di ATP durante il metabolismo aerobico in eucarioti fotosintetici non-cellule<sup&gt; 1</sup&gt;. Questi organelli complessi giocano un ruolo essenziale anche nella morte cellulare per apoptosi<sup&gt; 2</sup&gt;, Cellula di sopravvivenza<sup&gt; 3</sup&gt;, Lo sviluppo dei mammiferi<sup&gt; 4</sup&gt;, Lo sviluppo e la funzione neuronale<sup&gt; 4</sup&gt;, Di segnalazione intracellulare<sup&gt; 5</sup&gt;, E la longevità regolamento<sup&gt; 6</sup&gt;. La nostra comprensione di questi complessi processi biologici controllati dai mitocondri si basa su metodi affidabili per valutare la loro morfologia, la loro composizione proteica e lipidica, l&#39;integrità del loro DNA, e le loro numerose funzioni vitali. Il lievito in erba<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Un organismo geneticamente e biochimicamente eucarioti unicellulari manipolabili con genoma annotati e ben definite proteoma, è un modello valido per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base essenziali funzioni biologiche dei mitocondri. Per questi tipi di studi, è fondamentale avere mitocondri altamente puro. Presentiamo qui una descrizione dettagliata di un metodo rapido ed efficace per la depurazione di lievito mitocondri. Questo metodo consente l&#39;isolamento di mitocondri altamente puri, che sono essenzialmente priva di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione. I mitocondri purificati con questo metodo sono adatti per cell-free ricostituzione di processi essenziali mitocondriale e può essere utilizzato per l&#39;analisi della struttura e delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale.

Descriviamo un metodo rapido ed efficace per la purificazione dei mitocondri dal lievito<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Questo metodo consente ad alto rendimento puro isolamento di mitocondri che sono essenzialmente privo di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

I mitocondri sono il sito principale della produzione di ATP durante il metabolismo aerobico nelle cellule eucariotiche non fotosintetiche1. Questi organelli complessi svolgono inoltre...

