Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

In questo video, illustreremo l'efficacia di un protocollo di colorazione kumasi modificato per rilevare alcune nanogrammi di proteina in gel di poli acrilamide. Utilizzando come esempio l'elettroforesi su gel bidimensionale prima della separazione nella prima dimensione. Le strisce con gradiente di pH immobilizzato vengono riidratate in condizioni di tampone denaturante.

Dopo il rigonfiamento notturno delle strisce, i campioni proteici vengono caricati mediante il metodo a coppa anodica. Durante il processo di focalizzazione, le proteine vengono separate in base ai loro punti isoelettrici. La separazione nella seconda dimensione viene effettuata mediante elettroforesi SDS-PAGE.

Il gel viene quindi trasferito in una vaschetta per la colorazione e le proteine vengono rilevate mediante colorazione con kumasi colloidale. Salve, sono Nadine de Bala del laboratorio di Sabina Meka presso il centro di ricerca biomedica dell'Università di Olor. Oggi vi illustrerò un procedimento poco conosciuto descritto dai colleghi Kangan: il Cy Brilliant Blue è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione delle proteine dopo separazioni elettroforetiche, ma spesso si ritiene che sia meno adatto alla proteomica comparativa.

Tuttavia, la colorazione colloidale presenta vantaggi superiori in termini di sensibilità, costi e praticità. Utilizziamo il protocollo di colorazione K nel nostro laboratorio per quasi tutte le applicazioni basate su gel, ma in particolare in proteomica analitica per determinare le variazioni nell'espressione delle proteine miocardiche. Illustrerò l'uso di questo metodo per rilevare proteine miocardiche nel range di pH alcalino dei gel di elettroforesi bidimensionale.

Quindi cominciamo. Ecco fatto. La prima dimensione dell'elettroforesi su gel bidimensionale è la focalizzazione isoelettrica o IEF e per questa analisi si utilizzano strisce con gradiente di pH immobilizzato o strisce IPG.

Prima dell'IEF, quattro strisce IPG vengono ricongelate singolarmente in 125 microlitri di soluzione di ricongelazione utilizzando il vassoio per il rigonfiamento delle strisce secche IM Mobilly per almeno 10 ore, periodo dopo il quale le strisce IPG sono ricongelate e pronte per l'applicazione del campione proteico. I campioni proteici precipitati con TCA provenienti da quattro diverse preparazioni cardiache vengono sciolti nel buffer per campioni IEF fino a una concentrazione di 100 microgrammi di proteina per 100 microlitri. La solubilizzazione dei campioni proteici richiederà almeno 30 minuti a temperatura ambiente su vortex.

Nel frattempo, preparare i componenti aggiuntivi del kit IM Molene dry strip per eseguire l'IEF nell'unità elettroforetica multi four. Impostare innanzitutto la temperatura dell'unità di raffreddamento a 20 gradi Celsius, pipettare tre o quattro millilitri di fluido di copertura sulla piastra di raffreddamento e posizionare il vassoio Immobilien dry strip su di essa con la connessione dell'elettrodo rosso rivolta verso l'anodo. Versare circa 10 millilitri di olio di copertura nel vassoio Immobilien dry strip e posizionare l'allineatore Immobilien dry strip con la scanalatura rivolta verso l'alto sul vassoio ricoperto di olio.

Successivamente, rimuovere la striscia reidratata dal vassoio di rigonfiamento e trasferirla, con il lato del gel rivolto verso l'alto, nelle scanalature dell'allineatore. L'estremità acida della striscia deve essere orientata verso l'anodo. Alla fine, tutte le strisce devono essere allineate con i bordi anodici.

Posizionare lateralmente sulle estremità dei listelli di gel dei listelli elettrodi saturati con acqua distillata, assicurandosi che i listelli elettrodi entrino almeno parzialmente in contatto con la superficie del gel. Infine, posizionare gli elettrodi sui listelli elettrodi in modo che il segno colorato sia rivolto verso il corrispondente contatto elettronico. Posizionare la barra dei bicchierini campione vicino all'anodo sulla vaschetta per listelli secchi immobilien e collocare un bicchierino sopra ciascun listello IPG.

Premere delicatamente i campioni verso il basso per assicurare un buon contatto con la striscia IPG. Versare da 70 a 80 millilitri di olio per copertura nel vassoio in modo da ricoprire le strisce IPG. Nessun olio deve fuoriuscire nei campioni.

Se l'olio fuoriesce nel bicchiere, rimuoverlo con una pipetta e regolare nuovamente i bicchieri. Infine, aggiungere circa 150 millilitri di olio di copertura per ricoprire completamente i bicchieri del campione. A questo punto, applicare i campioni proteici nei bicchieri del campione pipettandoli al di sotto della superficie del liquido di copertura.

Il volume della coppetta è di 100 microlitri. Dopo aver applicato tutti i campioni proteici, collegare tutti i cavi. Collegare l'unità multi-quattro all'alimentatore elettroforico ed eseguire la focalizzazione isoelettrica per 11,1 kilovoltora in modalità gradiente. Al termine della IEF, le strisce IPG vengono posizionate su un vassoio con il lato del gel rivolto verso l'alto e sottoposte a riduzione e alchilazione durante l'equilibrazione.

