Name: Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine in gel di poliacrilammide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Scopri la colorazione colloidale Coomassie G-250 per rilevare nanogrammi di proteine in gel di poliacrilammide. Questo metodo rapido e sensibile migliora l'efficienza nella proteomica basata su gel.

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Ringraziamo il Dott. Nicola Wiethölter per la preparazione e colorazione di 1-D gel. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND e SM) e sostenuto da una borsa di ricerca dal Manchot Jürgen Stiftung di ND.

Parte 1: bidimensionale (2-D), elettroforesi su gel con coppa di carico <ol><li> IPG-strip reidratazione e concentrandosi isoelettrico (IEF) <ul><li> Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) in 125 microlitri soluzione di reidratazione [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] usa il cassetto Immobiline DryStrip Reswelling per almeno 10 ore. </li><li> Sciogliere campione precipitato proteine ​​in un tampone campione IEF [7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide mM e 2% IPG tampone pH 6-11] corrispondente a 60-100 mg di proteine ​​per 100 l . </li><li> Dopo solubilizzazione (almeno 30 minuti a temperatura ambiente), si applicano campione di proteine ​​tramite anodica coppa carico con coppe campioni. Il volume della tazza è 100 l (tazze Collettore permette fino a 150 microlitri). Nota: è possibile caricare quantità di campione più grande se si inserisce una bassa tensione passo all&#39;inizio del protocollo di messa a fuoco e riempire le tazze mentre c&#39;è ancora un film liquido nella tazza! </li><li> Eseguire isoelettrofocusing per 11,1 KVH in modalità gradiente nell&#39;Unità Multiphor elettroforesi II. </li></ul></li><li> Equilibrazione e SDS-PAGE <ul><li> Dopo IEF, le strisce IPG sono stati sottoposti a riduzione e alchilazione, ogni volta 15 minuti su uno shaker, con l&#39;1% e al 2,5% ditiotreitolo Iodoacetamide rispettivamente in soluzione di equilibrio [50 mM Tris-HCl/pH 8.8, 6 M urea, 30% glicerolo e il 2% SDS]. </li><li> Lavare le strisce equilibrata con H 2 O e asciugare su carta Whatman loro di rimuovere il tampone in eccesso equilibrio. Successivamente immergere le strisce in SDS-running buffer (1X). </li><li> Seconda dimensione è effettuata mediante SDS-PAGE su sistemi di elettroforesi verticale con una concentrazione di acrilamide totale di 12%. Le strisce IPG equilibrati sono stati collocati sulla parte superiore del gel di separazione e fissato con una soluzione calda agarosio [0,5% di agarosio nella gestione di tampone contenente bromofenolo blu]. </li><li> Le proteine ​​sono state separate per 2,5 ore, a partire da 80 V per 15 minuti seguito da 120 V fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo della cassetta gel. </li></ul></li></ol> Parte 2: colorazione Coomassie Colloidale con CBB G-250 1. Soluzioni coloranti Nota: per la preparazione delle soluzioni colorazione, usare prodotti chimici di alta qualità come puri per analisi (pa) e di acqua di elevata purezza, come si ottiene da sistemi Millipore (Milli-Q acqua). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie soluzione: </td><td> AD 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> solfato di alluminio (14-18)-idrato </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanolo (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> Acido ortofosforico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Nota: per la preparazione della soluzione colorante, l&#39;aggiunta sequenziale dei componenti nel seguente ordine deve essere mantenuta: <ol><li> prima sciogliere solfato di alluminio in acqua Milli-Q </li><li> successivamente aggiungere etanolo, omogeneizzare e miscelare CBB G-250 alla soluzione </li><li> di recente, la soluzione è completamente sciolto, aggiungere l&#39;acido fosforico (l&#39;incorporazione dell&#39;acido ai media alcolica lascia le molecole si aggregano in Coomassie loro stato colloidale) </li><li> infine si riempiono di acqua Milli-Q </li></ol> Nota: la soluzione finale ha una colorazione verde scuro-bluastro aspetto ed è piena di particelle di nuoto in giro: <ul><li> Non filtrato questa soluzione! </li><li> Se hai cambiato l&#39;ordine di preparazione, si otterrebbe una soluzione più violetto-bluastro che è meno sensibile. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Decolorazione soluzione: </td><td> AD 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanolo (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> Acido ortofosforico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Procedura di colorazione <ul><li> Dopo la separazione seconda dimensione, rimuovere con attenzione i gel dalle lastre di vetro e trasferirli in un piatto colorazione piena di acqua Milli-Q. </li><li> Lavare il gel tre volte con acqua Milli-Q per 10 minuti su un agitatore orizzontale (lavaggio insufficiente provoca scarsa sensibilità perché il restante SDS sul gel disturba la delimitazione del colorante alle proteine). </li><li> Agitare la soluzione di Coomassie prima dell&#39;uso per disperdere le particelle colloidali in modo uniforme. </li><li> Incubare il gel ben coperto con la soluzione di Coomassie di agitazione su un agitatore per 2-12 ore. Questo genera colorazione di fondo marginali in modo da poter osservare i progressi colorazione in mezzo. Nota: dopo 10 minuti si possono vedere macchie di proteine ​​prima apparizione, entro 2 ore di incubazione di circa l&#39;80% colorazione ad essolivello massimo s è stato completato. Per quasi 100 colorazione%, notte di incubazione è raccomandato. In alcuni casi, quando la quantità di proteine ​​ad essere macchiato è enorme e la soluzione si trasforma in un azzurro brillante, un aggiornamento della soluzione di colorazione è necessario. </li><li> Dopo la procedura di colorazione Coomassie rimuovere la soluzione e sciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q. Nota: è possibile riutilizzare la soluzione colorante fino a quando le particelle sono ancora presenti, altrimenti scartare (tenere a mente che il vostro laboratorio può avere norme speciali per lo smaltimento dei rifiuti). </li><li> Rimuovere attaccare le particelle del colorante dal piatto colorazione con un panno privo di tovagliolo di carta e Decolorare per 10 - 60 minuti. Nota: è anche possibile lavare il gel solo con acqua Milli-Q, ma questo si consiglia solo per preparativa gel perché durerà un irregolare, debole film di Coomassie il gel che si presentano durante la procedura di scansione. </li><li> Infine risciacquare il gel due volte con acqua Milli-Q: il gel raggiungeranno il loro spessore originale (l&#39;alcool-acido multimediali rende la contrazione gel) e neutralizzazione in acqua aumenta ulteriormente l&#39;intensità del colore di Coomassie. </li></ul> Parte 3: I risultati rappresentativi Se si segue il protocollo sopra descritto si ottengono sul 2-D gel distintivi risolto e ben colorati macchie scure proteina blu. Anche rispetto ad un 2-D gel colorato con l&#39;argento secondo Shevchenko et al. 5, un protocollo sostenendo buona sensibilità e la compatibilità con la spettrometria di massa, otteniamo risultati della colorazione uguale. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: risultato finale della sperimentazione di cui sopra. Kang Coomassie protocollo (A) esegue con forza come la colorazione argento secondo Shevchenko et al. (B) a individuare le proteine ​​dopo 2-D elettroforesi su gel. Parte 4: Suggerimenti <ul><li> Eseguire alcune colorazioni di prova prima di elaborare i propri campioni. Per motivi inspiegabili abbiamo riportato qualche volta che una proteina di interesse non è stato possibile rilevare con successo anche quando milligrammi sono state applicate. In questo caso si consiglia di preparare alcune serie di diluizioni per testare la sensibilità. </li><li> Se avete a basso contenuto di gel di rilevazione della proteina (s) in generale, il trasferimento senza successo dal accatastamento al gel di separazione durante la SDS-PAGE sarà eventualmente il motivo. È possibile verificare tali proteine ​​adesive dalla colorazione il gel compresa l&#39;area di sovrapposizione. </li><li> Per una rapida verifica dei risultati isoelettrofocusing, è possibile direttamente macchiare la IPG-strip senza alcun ulteriore separazione seconda dimensione. </li><li> Di tanto in tanto girare il gel durante la procedura di colorazione in modo che siano macchiati uniformemente da entrambi i lati (se si mantiene il gel immobile, il colorante si lega solo per una parte del gel). </li><li> Abbiamo sperimentato che lo stoccaggio della soluzione colorante in una bottiglia scura aumenta la sua durata (in bottiglia trasparente fino a 4 mesi). </li><li> Dopo la colorazione e la documentazione è possibile mantenere il gel in frigorifero per diversi anni (se si aggiunge soluzione acida di evitare contaminazioni da funghi). </li><li> Decolorazione di spine gel per un trittico digerire può essere accelerata dal riscaldamento in un riscaldatore blocco. </li></ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