Questo protocollo inizia convertendo le cellule di lievito in sferoplasti digerendo la parete cellulare con lisasi solubile; i sferoplasti vengono quindi omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore in vetro e teflon. L'omogeneato risultante viene sottoposto due volte a centrifugazione, per formare un pellet di cellule non rotte, nuclei e detriti di grandi dimensioni. Successivamente, il sopranatante ottenuto viene centrifugato per 15 minuti a 12.000 ×g per sedimentare i mitocondri.Infine, la frazione mitocondriale grezza, che contiene ancora altri organelli, viene sottoposta a centrifugazione per 60 minuti a 134.000 G in un gradiente di densità di saccarosio; i mitocondri puri, privi di contaminazione da altri organelli, si recuperano all'interfaccia tra il saccarosio al 60% peso/volume e quello al 32% peso/volume. Ciao, sono il dottor Christopher Greg del laboratorio del dottor Vladimir Tko del dipartimento di biologia della Concordia University. Oggi vi mostrerò come isolare i mitocondri dal lievito Scro mysia.Lo facciamo per studiare la dinamica e i cambiamenti legati all'età che avvengono nei mitocondri. Con l'invecchiamento delle cellule, analizzeremo le variazioni nel proteoma, nei lipidi e nel DNA mitocondriale. Cominciamo dunque.Iniziare questo protocollo coltivando il ceppo di lievito in dieci fiasche da duecentocinquanta millilitri, ciascuna contenente 50 millilitri di mezzo YP, a 30 gradi Celsius con agitazione rotatoria per 48 ore. Successivamente, versare la coltura in provette da centrifuga Nalgene da 500 millilitri.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 3000 G a temperatura ambiente, decantare il soprannatante e risospendere le cellule pellettizzate in 250 millilitri di acqua distillata; centrifugare le cellule per cinque minuti a 3000 G a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio: risospendere le cellule pellettizzate in 250 millilitri di acqua distillata e centrifugare per cinque minuti.A 3000 G a temperatura ambiente, pesare il pellet cellulare umido ottenuto, quindi risospendere le cellule in pellet nel buffer DTT e trasferire la sospensione cellulare in un matraccio da 250 millilitri. Ruotare il matraccio a 70 giri al minuto a 30 gradi Celsius per 20 minuti. Trascorsi i 20 minuti, raccogliere le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 3000 G a temperatura ambiente, risospendere le cellule in pellet nel buffer Xs senza Xs e centrifugare per cinque minuti.A 3000 G a temperatura ambiente, risospendere le cellule in pellet nel buffer Zy senza Xs e trasferire la sospensione cellulare in un matraccio di vetro. Aggiungere alla sospensione cellulare la polvere di zy liasi 100 T e ruotare a 70 giri al minuto in un agitatore a 30 gradi Celsius per 30 minuti; la zy liasi 100 T digerirà le pareti cellulari per formare Sphero plats. Tutti i passaggi successivi alla digestione di X precedentemente mostrata devono essere eseguiti a quattro gradi Celsius o su ghiaccio.Le sospensioni di splat devono essere maneggiate delicatamente utilizzando pipette con punte tagliate per evitare la rottura degli organelli. Al termine della digestione XMO di 30 minuti, trasferire gli splat Sphero in provette centrifughe di plastica da 50 millilitri, centrifugare per otto minuti a 2200 G a quattro gradi Celsius, risospendere gli splat S pelletizzati nel buffer di omogeneizzazione freddo di ghiaccio e centrifugare nuovamente gli splat S per otto minuti a 2200 G a quattro gradi Celsius.Risospendere il pellet di sferoplasti in ghiaccio. Aggiungere il tampone di omogeneizzazione freddo e trasferire le cellule in un omogeneizzatore di vetro preraffreddato. Utilizzando una pistillo adatto, omogeneizzare le cellule eseguendo 15 movimenti completi del pistillo.Aggiungere un volume equivalente di tampone di omogeneizzazione freddo di ghiaccio ai campioni omogeneizzati di S splats e trasferirli in provette di centrifuga di plastica da 50 millilitri. Centrifugare i campioni omogeneizzati per cinque minuti a 1500 G a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet di cellule non rotte, nuclei e detriti grandi. Versare il sopranatante risultante in nuove provette e centrifugare per cinque minuti.A 3000 G a quattro gradi Celsius. Dopo tale centrifugazione, centrifugare il sopranatante risultante per 15 minuti a 12.000 G a quattro gradi Celsius, decantare il sopranatante e risospendere il pellet in tampone di omogeneizzazione freddo su ghiaccio.Centrifugare il pellet risospeso per cinque minuti a 3000 G a quattro gradi Celsius. Infine, centrifugare il sopranatante ottenuto per 15 minuti a 12.000 G a quattro gradi Celsius, decantare il sopranatante e risospendere il pellet in tre millilitri di soluzione fredda di ghiaccio.Tampone SEM. Questa sospensione costituisce la frazione mitocondriale grezza. Sebbene sia arricchita in mitocondri, contiene anche altri organelli come il reticolo endoplasmatico o i microsomi GOGI e VAs per ottenere mitocondri puri.La sospensione sarà sottoposta a ulteriore frazionamento come descritto nella prossima sezione. Per iniziare il frazionamento della sospensione mitocondriale grezza al fine di ottenere mitocondri puri, aggiungere 1,5 millilitri di saccarosio al 60% peso/volume, freddo in ghiaccio, in tampone em in un tubo da centrifuga Beckman UltraClear.Successivamente, sovrapporre delicatamente ai 60% di saccarosio quattro millilitri di saccarosio al 32%, 1,5 millilitri di saccarosio al 23% e 1,5 millilitri di saccarosio al 15%, tutti in peso per volume in tampone EM. Posizionare tre millilitri della frazione mitocondriale grezza in tampone EM sopra il saccarosio al 15% in peso per volume. Centrifugare in un rotore a cestelli oscillanti Beckman SW 41 TI per un'ora a 134.000 ×g o a 33.000 giri al minuto a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, i mitocondri integri formeranno una banda marrone all'interfaccia tra il 60% e il 32% di saccarosio. Rimuovere con attenzione il saccarosio fino a raggiungere la banda mitocondriale utilizzando una pipetta con la punta tagliata, prelevare la banda mitocondriale e trasferirla in un tubo da centrifuga Beckman. Per un rotore MLS cinque, riempire il tubo con buffer SEM, pellettizzare i mitocondri puri mediante centrifugazione in un rotore MLS cinque a 10.000 ×g o 31.000 giri al minuto per 30 minuti a quattro gradi Celsius, quindi decantare il soprannatante.Questi mitocondri puri possono ora essere utilizzati per l'analisi delle funzioni mitocondriali, del proteoma mitocondriale e del DNA mitocondriale. La frazione mitocondriale grezza nei pozzetti di sinistra e i mitocondri purificati mediante centrifugazione in un gradiente di densità di saccarosio nei pozzetti di destra sono stati sottoposti a elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting con anticorpi contro marcatori proteici di diverse organelle. La presenza di mitocondri in entrambe le preparazioni è stata confermata da immunoreattività verso PO1P e COX1P; l'immunoblotting ha inoltre indicato la presenza di DPM1P, FO13P e VPS10P, che rappresentano rispettivamente proteine del reticolo endoplasmatico, lisosomiali e del complesso di Golgi, nella frazione mitocondriale grezza.Al contrario, queste proteine marcatrici non sono state rilevate nei mitocondri purificati, confermando che il protocollo ha prodotto mitocondri privi di contaminazione da altre organelle. Abbiamo quindi appena mostrato come isolare i mitocondri dal lievito sace visier. Ricordatevi soltanto, quando eseguirete questo esperimento, di non lasciare le cellule in incubazione in zy lies 100 T per più di mezz'ora, perché rischiereste di degradare le proteine di membrana o le proteine organellari eventualmente presenti nelle cellule.Questo potrebbe essere dovuto alla presenza di proteasi nel reagente. Inoltre, quando si sta per isolare i mitocondri e il gradiente di saccarosio, è possibile congelare questi mitocondri a meno 20 gradi prima di procedere, per poi scongelarli quando si è pronti per eseguire effettivamente il passaggio di centrifugazione. Questo è tutto.In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

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Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

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Impara a purificare i mitocondri da cellule di lievito Saccharomyces cerevisiae con questo protocollo rapido. Il metodo utilizza omogenizzazione e gradiente di densità di saccarosio per ottenere mitocondri puri e integri per studi bioenergetici.

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