Per la riduzione, utilizzare 2,5 millilitri di soluzione di equilibrazione 1% DI tre et all per striscia. Successivamente, agitare per 15 minuti e quindi sostituire completamente la soluzione di DTT e alchilare le strisce in soluzione di equilibrazione con iodoacetamide al 2,5%, agitando per altri 15 minuti. Risciacquare le strisce equilibrate una volta in un becher pieno d'acqua e tamponarle sulla carta da filtro per rimuovere l'eccesso di tampone di equilibrazione.

Successivamente, trasferire le strisce in un buffer di corsa XSDS. Le proteine nelle strisce sono ora pronte per la seconda dimensione dell'elettroforesi bidimensionale. La seconda dimensione viene eseguita mediante SDS-PAGE su un sistema elettroforetico verticale.

Un numero appropriato di gel di acrilamide al 12% spessi un millimetro viene preparato un giorno prima dell'uso e conservato coperto con carta bagnata. A temperatura ambiente, le strisce IPG equilibrate vengono posizionate sulla parte superiore dei gel di separazione e fissate con soluzione calda di agarosio; le proteine vengono quindi separate per 2,5 ore, partendo da 80 volt per 15 minuti, seguiti da 120 volt fino a quando il fronte colorante raggiunge il fondo della cassetta del gel.

Mentre le proteine vengono separate mediante elettroforesi SDS-PAGE, preparare le soluzioni per la colorazione colloidale con Kumasi sul gel. Quando si prepara la soluzione di colorazione, è molto importante mantenere l'aggiunta sequenziale dei componenti nel seguente ordine. Prima, sciogliere 100 grammi di solfato di alluminio e circa 1,5 litri di acqua milliQ in un becher e mescolare. Dopo che il solfato di alluminio è completamente sciolto, aggiungere 200 millilitri di etanolo e quindi 0,4 grammi di CBG 250 alla soluzione.

Non appena il CBB G due 50 è completamente disciolto, aggiungere 47 millilitri di acido orto fosforico. Questo passaggio permette alle molecole di kamasi di aggregarsi nel loro stato colloidale. Infine, aggiungere acqua milli Q fino a un volume finale di due litri.

La soluzione finale in sospensione conterrà particelle che nuotano all'interno. Non filtrare questa soluzione. La soluzione di colorazione può anche essere preparata in anticipo e conservata al buio fino all'uso.

Al termine dell'elettroforesi su gel SDS, rimuovere con attenzione il gel dalle lastre di vetro e trasferirlo in una vaschetta contenente acqua Milli Q. Posizionare la vaschetta con il gel su un agitatore orizzontale e agitare per 10 minuti.

Ripetere il lavaggio altre due volte per circa cinque-dieci minuti. Con acqua milli-Q fresca, è importante lavare accuratamente il gel perché l'SDS residuo sul gel può interferire con il legame del colorante alle proteine e causare una scarsa sensibilità. Al termine del terzo lavaggio, versare via l'acqua dalla piastra.

Il gel è ora pronto per essere colorato. Agitare prima la soluzione Kumasi per disperdere uniformemente le particelle colloidali. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di soluzione per coprire il gel.

Posizionare la piastra con la soluzione di Kumasi coperta. Far gelare su un agitatore e agitare da due a dodici ore. Dopo 10 minuti, si vedranno apparire le prime macchie proteiche.

L'80-100% della colorazione può essere ottenuto entro due ore di incubazione. Tuttavia, si raccomanda un'incubazione notturna per raggiungere una colorazione prossima al 100%. Al termine della colorazione, rimuovere la soluzione di Kamasi e lavare il gel due volte con acqua Milli Q.

Dopo aver lavato il gel, rimuovere le particelle di colorante residue dalla vaschetta di colorazione utilizzando un panno senza pelucchi. Aggiungere la soluzione di decolorazione al gel e lasciare in incubazione da 10 a 60 minuti sullo shaker. Infine, lavare il gel due volte con acqua Milli Q.

Il gel riacquisterà il suo spessore originale e l'intensità del colore della colorazione kumasi sarà inoltre potenziata. Seguendo questo protocollo, il tuo gel 2D dovrebbe presentare una risoluzione netta e una colorazione uniforme con macchie proteiche di colore blu scuro. Il risultato della nostra colorazione kumasi dei gel 2D è paragonabile a quello della colorazione argentica.

Secondo il protocollo di Chef Chenko et al., riportato come altamente sensibile e compatibile con la spettrometria di massa. Utilizzando l'esempio dell'elettroforesi su gel bidimensionale, abbiamo appena mostrato quanto sia rapida, semplice e sensibile la colorazione kangs cooma. La rivelazione delle proteine in gel di poliacrilammide con questa colorazione può essere completata entro due ore.

La procedura in sé richiede poco lavoro. E, non da ultimo, potreste essere in grado di rilevare anche solo un nanogrammo di proteina. Questo protocollo è quindi sicuramente un'ottima alternativa ai metodi di etichettatura utilizzati nella proteomica basata su gel.

Quando si utilizza la procedura di mantenimento, è importante ricordare di usare reagenti di grado analitico e acqua della massima purezza. Inoltre, l'aggiunta sequenziale dei componenti alla soluzione di colorazione rappresenta una fase critica nella preparazione. Infine, non dimenticare di lavare accuratamente i residui di SDES dai gel dopo la separazione elettroforetica.

Altrimenti, non vedrete nulla sui vostri gel. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.