Innovativi o solo un altro protocollo Coomassie? Al momento esistono diversi protocolli per le procedure di colorazione con Coomassie Brilliant Blue. La maggior parte di loro il risultato di modifiche minori o maggiori di uno dei protocolli più comunemente utilizzati dai Neuhoff e colleghi 2. Anche il protocollo di Kang basato sulla formula di Neuhoff. Ma è davvero un&#39;alternativa metodo di colorazione Coomassie per la ricerca proteomica? Noi immagine due questioni principali, ...

<table border="1" ><tr><td> Nome del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Catalogo No. </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Per IEF e SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip gel </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Può essere utilizzato anche 2 anni dopo la data di scadenza. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling Vassoio </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Non pulire con solventi organici. Progettato per 7-18 centimetri IPG-strisce. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Include un vassoio di elettrodi, portaelettrodi, anodo e catodo, allineatore e coppa campioni bar e coppe campioni. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL Alimentazione </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Forniture di tensione fino a 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II elettroforesi Unità </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Elettrodi mobili consentono IEF in strisce IPG di ogni lunghezza (7-24 centimetri IPG strisce) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel sistema Doppia S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel formato. Gel da camera comprende un sistema di raffreddamento. </td></tr><tr><td> Per colloidale Coomassie G-250 colorazione: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> colorazione piatti con coperchi </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Adatto per mini-gel. Sovrapposte a shaker. </td></tr><tr><td> solfato di alluminio-18-idrato </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Abbiamo fatto migliore esperienza con Merck. Appena disponibile in 5 pacchetti kg. </td></tr><tr><td> ortofosforico </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Venduto in bottiglie di vetro. </td></tr></table>

veloce e sensibile colloidale coomassie g-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine ​​separate mediante SDS-PAGE, offrendo una procedura semplice colorazione e quantificazione alto. Inoltre, è completamente compatibile con l&#39;identificazione delle proteine ​​spettrometria di massa. Ma nonostante questi vantaggi, CBB è considerato essere meno sensibile di colorazioni argento o fluorescenza e quindi raramente utilizzato per la rilevazione di proteine ​​in gel analitici approcci basati sulla proteomica. Diversi miglioramenti del protocollo originale Coomassie 1 sono stati fatti per aumentare la sensibilità della CBB. Due importanti modifiche sono state introdotte per migliorare la rilevazione di proteine ​​a bassa abbondanza convertendo le molecole di colorante in particelle colloidali: Nel 1988, Neuhoff e colleghi hanno applicato il 20% metanolo e concentrazioni più elevate di solfato di ammonio nel G-250 CBB soluzione colorante a base 2, e nel 2004 Candiano et al. stabilito Blue Silver con CBB G-250 con acido fosforico in presenza di solfato di ammonio e metanolo 3. Tuttavia, tutte queste modifiche solo permettono una rilevazione di circa 10 proteine ​​ng. Un protocollo ampiamente fameless per la colorazione Coomassie colloidale è stato pubblicato da Kang et al. Nel 2002 dove si è modificato Neuhoff colloidale protocollo di colorazione CBB per quanto riguarda le sostanze complessanti. Invece di solfato di ammonio hanno usato solfato di alluminio e il metanolo è stato sostituito dal 4 etanolo meno tossici. Il romanzo a base di alluminio colorazione in studio Kang ha dimostrato una sensibilità superiore che rileva fino a 1 ng / banda (fosforilasi b) con variazione scarsa sensibilità in funzione delle proteine. In questo studio dimostriamo applicazione del protocollo di Kang per una rapida e sensibile colorazione Coomassie colloidale di proteine ​​per scopi di analisi. Ci illustrerà il protocollo veloce e semplice utilizzando bidimensionali gel eseguita di routine nel nostro gruppo di lavoro.

Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Per la rilevazione di media 4 ng proteine ​​in gel. La colorazione è completata entro 2 ore e senza alcuno sforzo. Noi abitualmente utilizzano il protocollo di Kang per scopi di analisi in gel a base di proteomica.

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

Il blu brillante di Coomassie (CBB) è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione di proteine separate tramite SDS-PAGE, in quanto offre una procedura di colorazione semplice e...

In questo video, illustreremo l'efficacia di un protocollo di colorazione kumasi modificato per rilevare alcune nanogrammi di proteina in gel di poli acrilamide. Utilizzando come esempio l'elettroforesi su gel bidimensionale prima della separazione nella prima dimensione. Le strisce con gradiente di pH immobilizzato vengono riidratate in condizioni di tampone denaturante.Dopo il rigonfiamento notturno delle strisce, i campioni proteici vengono caricati mediante il metodo a coppa anodica. Durante il processo di focalizzazione, le proteine vengono separate in base ai loro punti isoelettrici. La separazione nella seconda dimensione viene effettuata mediante elettroforesi SDS-PAGE.Il gel viene quindi trasferito in una vaschetta per la colorazione e le proteine vengono rilevate mediante colorazione con kumasi colloidale. Salve, sono Nadine de Bala del laboratorio di Sabina Meka presso il centro di ricerca biomedica dell'Università di Olor. Oggi vi illustrerò un procedimento poco conosciuto descritto dai colleghi Kangan: il Cy Brilliant Blue è un colorante comunemente utilizzato per la visualizzazione delle proteine dopo separazioni elettroforetiche, ma spesso si ritiene che sia meno adatto alla proteomica comparativa.Tuttavia, la colorazione colloidale presenta vantaggi superiori in termini di sensibilità, costi e praticità. Utilizziamo il protocollo di colorazione K nel nostro laboratorio per quasi tutte le applicazioni basate su gel, ma in particolare in proteomica analitica per determinare le variazioni nell'espressione delle proteine miocardiche. Illustrerò l'uso di questo metodo per rilevare proteine miocardiche nel range di pH alcalino dei gel di elettroforesi bidimensionale.Quindi cominciamo. Ecco fatto. La prima dimensione dell'elettroforesi su gel bidimensionale è la focalizzazione isoelettrica o IEF e per questa analisi si utilizzano strisce con gradiente di pH immobilizzato o strisce IPG.Prima dell'IEF, quattro strisce IPG vengono ricongelate singolarmente in 125 microlitri di soluzione di ricongelazione utilizzando il vassoio per il rigonfiamento delle strisce secche IM Mobilly per almeno 10 ore, periodo dopo il quale le strisce IPG sono ricongelate e pronte per l'applicazione del campione proteico. I campioni proteici precipitati con TCA provenienti da quattro diverse preparazioni cardiache vengono sciolti nel buffer per campioni IEF fino a una concentrazione di 100 microgrammi di proteina per 100 microlitri. La solubilizzazione dei campioni proteici richiederà almeno 30 minuti a temperatura ambiente su vortex.Nel frattempo, preparare i componenti aggiuntivi del kit IM Molene dry strip per eseguire l'IEF nell'unità elettroforetica multi four. Impostare innanzitutto la temperatura dell'unità di raffreddamento a 20 gradi Celsius, pipettare tre o quattro millilitri di fluido di copertura sulla piastra di raffreddamento e posizionare il vassoio Immobilien dry strip su di essa con la connessione dell'elettrodo rosso rivolta verso l'anodo. Versare circa 10 millilitri di olio di copertura nel vassoio Immobilien dry strip e posizionare l'allineatore Immobilien dry strip con la scanalatura rivolta verso l'alto sul vassoio ricoperto di olio.Successivamente, rimuovere la striscia reidratata dal vassoio di rigonfiamento e trasferirla, con il lato del gel rivolto verso l'alto, nelle scanalature dell'allineatore. L'estremità acida della striscia deve essere orientata verso l'anodo. Alla fine, tutte le strisce devono essere allineate con i bordi anodici. Posizionare lateralmente sulle estremità dei listelli di gel dei listelli elettrodi saturati con acqua distillata, assicurandosi che i listelli elettrodi entrino almeno parzialmente in contatto con la superficie del gel. Infine, posizionare gli elettrodi sui listelli elettrodi in modo che il segno colorato sia rivolto verso il corrispondente contatto elettronico. Posizionare la barra dei bicchierini campione vicino all'anodo sulla vaschetta per listelli secchi immobilien e collocare un bicchierino sopra ciascun listello IPG.Premere delicatamente i campioni verso il basso per assicurare un buon contatto con la striscia IPG. Versare da 70 a 80 millilitri di olio per copertura nel vassoio in modo da ricoprire le strisce IPG. Nessun olio deve fuoriuscire nei campioni.Se l'olio fuoriesce nel bicchiere, rimuoverlo con una pipetta e regolare nuovamente i bicchieri. Infine, aggiungere circa 150 millilitri di olio di copertura per ricoprire completamente i bicchieri del campione. A questo punto, applicare i campioni proteici nei bicchieri del campione pipettandoli al di sotto della superficie del liquido di copertura.Il volume della coppetta è di 100 microlitri. Dopo aver applicato tutti i campioni proteici, collegare tutti i cavi. Collegare l'unità multi-quattro all'alimentatore elettroforico ed eseguire la focalizzazione isoelettrica per 11,1 kilovoltora in modalità gradiente. Al termine della IEF, le strisce IPG vengono posizionate su un vassoio con il lato del gel rivolto verso l'alto e sottoposte a riduzione e alchilazione durante l'equilibrazione.Per la riduzione, utilizzare 2,5 millilitri di soluzione di equilibrazione 1% DI tre et all per striscia. Successivamente, agitare per 15 minuti e quindi sostituire completamente la soluzione di DTT e alchilare le strisce in soluzione di equilibrazione con iodoacetamide al 2,5%, agitando per altri 15 minuti. Risciacquare le strisce equilibrate una volta in un becher pieno d'acqua e tamponarle sulla carta da filtro per rimuovere l'eccesso di tampone di equilibrazione.Successivamente, trasferire le strisce in un buffer di corsa XSDS. Le proteine nelle strisce sono ora pronte per la seconda dimensione dell'elettroforesi bidimensionale. La seconda dimensione viene eseguita mediante SDS-PAGE su un sistema elettroforetico verticale.Un numero appropriato di gel di acrilamide al 12% spessi un millimetro viene preparato un giorno prima dell'uso e conservato coperto con carta bagnata. A temperatura ambiente, le strisce IPG equilibrate vengono posizionate sulla parte superiore dei gel di separazione e fissate con soluzione calda di agarosio; le proteine vengono quindi separate per 2,5 ore, partendo da 80 volt per 15 minuti, seguiti da 120 volt fino a quando il fronte colorante raggiunge il fondo della cassetta del gel.Mentre le proteine vengono separate mediante elettroforesi SDS-PAGE, preparare le soluzioni per la colorazione colloidale con Kumasi sul gel. Quando si prepara la soluzione di colorazione, è molto importante mantenere l'aggiunta sequenziale dei componenti nel seguente ordine. Prima, sciogliere 100 grammi di solfato di alluminio e circa 1,5 litri di acqua milliQ in un becher e mescolare. Dopo che il solfato di alluminio è completamente sciolto, aggiungere 200 millilitri di etanolo e quindi 0,4 grammi di CBG 250 alla soluzione.Non appena il CBB G due 50 è completamente disciolto, aggiungere 47 millilitri di acido orto fosforico. Questo passaggio permette alle molecole di kamasi di aggregarsi nel loro stato colloidale. Infine, aggiungere acqua milli Q fino a un volume finale di due litri.La soluzione finale in sospensione conterrà particelle che nuotano all'interno. Non filtrare questa soluzione. La soluzione di colorazione può anche essere preparata in anticipo e conservata al buio fino all'uso.Al termine dell'elettroforesi su gel SDS, rimuovere con attenzione il gel dalle lastre di vetro e trasferirlo in una vaschetta contenente acqua Milli Q. Posizionare la vaschetta con il gel su un agitatore orizzontale e agitare per 10 minuti.Ripetere il lavaggio altre due volte per circa cinque-dieci minuti. Con acqua milli-Q fresca, è importante lavare accuratamente il gel perché l'SDS residuo sul gel può interferire con il legame del colorante alle proteine e causare una scarsa sensibilità. Al termine del terzo lavaggio, versare via l'acqua dalla piastra.Il gel è ora pronto per essere colorato. Agitare prima la soluzione Kumasi per disperdere uniformemente le particelle colloidali. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di soluzione per coprire il gel.Posizionare la piastra con la soluzione di Kumasi coperta. Far gelare su un agitatore e agitare da due a dodici ore. Dopo 10 minuti, si vedranno apparire le prime macchie proteiche.L'80-100% della colorazione può essere ottenuto entro due ore di incubazione. Tuttavia, si raccomanda un'incubazione notturna per raggiungere una colorazione prossima al 100%. Al termine della colorazione, rimuovere la soluzione di Kamasi e lavare il gel due volte con acqua Milli Q.Dopo aver lavato il gel, rimuovere le particelle di colorante residue dalla vaschetta di colorazione utilizzando un panno senza pelucchi. Aggiungere la soluzione di decolorazione al gel e lasciare in incubazione da 10 a 60 minuti sullo shaker. Infine, lavare il gel due volte con acqua Milli Q.Il gel riacquisterà il suo spessore originale e l'intensità del colore della colorazione kumasi sarà inoltre potenziata. Seguendo questo protocollo, il tuo gel 2D dovrebbe presentare una risoluzione netta e una colorazione uniforme con macchie proteiche di colore blu scuro. Il risultato della nostra colorazione kumasi dei gel 2D è paragonabile a quello della colorazione argentica.Secondo il protocollo di Chef Chenko et al., riportato come altamente sensibile e compatibile con la spettrometria di massa. Utilizzando l'esempio dell'elettroforesi su gel bidimensionale, abbiamo appena mostrato quanto sia rapida, semplice e sensibile la colorazione kangs cooma. La rivelazione delle proteine in gel di poliacrilammide con questa colorazione può essere completata entro due ore.La procedura in sé richiede poco lavoro. E, non da ultimo, potreste essere in grado di rilevare anche solo un nanogrammo di proteina. Questo protocollo è quindi sicuramente un'ottima alternativa ai metodi di etichettatura utilizzati nella proteomica basata su gel.Quando si utilizza la procedura di mantenimento, è importante ricordare di usare reagenti di grado analitico e acqua della massima purezza. Inoltre, l'aggiunta sequenziale dei componenti alla soluzione di colorazione rappresenta una fase critica nella preparazione. Infine, non dimenticare di lavare accuratamente i residui di SDES dai gel dopo la separazione elettroforetica.Altrimenti, non vedrete nulla sui vostri gel. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Dopo la separazione con metodi elettroforetica, le proteine ​​in un gel può essere rilevato da diversi metodi di colorazione. La colorazione delle proteine ​​con Coomassie Blue, colorazione Silver, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sono dimostrate in questo video.

Colorazione proteine ​​in gel

Un protocollo corto per la colorazione delle proteine ​​con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in gel di poliacrilammide è descritto senza l'utilizzo di solventi organici o acido acetico come nelle procedure di colorazione classica con CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

In questo video, dimostriamo un metodo di colorazione dell'argento di gel di poliacrilammide per la visualizzazione della proteina totale utilizzando sonde fluorogeniche.

Colorazione fluorescente dell'argento: una tecnica per visualizzare le proteine totali nei gel di poliacrilammide

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

In questo video, dimostriamo un metodo di elettroforesi su gel bidimensionale che separa singole proteine da una complessa miscela proteica ottenuta da tessuti tumorali di adenoma ipofisario umano non funzionale (NFPA). Le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica nella prima dimensione e ulteriormente separate in base ai pesi molecolari nella seconda dimensione.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell'analisi genetica.

Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag+-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.

Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Per superare i limiti della mutagenesi classica sito-diretta, gli analoghi della prolina con modifiche specifiche sono stati incorporati in diverse proteine fluorescenti. Mostriamo come la sostituzione dell'idrogeno con il fluoro o dei singoli con doppi legami nei residui di prolina ("chirurgia molecolare") influenzi le proprietà fondamentali delle proteine, tra cui il loro ripiegamento e l'interazione con la luce.

Scambio specifico di prolina da parte di analoghi della prolina in proteine fluorescenti: come la "chirurgia molecolare" della spina dorsale influisce sul ripiegamento e sulla stabilità

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Scopri la colorazione colloidale Coomassie G-250 per rilevare nanogrammi di proteine in gel di poliacrilammide. Questo metodo rapido e sensibile migliora l'efficienza nella proteomica basata su gel.

Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine ​​in gel di poliacrilammide

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